專利名稱：高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高速逆流色譜分離制備方法，特別是高純度單體兒茶素(EGCG、GCG、ECG)的逆流色譜分離制備方法。
茶葉中含有多種多酚類物質(zhì)，統(tǒng)稱為茶多酚(tea ployphenols，TP)。其中最為重要的是兒茶素類化合物(catechins)。它們主要有兒茶素(catechin，C)、表兒茶素(epicatechin，EC)、沒食子兒茶素(gallocatechin，GC)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、兒茶素沒食子酸酯(catechin-3-O-gallate，CG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate，ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin-3-O-gallate，GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate，EGCG)。
其結(jié)構(gòu)如下
I II R RC EC H HGC EGC H OHCG ECG G HGCGEGCGG OH
藥理研究表明，茶多酚(主要是兒茶素類)有明顯的清除體內(nèi)自由基，阻斷N-亞硝基化合物的形成，抑制脂氧合酶活性和脂質(zhì)過氧化作用，并有防突變、防癌、防輻射及抗衰老、抗菌、抗病毒等藥理活性。研究還發(fā)現(xiàn)，ECG和EGCG兩種兒茶素不僅對人體愛滋病病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄酶具有很強(qiáng)的抑制作用，而且也是愛滋病毒DNA和RNA的聚合酶類抑制劑。
目前雖然茶多酚已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等諸多領(lǐng)域，但絕大多數(shù)采用的是茶多酚粗品。進(jìn)一步研究茶多酚中各類物質(zhì)尤其是兒茶素類化合物的藥理和活性，對于更好地開發(fā)和利用我國豐富的茶葉資源具有重要意義，這樣對各類化合物的分離制備方法提出了更高的要求。
兒茶素類化合物分離的難度主要來自其結(jié)構(gòu)的特性，由于多個酚羥基的存在，使得其很容易被不可逆吸附在一般的柱色譜填料上而損失，而且由于該類物質(zhì)很不穩(wěn)定，在固體填料上還會發(fā)生降解，因而回收率較差，而且傳統(tǒng)的柱色譜法分離效率低，操作煩瑣。
本發(fā)明的目的是提供一種從茶多酚粗品中分離制備高純度單體兒茶素[表沒食子茶素沒食子兒酸脂(epigallocatechin-3-O-gallate，EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin-3-O-gallate，GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate，ECG)]的方法，該方法分離效率高，操作簡便。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下設(shè)計方案采用高速逆流色譜分離制備方法，它包括制備構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系；使逆流色譜儀柱子中充滿固定相；然后使其主機(jī)轉(zhuǎn)動，再將流動相泵入柱內(nèi)；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測器譜圖接收目標(biāo)成份。所述的溶劑體系主要有兩個一號溶劑體系由三個組分構(gòu)成，A組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯類，B組分可選自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等脂肪醇或脂肪酮，C組分為水。優(yōu)選乙酸乙酯-乙醇-水體系；二號溶劑體系也由三個組分構(gòu)成，A組分可選自正已烷、石油醚、環(huán)已烷等烷烴，B組分可選自乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸正丁酯等脂肪酯類，C組分為水。優(yōu)選正已烷-乙酸乙酯-水體系。
在乙酸乙酯-乙醇-水體系中，它們的用量體積比可在(1-10)∶(0-1)∶10的范圍內(nèi)配制，例如10∶1∶10，20∶1∶20，20∶1∶50，25∶1∶100等；在正已烷-乙酸乙酯-水體系中，它們的用量體積比可在(0-1)∶10∶(10-100)的范圍內(nèi)配制，例如1∶10∶10，1∶10∶50，1∶20∶20，1∶20∶100等。當(dāng)其中的乙醇和正已烷的比例變?yōu)?時，兩個體系就都變?yōu)橐宜嵋阴?水體系。上述體系以上相為固定相、下相為流動相，均可用于從茶多酚粗品中分離EGCG，且經(jīng)過一次分離可以得到EGCG純組分，同時也可以得到GCG和ECG兩個純組分，但是后兩個組分出峰的時間較長，峰形變得較寬。
對于GCG和ECG兩個組分的分離，當(dāng)采用乙酸乙酯-乙醇-水體系時，可以在分離出EGCG后，在原設(shè)定配比的基礎(chǔ)上，逐漸增加下相中乙醇/水的體積比，[此時乙醇/水的體積比可以不在(0-1)∶10的范圍內(nèi)]，即采用梯度洗脫方式，縮短分離時間；也可以在分離出EGCG后，直接改變到一個合適的溶劑配比，也是提高其中乙醇/水體積比[此時乙醇/水的體積比可以不在(0-1)∶10的范圍內(nèi)]，或者改選正已烷-乙酸乙酯-水體系，將未洗脫出的組分作為新的樣品，經(jīng)濃縮后進(jìn)行二次分離，后二種稱為分步分離的方式，同樣可以在較短的時間內(nèi)得到GCG和ECG純組分。
當(dāng)采用正已烷-乙酸乙酯-水體系分離GCG和ECG兩個組分時，只能采用分步分離的方式來縮短分離時間，即在分離出EGCG后，提高上相中正已烷/乙酸乙酯的體積比，如提高到1∶3，1∶4等，將未洗脫出的組分作為新的樣品，經(jīng)濃縮后進(jìn)行二次分離，得到GCG、ECG純組分。
室溫對分離度有一定影響，以上分離條件適合室溫在16-30℃時使用，對于乙酸乙酯-乙醇-水體系，當(dāng)室溫較高時，可降低乙醇/水體積比，以提高分離度，但分離時間會延長；反之亦然。對于正已烷-乙酸乙酯-水體系，當(dāng)室溫較高時，可降低正已烷/乙酸乙酯體積比，可以提高分離度，但分離時間也會相應(yīng)延長；反之亦然。
對于其它非酯型兒茶素的分離要采用乙酸乙酯-正丁醇-水體系。
由于茶多酚的不穩(wěn)定性，在分離和收集目標(biāo)成分的過程中最好采用N2氣保護(hù)。收集到的產(chǎn)品要立即進(jìn)行冷凍干燥，然后置于密閉容器中低溫避光保存。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本方法中采用了高速逆流色譜分離技術(shù)，由于高速逆流色譜是一種連續(xù)的不用固體支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，它克服了由固體支撐體引起的不可逆吸附，使被分離物回收率高，又因為采用了優(yōu)選的溶劑體系，及相應(yīng)工藝條件，可高效地獲得高純度的單體兒茶素(表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG))。本方法適用于從由各種茶多酚粗品中分離制備以上三種兒茶素單體。適用于用多種型號的逆流色譜儀制備兒茶素，例如用分析型高速逆流色譜儀的小量制備以及半制備高速逆流色譜儀的較大量制備。
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1a為乙酸乙酯-乙醇-水(25∶1∶25)體系從茶多酚粗品中制備分離EGCG的逆流色譜1b為以正已烷-乙酸乙酯-水(1∶4∶5)體系，從分離掉EGCG的殘留物中分離制備GCG和ECG的逆流色譜2為以乙酸乙酯-乙醇-水體系梯度洗脫分離EGCG，GCG和ECG的逆流色譜3為以正已烷-乙酸乙酯-水(1∶10∶10)體系分離EGCG、GCG和ECG的逆流色譜圖4為以乙酸乙酯-水體系分離EGCG的逆流色譜圖例1.采用半制備高速逆流色譜儀，選取乙酸乙酯-乙醇-水體系分離制備EGCG(見圖1a)，然后改換正己烷-乙酸乙酯-水體系分離制備GCG和ECG(見圖1b)。
首先以25∶1∶25體積比將上述溶劑體系配制于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，將上相和下相分開，取上相作為固定相，下相作為流動相。
稱取1克茶多酚粗樣溶解于30ml流動相中待用。
采用北京市新技術(shù)研究所研制開發(fā)的GS10A2型半制備高速逆流色譜儀，并配有泵、10-30ml進(jìn)樣閥、紫外檢測器和記錄儀。其多層纏繞聚四氟乙烯管的柱容量約為260ml。
先用固定相充滿整個柱子；調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速800rpm，以2.0ml/min的流速將流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；然后根據(jù)檢測器紫外譜圖，接收目標(biāo)成分。最后經(jīng)冷凍干燥，得到EGCG白色絮狀固體約280mg，其HPLC純度可達(dá)98％左右，其回收率可達(dá)93％(根據(jù)HPLC峰面積百分比計算粗樣中EGCG含量約為300mg)。
然后以1∶4∶5的體積比配制正己烷-乙酸乙酯-水體系，以上相為固定相，下相為流動相。將上述分離掉EGCG后柱中的殘液經(jīng)濃縮后作為樣品進(jìn)樣。進(jìn)行同前操作，最后可分別得到140mg GCG和130mg ECG白色絮狀固體，其HPLC純度均可達(dá)98％左右。
例2.采用分析型逆流色譜儀，選取乙酸乙酯-乙醇-水體系來分離EGCG，然后采用梯度洗脫方式分離GCG和ECG(見圖2)。
首先以分別以25∶1∶25，10∶1∶10，5∶1∶5的體積比配制上述溶劑體系三份于分液漏斗中，搖勻后靜置分層。待平衡一段時間后，分別將上相和下相分開，取上相作為固定相，下相作為流動相。
稱取茶多酚粗樣16mg溶解于1ml流動相中待用。
采用北京市新技術(shù)研究所研制開發(fā)的GS20型分析型高速逆流色譜儀，并配有泵、進(jìn)樣閥、紫外檢測器和記錄儀。其多層纏繞聚四氟乙烯管的柱容量約為35ml。
先用25∶1∶25體系的上相作為固定相充滿整個柱子；調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速1800rpm，以1.0ml/min的流速將該體系的下相作為流動相泵入柱內(nèi)；待整個體系建立動態(tài)平衡后，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；洗脫到圖2所示的p1點(diǎn)時改換10∶1∶10體系的下相洗脫，到p2點(diǎn)時改換5∶1∶5體系的下相洗脫；同時根據(jù)檢測器紫外譜圖，接收目標(biāo)成分。
例3.采用分析型逆流色譜儀，選取正己烷-乙酸乙酯-水體系來分離EGCG，GCG和ECG(見圖3)。
以1∶10∶10的體積比配置上述溶劑體系，進(jìn)行與例2同樣的操作，只是中途不改換溶劑體系。進(jìn)樣量也為16mg。
例4.采用分析型逆流色譜儀，選取乙酸乙酯-水體系來分離EGCG(見圖4)。
以1∶1的體積比配置上述體系，進(jìn)行同例3的分離操作。進(jìn)樣量為17mg。
權(quán)利要求
1.一種高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，它包括配制構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系；使逆流色譜儀柱子中充滿固定相；然后使其主機(jī)轉(zhuǎn)動，再將流動相泵入柱內(nèi)；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測器譜圖接收目標(biāo)成份，其特征在于所述的溶劑體系由脂肪酯，脂肪醇或脂肪酮，水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述的脂肪酯為乙酸乙酯，所述的脂肪醇為乙醇，在乙酸乙酯-乙醇-水體系中，它們的用量體積比為(1-10)∶(0-1)∶10，以上相為固定相，下相為流動相。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述的溶劑體系，當(dāng)分離出EGCG后，分離GCG和GCG時，逐漸增加下相中乙醇/水的體積比，即采用梯度洗脫方式；或改變體系中溶劑配比，即提高下相中乙醇/水體積比；或改用正已烷-乙酸乙酯-水體系，后二種稱為分步分離方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高純度單體兒茶素的逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述的分離EGCG溶劑體系乙酸乙酯-乙醇-水的體積比為20∶1∶20，25∶1∶25，50∶1∶50，分離GCG和ECG體系為正已烷-乙酸乙酯-水，它們的體積比為1∶4∶5或1∶3∶4。
5.一種高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，它包括配制構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系；使逆流色譜儀柱子中充滿固定相；然后使其主機(jī)轉(zhuǎn)動再將流動相泵入柱內(nèi)；由進(jìn)樣閥進(jìn)樣；根據(jù)檢測器譜圖接收目標(biāo)成份，其特征在于所述的溶劑體系由烷烴、脂肪酯、水組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高純度單體兒茶素的逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述的烷烴為正已烷、所述的脂肪酯為乙酸乙酯，在正已烷-乙酸乙酯-水體系中，它們的用量體積比為(0-1)∶10∶(10-100)，以上相為固定相、下相為流動相。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高純度單體兒茶素的逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述的體系，在分離EGCG出后，分離GCG和ECG時，將未洗脫出的組分作為新的樣品，經(jīng)濃縮后進(jìn)行二次分離，其溶劑體系不變，但正已烷/乙酸乙酯的體積比提高。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法，其特征在于分離GCG、ECG時，正已烷/乙酸乙酯的體積比為1∶4或1∶3。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高純度單體兒茶素的逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述在分離和收集目標(biāo)成份過程中采用N2氣保護(hù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高純度單體兒茶素的逆流色譜分離制備方法，其特征在于所述收集到的產(chǎn)品要立即進(jìn)行冷凍干燥，然后置于密閉容器中低溫避光保存。
全文摘要
一種高純度單體兒茶素的高速逆流色譜分離制備方法,它包括配制構(gòu)成固定相、流動相的溶劑體系;使逆流色譜儀柱子中充滿固定相;然后使其主機(jī)轉(zhuǎn)動,再將流動相泵入柱內(nèi);由進(jìn)樣閥進(jìn)樣;根據(jù)檢測器譜圖接收目標(biāo)成分,所用溶劑體系可以是脂肪酯,脂肪醇或脂肪酮,水;或者是烷烴,脂肪酯,水所構(gòu)成的兩相溶劑體系,以上相為固定相,下相為流動相。本方法可獲得高純度單體兒茶素;EGCG、GCG、ECG,純度高達(dá)98%。該方法簡便易行,回收率高,易于推廣使用。
文檔編號B01D15/08GK1277068SQ9910903
公開日2000年12月20日 申請日期1999年6月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月14日
發(fā)明者曹學(xué)麗, 田宇, 張?zhí)煊?申請人:北京市新技術(shù)應(yīng)用研究所