本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體、BANCR慢病毒及構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目的基因過表達(dá)是研究基因功能常用的手段之一。將目的基因通過轉(zhuǎn)染(包括電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等)、顯微注射或病毒感染等方法將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，從而建立目的基因過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究。慢病毒載體可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉(zhuǎn)染效率。慢病毒是一種分子生物學(xué)中對基因功能研究常見的工具質(zhì)粒，能高效轉(zhuǎn)染原核以及真核細(xì)胞，使細(xì)胞能夠合成并且表達(dá)目的基因，通過對比目的基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與否或者表達(dá)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對目的基因在細(xì)胞甚至機(jī)體功能中的作用進(jìn)行驗(yàn)證和分析。因此，慢病毒在研究基因在細(xì)胞及機(jī)體功能中的應(yīng)用極為廣泛。遺傳學(xué)的“中心法則”描述了遺傳信息從DNA通過RNA到相應(yīng)蛋白質(zhì)的信息流途徑。幾十年來，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為DNA是遺傳物質(zhì)的儲存載體，基因要通過其表達(dá)的相應(yīng)蛋白質(zhì)來發(fā)揮作用。隨著人類基因組計(jì)劃的順利完成，人們發(fā)現(xiàn)僅僅一小部分基因?yàn)榈鞍拙幋a基因，而90％以上的人類基因都已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)錄，這表明眾多數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本是不編碼蛋白質(zhì)的，這部分轉(zhuǎn)錄本被稱為“非編碼RNA”(non－codingRNA，ncRNA)。結(jié)構(gòu)ncRNA在蛋白質(zhì)翻譯過程中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA，tRNA)，核糖體RNA(ribosomalRNA，rRNA)，小核RNA(smallnuclearRNA，snRNA)和核仁小RNA(smallnucleolarRNA，snoRNA)；調(diào)節(jié)ncRNA包括小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，微小RNA(microRNA，miRNA)，piwi蛋白相互作用的RNA(piwi－interactingRNAs，piRNAs)和長鏈非編碼(longnoncodingRNA，lncRNA)。lncRNA長度在200個核苷酸以上，大部分lncRNA被視為缺乏蛋白質(zhì)編碼的能力，極小部分lncRNA被證實(shí)可以編碼一些小肽段。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后及代謝等多層面參與蛋白編碼基因和非蛋白編碼基因的表達(dá)調(diào)控。lncRNA在正常細(xì)胞分化、發(fā)育及人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括惡性腫瘤。BRAF活化的非編碼RNA(BRAF－activatednon－proteincodingRNA，BANCR)是一種與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的lncRNA。該基因定位于染色體9q21.11，含4個外顯子，BANCR是來自內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，長約693nt，在BRAFV600E突變的黑色素瘤細(xì)胞及黑色素瘤組織中高表達(dá)。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)BANCR可通過激活ERK1/2和JNKMAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與黑色素瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控，但是BANCR與MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)系尚未完全闡明。此外，研究還發(fā)現(xiàn)BANCR可通過調(diào)控CXCL11基因的表達(dá)參與黑色素瘤細(xì)胞的遷移。鑒于BANCR在惡性黑色素瘤中的表達(dá)具有組織特異性及穩(wěn)定性，可作為潛在的腫瘤診斷和腫瘤靶向治療的生物學(xué)標(biāo)記物。在目前的國內(nèi)外尚未見到BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體及其相關(guān)研究的報(bào)道。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個目的在于提供一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體，以解決BANCR基因研究中所需要的過表達(dá)載體的技術(shù)問題；本發(fā)明的第二個目的在于提供一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建方法，以構(gòu)建BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體；本發(fā)明的第三個目的在于提供一種BANCR慢病毒；本發(fā)明的第四個目的在于提供一種BANCR慢病毒的構(gòu)建方法；本發(fā)明的第五個目的在于提供一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體和/或BANCR慢病毒在制備BANCR基因過表達(dá)細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體，以表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5慢病毒過表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體。本發(fā)明還提供了一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建方法，該方法包括：將利用PCR擴(kuò)增人工合成的BNACR基因插入到基因轉(zhuǎn)移載體中，得到重組連接產(chǎn)物，用重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定，鑒定為陽性且序列無誤的即為構(gòu)建成功的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體。進(jìn)一步地，所述BANCR基因的上下游引物序列分別為：BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQIDNO.2)BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQIDNO.3)。進(jìn)一步地，所述BANCR基因的上下游引物分別設(shè)有NotI和NsiI兩側(cè)同源序列，用于慢病毒載體的亞克隆。進(jìn)一步地，所述插入到基因轉(zhuǎn)移載體中使用的試劑盒為EntryOneStepCloningKit試劑盒。進(jìn)一步地，所述基因轉(zhuǎn)移載體為經(jīng)過NotI和NsiI雙酶切的表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5。本發(fā)明還提供了一種BANCR慢病毒的構(gòu)建方法，使用包裝質(zhì)粒對上述的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體進(jìn)行包裝，通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到BANCR慢病毒。進(jìn)一步地，所述包裝質(zhì)粒為pGag/Pol、pRev和pVSV－G。本發(fā)明還提供了一種BANCR慢病毒，應(yīng)用上述的BANCR慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。本發(fā)明還提供了上述的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體和/或上述的BANCR慢病毒在制備BANCR基因過表達(dá)細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體，以表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5慢病毒過表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，能夠準(zhǔn)確追蹤載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的位置，并且能夠了解不同環(huán)境下BANCR基因的強(qiáng)弱表達(dá)，使BANCR基因研究更直觀。本發(fā)明提供的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建方法，流程簡單，陽性率高。本發(fā)明提供的BANCR慢病毒具備良好的生物安全性，可直接用于感染其他的細(xì)胞株，進(jìn)行體外機(jī)制研究；或者篩選穩(wěn)定株，用于體內(nèi)功能研究。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例2提供的LV5質(zhì)粒的物理圖譜；圖2為本發(fā)明實(shí)施例2提供的已插入BANCR的重組載體圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的PCR擴(kuò)增的目的基因BANCR的測序結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體，以表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5慢病毒過表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，并整合有BANCR基因，得到BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體。BANCR基因?yàn)槿薒ncRNABANCR基因(GeneID：100885775)，基因序列如下(SEQIDNO.1)：ATTCCCTTACTTTCTTAATAAACTCGCTTTCACTTTATGGATTCAACTGTAATTCTTTCTTGTGTGAGATCCAAGAACCTTCTTGTAGGGTCTGGATTGGGACCCTTTTCTGGTAACATCTTCCTGGTGACCATGAAGGGACAATACTGAAGAGACCCCTGACCCTAAGGAAATAGACTGCAGCACCAATGGGCCAACTTTGGGGCGATCATCTTGCCCAGAAACATCATGTTGAAACTCTTGGTCAGAGGTTGGATGAAAGCTGACAGGGTCCATCCAGGAGCAAGTTTGAGCCTTGCCAGTTCCATTTTGGGTGCTGAGTGGAGTGGCGACTATAGCAAACCTGTGATCTCTGGCTGCTGCTCAGAAGAAACAAGAGGGAGGGATGAATAATGTAAAACTCTGGATCAATATTCTAATTCTGAGCCTCTATTGGAATCAGCTAGCAACCACATATCAGCTTGGTTTCAACAGTTTCCCAGTTCATGCTGCTGAGAAGTTCAGAGTCAAACCTGAATCTCACCTCTGCAAAGAGCACAGGACTCCATGGCAAACGTTGTATATACGCAAGTCATCCCTGGCACCACATTGATTTACTGCACCAGGCTTTCTTCATTGTGATGATGTTCTCTCTCTTTTCTAAAAAAAAAATAAAAATAAAATTTAAAAAATCCTAAAAAAAAAAAAALV5載體是基于HIV1構(gòu)建的慢病毒基因過表達(dá)載體，采用EF1a啟動子啟動目的基因的表達(dá)。EF1a啟動子來源于人類靶向延長因子1α(EF1A)基因，可在多種細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。載體中熒光GFP基因具有獨(dú)立的啟動子CMV。既保留了GFP的作用，也避免了融合標(biāo)簽蛋白對目的基因功能產(chǎn)生影響。本發(fā)明提供的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體，以表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5慢病毒過表達(dá)載體為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建，能夠準(zhǔn)確追蹤載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的位置，并且能夠了解不同環(huán)境下BANCR基因的強(qiáng)弱表達(dá)，使BANCR基因研究更直觀。本發(fā)明還提供了一種BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建方法：將利用PCR擴(kuò)增合成的BNACR基因，重組克隆到基因轉(zhuǎn)移載體中，得到重組連接產(chǎn)物，用重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行鑒定，鑒定為陽性且序列無誤的即為構(gòu)建成功的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體。本發(fā)明中，BANCR基因的上下游引物序列分別為：BANCR－F：AGGGTTCCAAGCTTAAGCGGCCGCATTCCCTTACTTTCTTAATAAAC(SEQIDNO.2)BANCR－R：GATCCATCCCTAGGTAGATGCATTTTTTTTTTTTTTAGGATTTTTTA(SEQIDNO.3)。本發(fā)明中，BANCR基因的上下游引物分別設(shè)有NotI和NsiI兩側(cè)同源序列，保護(hù)堿基酶切位點(diǎn)修飾，用于慢病毒載體的亞克隆。將BANCR基因引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)完成后，利用Agarose電泳并切膠回收BANCR基因片段。本發(fā)明中，基因轉(zhuǎn)移載體為經(jīng)過NotI和NsiI雙酶切的表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5。經(jīng)過雙酶切的LV5為線性化載體，將線性化的LV5通過Agarose電泳及DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。本發(fā)明中，重組克隆中使用的試劑盒為EntryOneStepCloningKit試劑盒。本發(fā)明中，用重組連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞為DH5α感受態(tài)細(xì)胞。待細(xì)菌復(fù)蘇后，涂于LB平板上。從培養(yǎng)好的平板上挑取單獨(dú)、飽滿的菌落，培養(yǎng)菌液。將培養(yǎng)好的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化，DP104－02)抽提質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。取陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，與目的基因序列進(jìn)行比對，正確無誤，即構(gòu)建成功BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體。本發(fā)明還提供了一種BANCR慢病毒的構(gòu)建方法，使用包裝質(zhì)粒對上述的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體進(jìn)行包裝，通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到BANCR慢病毒。在本發(fā)明中，BANCR慢病毒的包裝滴度為108。本發(fā)明中，包裝質(zhì)粒為pGag/Pol、pRev和pVSV－G。本發(fā)明還提供了一種BANCR慢病毒，應(yīng)用上述的BANCR慢病毒的構(gòu)建方法構(gòu)建得到。本發(fā)明中，慢病毒表達(dá)系統(tǒng)包含四種質(zhì)粒體系，四種質(zhì)粒體系包括一種轉(zhuǎn)移載體和三種輔助質(zhì)粒，轉(zhuǎn)移載體包含轉(zhuǎn)移目的基因人LncRNABANCR基因等慢病毒骨架及其包裝產(chǎn)生相應(yīng)基因組RNA的所有順式作用元件。慢病毒通過順式作用元件將病毒運(yùn)送入細(xì)胞核，將所要表達(dá)的基因序列重組整合到細(xì)胞的基因組中，從而實(shí)現(xiàn)目的序列持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)；另外，通過三種輔助質(zhì)粒pGag/Pol、pRev和pVSV－G，提供病毒包裝所需的反式作用因子，同時(shí)采用“自我滅活”修飾，阻止子代病毒自我復(fù)制和轉(zhuǎn)移，從而確保產(chǎn)生的慢病毒具備良好的生物安全性。本發(fā)明還提供了上述的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體和/或上述的BANCR慢病毒在制備BANCR基因過表達(dá)細(xì)胞中的應(yīng)用。本發(fā)明中，BANCR基因過表達(dá)細(xì)胞應(yīng)用慢病毒過表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建成功，應(yīng)用于制備BANCR基因過表達(dá)細(xì)胞中，與傳統(tǒng)的電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等物理化學(xué)轉(zhuǎn)染方法相比，除了保證良好的生物安全性，更具高效性和穩(wěn)定性。為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例中所使用的氨基酸均購自上海吉爾公司，實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品，無特殊來源。實(shí)施例1選擇過表達(dá)載體及合成人LncRNABANCR基因全序列選取表達(dá)綠色熒光蛋白的LV5作為過表達(dá)載體，合成人LncRNABANCR基因序列所需的PCR引物通過oligo在線軟件設(shè)計(jì)(http：//www.oligo.net/)，上下游引物分別加上LV5載體上NotI和NsiI兩側(cè)同源序列，用于載體的亞克隆。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。將合成的引物稀釋成50μM后，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：試劑體積(μl)LncRNABANCR模版110×PfuBuffer(+Mg2+)5上游引物BANCR－F1下游引物BANCR－R1dNTP1ddH2O41PfuDNApolymerase0.3循環(huán)條件如下：PCR反應(yīng)完成后，利用Agarose電泳，并切割在瓊脂糖凝膠電泳膠中的目的片段條帶，回收人LncRNABANCR基因片段。實(shí)施例2目的基因人LncRNABANCR克隆到載體LV5中對LV5載體進(jìn)行雙酶切：在無菌的0.2mLEP反應(yīng)管，取LV5載體15μL，用NotI和NsiI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切體系按照說明書配制如下：試劑體積(μl)10×Buffer5DNA15NotI1NsiI1ddH2O28將上述體系混勻后，37℃反應(yīng)2h。此時(shí)，經(jīng)過雙酶切的LV5為線性化載體，將線性化的LV5通過Agarose電泳及DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。利用EntryOneStepCloningKit，將實(shí)施例1中擴(kuò)增回收好的人LncRNABANCR基因片段，重組克隆到線性化的LV5載體中，反應(yīng)體系如下：試劑體積(μl)5×CEEntryBuffer4LV51LncRNABANCR2ExnaseEntry2ddH2O11使用移液器上下吹打上述混合物數(shù)次，輕輕混勻各組分。置于37℃反應(yīng)30min。反應(yīng)完成后立即將反應(yīng)管置于冰水浴中，冷卻5min備用。LV5質(zhì)粒的物理圖譜如圖1所示。已插入BANCR的重組載體如圖2所示，從圖2中可看到BANCR的插入位置。實(shí)施例3重組過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞并鑒定重組連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：將裝有感受態(tài)細(xì)胞DH5α的離心管冰上放置4min，待感受態(tài)細(xì)胞解凍后，加入10μl重組連接產(chǎn)物，輕柔混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，放置90s，不要搖動離心管。快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3min。向每支離心管加入800μlLB培養(yǎng)基(不含抗生素)，然后將離心管轉(zhuǎn)移到37℃搖床，250rpm，培育45min使細(xì)菌復(fù)蘇。取200μl培育后的細(xì)胞均勻涂布于含50μg/mlAmpicillinLB平板上。等平板上液體被吸收后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16h。從培養(yǎng)好的平板上挑取4個單獨(dú)、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlAmpicillin)LB培養(yǎng)基的試管中，將上述試管置于細(xì)菌搖床中培養(yǎng)，37℃，250rpm，培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)好的菌液，用質(zhì)粒小提試劑盒(天根生化，DP104－02)抽提質(zhì)粒，將抽提好的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切37℃，1h后電泳，在目的條帶大小對應(yīng)區(qū)域有酶切得到的條帶對應(yīng)的克隆即為陽性克隆。取200μl陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，并將剩余的菌液用甘油保存。將測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對，正解無誤，顯示重組載體構(gòu)建成功，如圖3所示。此外，用保存的甘油菌液接菌LB培養(yǎng)基，進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，得到足夠量的重組質(zhì)粒。實(shí)施例4慢病毒包裝、收集及滴度檢測病毒包裝：將對數(shù)生長期的293T細(xì)胞接種至15cm培養(yǎng)皿，加入18ml含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，混勻后置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，在一支無菌的5ml離心管中加入1.5ml無血清DMEM，按比例加入含目的序列的重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev和pVSV－G，混勻，取另一支無菌的5ml離心管，加入1.5ml無血清DMEM，再加入300ulRNAi－Mate，混勻，室溫放置5min后將兩管混合，室溫放置20－25min。除去15cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入8ml無血清的DMEM培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入15cm培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復(fù)合物，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中溫育4－6h。吸棄轉(zhuǎn)染液，加入18ml含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。病毒收集：將培養(yǎng)皿中細(xì)胞上清液吸到50ml離心管中，4℃，4000rpm，4min。低速離心后，將離心管上清液倒入50ml注射器內(nèi)，用0.45um過濾器過濾。濾液在離心機(jī)中進(jìn)行超速離心，4℃，20000rpm，2h。將濃縮液收集分裝至凍存管中。分裝的病毒液貼上標(biāo)簽，－80℃冰箱保存。病毒滴度檢測：取對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，按3×104個細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板，混勻后于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。次日，將慢病毒原液10μl，用10％FBS的DMEM培養(yǎng)液十倍稀釋3－5個梯度。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100μl稀釋的病毒液，同時(shí)設(shè)立空白對照組，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100μl10％FBS的DMEM培液，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。通過熒光顯微鏡或FACS計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。病毒滴度(BT＝TU/ml，transducingunits)計(jì)算公式：TU/μl＝(P×N/100×V)×1/DF，其中，P＝％GFP+cells，N＝轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞數(shù)，V＝每孔加入病毒稀釋液體積(μl)，DF＝稀釋因子(dilutionfactor)＝1(undiluted)、10－1(diluted1/10)、10－2(diluted1/100)。實(shí)施例5慢病毒感染A375細(xì)胞取對數(shù)生長期的A375細(xì)胞，按2.5×105個細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；次日，制備病毒稀釋液(DMEM培養(yǎng)基400ul+終濃度5ug/mlPolybrene)，將實(shí)施例4包裝的慢病毒原液按1：9加入到稀釋液中，將稀釋液加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。12－24h后移去細(xì)胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24－48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。培養(yǎng)48h后，熒光倒置顯微鏡下可見絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，提示重組慢病毒載體成功感染A375細(xì)胞。實(shí)施例6慢病毒感染SW480細(xì)胞取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，按3.0×105個細(xì)胞/孔的濃度接種于24孔板中，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；次日，制備病毒稀釋液(DMEM培養(yǎng)基400ul+終濃度10ug/mlPolybrene)，將實(shí)施例4包裝的慢病毒原液按1：9加入到稀釋液中，將稀釋液加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。12－24h后移去細(xì)胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24－48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。培養(yǎng)48h后，熒光倒置顯微鏡下可見絕大多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，提示重組慢病毒載體成功感染SW480細(xì)胞。由以上結(jié)果可知，本發(fā)明提供的BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體及BANCR慢病毒構(gòu)建成功。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。SEQUENCELISTING<110>昆明醫(yī)科大學(xué)<120>BANCR基因過表達(dá)慢病毒載體、BANCR慢病毒及構(gòu)建方法和應(yīng)用<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>688<212>DNA<213>智人種（Homosapiens）<400>1attcccttactttcttaataaactcgctttcactttatggattcaactgtaattctttct60tgtgtgagatccaagaaccttcttgtagggtctggattgggacccttttctggtaacatc120ttcctggtgaccatgaagggacaatactgaagagacccctgaccctaaggaaatagactg180cagcaccaatgggccaactttggggcgatcatcttgcccagaaacatcatgttgaaactc240ttggtcagaggttggatgaaagctgacagggtccatccaggagcaagtttgagccttgcc300agttccattttgggtgctgagtggagtggcgactatagcaaacctgtgatctctggctgc360tgctcagaagaaacaagagggagggatgaataatgtaaaactctggatcaatattctaat420tctgagcctctattggaatcagctagcaaccacatatcagcttggtttcaacagtttccc480agttcatgctgctgagaagttcagagtcaaacctgaatctcacctctgcaaagagcacag540gactccatggcaaacgttgtatatacgcaagtcatccctggcaccacattgatttactgc600accaggctttcttcattgtgatgatgttctctctcttttctaaaaaaaaaataaaaataa660aatttaaaaaatcctaaaaaaaaaaaaa688<210>2<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>2agggttccaagcttaagcggccgcattcccttactttcttaataaac47<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>3gatccatccctaggtagatgcattttttttttttttaggatttttta47當(dāng)前第1頁1 2 3