專(zhuān)利名稱(chēng)：慢病毒載體的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)慢病毒載體的方法。
背景技術(shù)：
慢病毒例如I型人類(lèi)免疫缺陷病毒是很有希望的基因治療工具，這 是因?yàn)樗鼈兡軌蜣D(zhuǎn)導(dǎo)并整合至分裂細(xì)胞及非分裂細(xì)胞的基因組中。然而， 用于大規(guī)模臨床應(yīng)用的復(fù)制缺陷慢病毒載體的生產(chǎn)仍面臨著挑戰(zhàn)。慢病
毒載體的生產(chǎn)通常通過(guò)以多種不同質(zhì)粒構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染293T人胚腎細(xì)胞 實(shí)現(xiàn)。最初的臨床慢病毒載體生產(chǎn)是基于一個(gè)雙質(zhì)粒體系(Lu W n/.， 2004)。為了進(jìn)一步提高該體系的安全性，可以將慢病毒基因組分至4個(gè) 質(zhì)粒中。這些質(zhì)粒為自失活轉(zhuǎn)移載體、包含^^-/^/的包裝質(zhì)粒、rev質(zhì) 粒以及通常編碼水泡性口膜炎病毒糖蛋白G (VSV-G)的包膜糖蛋白質(zhì) 粒。為了大規(guī)模生產(chǎn)慢病毒，已通過(guò)貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)將其變成細(xì)胞工廠 (cell factory )。此外，已在無(wú)血清的條件下使用3-L生物反應(yīng)器在懸浮 培養(yǎng)物中瞬時(shí)地生產(chǎn)出慢病毒載體。
由于用于病毒生產(chǎn)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染體系可能存在問(wèn)題并且很費(fèi)時(shí)，已經(jīng) 開(kāi)始嘗試開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的大規(guī)模生產(chǎn)體系。然而，慢病毒蛋白酶和融合包膜 蛋白VSV-G的毒性妨礙了組成型載體的生產(chǎn)。 一種生產(chǎn)方法是使用受四 環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子體系或蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子體系控制的誘導(dǎo)型包裝 細(xì)胞系。其他的生產(chǎn)方法涉及將毒性VSV-G蛋白替換為低毒糖蛋白。
慢病毒載體還可以被多種病毒表面蛋白假型化。最常用的是水泡性 口膜炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)。另外，多種不同的包膜糖蛋白例 如來(lái)自？反轉(zhuǎn)錄病毒(如貓內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒RD114env、改良的長(zhǎng)臂 猿白血病病毒GalV或莫洛尼小鼠白血病病毒MLV)、曱病毒、狂犬病 病毒或桿狀病毒的包膜糖蛋白也已用于假型慢病毒載體。
假型化可擴(kuò)大慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)范圍，在多種不同細(xì)胞和組織中已經(jīng)獲 得了長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)基因表達(dá)(Delenda， 2004 )。假型化還可強(qiáng)化脆弱的慢病毒，使得可通過(guò)超速離心濃縮獲得高效價(jià)。
桿狀病毒在基因送遞應(yīng)用方面具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。它們具有大插入容量
(> 100 kb )并且能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞系——甚至是無(wú)血清條件 下的大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物(Scotte/fl/.，2007)。另外，桿狀病毒易于以 大規(guī)模及高效價(jià)生產(chǎn)，并且由于它們不能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制而很少 呈現(xiàn)安全問(wèn)題。幾乎不能檢測(cè)到細(xì)胞毒性，甚至在較高感染復(fù)數(shù)(MOI) 的情況下也是如此。
桿狀病毒已經(jīng)被用于昆蟲(chóng)細(xì)胞中的大規(guī)模蛋白的生產(chǎn)，以及用于病 毒樣顆粒(VLP)例如肝炎VLP的生產(chǎn)。已經(jīng)使用雜交桿狀病毒產(chǎn)生出 了完整病毒。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，桿狀病毒介導(dǎo)的重組流感病毒、腺病 毒(Cheshenko C "/， 2001)和AAV ( Auang " "/， 2007 )的生產(chǎn)已經(jīng)有記 載。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明， 一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu) 建體、gflg、 po/、包膜蛋白和"v中的每一種分別地克隆至相同的桿狀病 毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn) 細(xì)胞。


以下的附示說(shuō)明了本發(fā)明的實(shí)施方案。
圖1的示意圖顯示了克隆的桿狀病毒供體質(zhì)粒BAC-轉(zhuǎn)移體 (transfer), BAC陽(yáng)gag-pol、 BAC-VSVg和BAC國(guó)rev。 圖2的示意圖為桿狀病毒介導(dǎo)的慢病毒的生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
為了實(shí)施本發(fā)明的方法，所述桿狀病毒必須包含慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建 體、g"g、戶(hù)八合適的包膜蛋白和/w。
術(shù)語(yǔ)"慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體"應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。慢病毒轉(zhuǎn)移 構(gòu)建體是慢病毒RNA基因組/慢病毒載體RNA和轉(zhuǎn)基因盒的來(lái)源。慢病 毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的一個(gè)實(shí)例是LV1-GFP。用于產(chǎn)生慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體的方 法亦應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。術(shù)語(yǔ)"包膜蛋白"應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。包膜蛋白是保護(hù)病毒
的核酸的蛋白質(zhì)。適合在本發(fā)明中使用的包膜蛋白的一個(gè)實(shí)例為VSV-G。 術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)細(xì)胞"應(yīng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。適合在本發(fā)明中使用 的生產(chǎn)細(xì)胞的實(shí)例有293T細(xì)胞、H印G2細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、 Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞、293細(xì)胞、BTI-Tn 5 B 1-4細(xì)胞、COS細(xì)胞、NIH/3T3 細(xì)胞、Vero細(xì)胞、NSO細(xì)胞或PerC6細(xì)胞。而且，生產(chǎn)細(xì)胞可以;故貼 壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。
優(yōu)選地，生產(chǎn)本發(fā)明的功能性慢病毒需要的所有元件被克隆至3種 不同的桿狀病毒中。更優(yōu)選地，它們被克隆至2種不同的桿狀病毒中， 并且最優(yōu)選地，它們被克隆至單種桿狀病毒中。這可通過(guò)將BAC-轉(zhuǎn)移 體、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev的特征合并至單種桿狀病毒 中實(shí)現(xiàn)。
已經(jīng)構(gòu)建了 4種源自苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(爿"tog/7i/;/^ cfl/^/bf"/cflf multicapsid nucleopolyhedrovirus ) ( AcMNPV )的重組軒狀病 毒BAC-轉(zhuǎn)移體、BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev。它們可編碼 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生成慢病毒載體需要的所有元件。通過(guò)用這些桿狀病 毒轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞，已經(jīng)產(chǎn)生了功能性慢病毒。
由于生產(chǎn)容易、桿狀病毒的濃度、在無(wú)血清條件下對(duì)懸浮哺乳動(dòng)物 細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)以及安全性這些原因，桿狀病毒技術(shù)是規(guī)?；《旧a(chǎn) 的有吸引力的選擇。慢病毒載體的生產(chǎn)還可以采用編碼或展示病毒蛋白 rev、 tat、 net、 vit或vpu的桿狀病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)，其方式為但不限于將所述 病毒蛋白與一種桿狀病毒蛋白融合。所述桿狀病毒蛋白可以是大包膜蛋 白gp64或者殼體蛋白vp39和p24。
所產(chǎn)生的慢病毒可以被異源蛋白或其他配體例如VSV-g、 gp64、親 和素、鏈霉親和素或生物素假型化。
以下的實(shí)施例舉例說(shuō)明了本發(fā)明。 #存希才法
^ f4Z并炎'^毒^^在發(fā)
將用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生第3代慢病毒載體的所有必需元件 亞克隆至桿狀病毒供體載體pFastBacl中，以構(gòu)建4種源自苜蓿丫紋夜 蛾核多角體病毒(AcMNPV)的重組桿狀病毒BAC-轉(zhuǎn)移體、 BAC-gag-pol、 BAC-VSVg和BAC-rev (圖1)。首先，將包含多克隆位點(diǎn)
(尸附證緒尸s/脂/I/4/ni /尸fld爭(zhēng)薩M/尸附c販oRI"/ml/5V"腸cI )的多聚接頭(polylinker)克隆至pFastBacl的獨(dú)特JvHI位點(diǎn)。該多 聚接頭的序列為
5'CACGTGGCTAGCCTGCAGGTCGACCTTAAGTTAATTAAACTAG TACGCGTGTTTAAACGAATTCGGGCCCATTTAAATGGCGCGCC-3 ，(SEQ ID No: 1 )。為了方便桿狀病毒效價(jià)測(cè)定，所述供體載體還包含受 多角體蛋白啟動(dòng)子控制的紅色熒光蛋白標(biāo)記基因(DsRed)。
為了生成第3代自失活慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體，來(lái)自質(zhì)粒 LV國(guó)hPGK國(guó)ANGFP-WPRE-SIN (Makinen， 2006 )的(LV1-GFP ) ANGFP 被GFP替換。在該構(gòu)建體中，GFP標(biāo)記基因受磷酸甘油酸激酶(PGK) 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。pBAC-轉(zhuǎn)移體載體的構(gòu)建通過(guò)將來(lái)自L(fǎng)V1-GFP的相關(guān)序列 分兩階段亞克隆至pFastBacl供體栽體多聚接頭中實(shí)現(xiàn)。為了克隆所述 序列的第一部分，將LV1-GFP用5srBI和消化并亞克隆至所述供 體載體多聚接頭的Sh^I""I位點(diǎn)中。所述序列的第二部分的克隆是通 過(guò)將LV1-GFP用」wl和^rll消化，并將片段插入至所述改良的 pFastBacl質(zhì)粒的和JwII位點(diǎn)中。
由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)和的包裝構(gòu)建體(pBAC-gag-pol) 源自通過(guò)^/;"Ll消化的質(zhì)粒pMDLg/pRRE( Follenzi and Naldini， 2002 )， 將該構(gòu)建體亞克隆至所述供體載體的S附/I位點(diǎn)。在連接之前，將J/mLl 端用T4DNA聚合酶(Finnzymes， Helsinki, Finland )平端化。
將來(lái)自質(zhì)粒pCMV-VSVG的VSV-G包膜構(gòu)建體分兩階段亞克隆至 pFastBacl栽體中。首先，將pCMV-VSVG以JVWl消化并使用T4 DNA 聚合酶平端化，然后以五co/ I消化。將該片段亞克隆至所述多聚接頭的 S附/I/五coRI位點(diǎn)。將所述序列的第二部分用五"RI從pCMV-VSVG上 消化下，并亞克隆至多聚接頭E^RI位點(diǎn)。
使用正向引物和反向引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從質(zhì)粒 pRSV-REV (Dull W /， 1998 )獲得Rev cDNA。所述正向引物為 5'CGAAGGAATTCGTCGCdCATGGCAGGAAGAAGCGGA-3' ( SEQ ID No: 2)。 rev基因的第l-18位核苷酸的序列為粗體，Kozak共有序列 為斜體，五coRI位點(diǎn)以下劃線(xiàn)示出。所述反向引物為 5'AGCTAGCTAGCGTATTCTCCTGACTCCAATATTGT-3' ( SEQ ID No:3)。 rev基因的第349-325位核苷酸的序列為粗體，并且A^d位點(diǎn)以下 劃線(xiàn)示出。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)五"RI和A7^1消化，4吏用Wizard Clean up試劑盒(Promega， Madison, WI， USA)純化，并亞克隆至所述 pFastBacl多聚接頭的五"RI/A7^I位點(diǎn)，以形成pBAC-rev。 Rev cDNA 受CMV啟動(dòng)子的控制，所述CMV啟動(dòng)子在之前作為pcDNA3載體 (Invitrogen)的A^"I/f"RI片段被亞克隆至pFastBacl多聚接頭的 5Wfll/五coRI位點(diǎn)。
將293T細(xì)胞鋪板接種24 h，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。將細(xì)胞在都補(bǔ)加有10% 胎牛血清(FBS )的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM )或RPMI 1640 中培養(yǎng)。在無(wú)血清或補(bǔ)加血清的DMEM或RPMI中以每個(gè)細(xì)胞50-1000 pfu的不同感染復(fù)數(shù)(MOI)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在37。C下于無(wú)血清培養(yǎng)基中孵 育4 h后或者于補(bǔ)加血清的DMEM或RPMI中孵育18 h后，洗滌細(xì)胞 并更換培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h收集包含慢病毒的細(xì)胞上清液，并且在室 溫下以1500 rpm離心10 min。
作為對(duì)照，制備了未使用所述3種桿狀病毒(BAC-gag-pol、BAC-Rev 或BAC-VSVg)中的其中一種的數(shù)批培養(yǎng)上清。還通過(guò)常規(guī)的四質(zhì)粒瞬 時(shí)轉(zhuǎn)染方法(Follenzi and Naldini， 2002 )在293T細(xì)胞中制備了慢病毒。 為了增強(qiáng)細(xì)胞在平板底部的貼附，依照制造商的說(shuō)明書(shū)以多聚-L-賴(lài)氨酸 包,皮平板。
虔^#^放#浙定
慢病毒轉(zhuǎn)化單位(TU/ml)通過(guò)分析能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞的病毒顆粒 的數(shù)目確定。在第一天，將Hela細(xì)胞以每孔lxl()S個(gè)細(xì)胞接種于6孔板 中，或者以每孔5xl()S個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中。在第二天以系列稀釋度 進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在第五天以熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞儀分 析，以得出被表達(dá)GFP的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。效價(jià)的計(jì)算如 Follenzi and Naldini， 2002中所述。
脊差萄^炎矽/^^S
將Hela細(xì)胞(5xl03 )接種于96孔板上，第二天以桿狀病毒產(chǎn)生的 慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，并將細(xì)胞培養(yǎng)至最多6周。通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)GFP表達(dá)， 每周一次。作為另一個(gè)對(duì)照，還以表達(dá)GFP的桿狀病毒BAC-轉(zhuǎn)移體轉(zhuǎn) 導(dǎo)Hela細(xì)胞，并以類(lèi)似的方式監(jiān)測(cè)表達(dá)情況。通過(guò)p24 ELISA試劑盒(NENTM Life Science Products HIV-1 p24 ELISA)確定慢病毒殼體蛋白p24的量(pg/ml)。通過(guò)p24ELISA測(cè)定 法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有復(fù)制能力的慢病毒(RCL)進(jìn)行測(cè)試。用慢病 毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將細(xì)胞培養(yǎng)4周， 收集上清液并且重復(fù)地測(cè)量該上清液中p24的濃度作為RCL的標(biāo)示物。 這還通過(guò)以收集的上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)原初HeLa細(xì)胞得到確證，并通過(guò)熒光顯 微鏡和流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)GFP表達(dá)。
通過(guò)GraphPadPrism 4 ( GraphPad Software Inc., San Diego， CA，
USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
并炎'病#^>#建
將關(guān)鍵的第三代元件克隆至4種桿狀病毒中。通過(guò)限制分析驗(yàn)證桿 狀病毒質(zhì)粒構(gòu)建體，并且在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)4種桿狀病毒。為了監(jiān)測(cè)桿 狀病毒生產(chǎn)的穩(wěn)定性，用針對(duì)桿狀病毒的大包膜蛋白的抗gp64抗體對(duì)每 一批細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析。在昆蟲(chóng)細(xì)胞中對(duì)濃縮的桿狀病毒進(jìn)行終點(diǎn) 效價(jià)測(cè)定(IU/ml)。產(chǎn)生的所有病毒都被測(cè)得為高效價(jià)(>101GIU/ml), 該測(cè)量的高效價(jià)被用于控制慢病毒生產(chǎn)中的MOI。
慢病毒的生產(chǎn)通過(guò)以4種桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞。使用不同的培養(yǎng) 基和孵育時(shí)間進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后20 h通過(guò)熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48 h收集包含慢病毒的上清液，并且測(cè)定在HeLa細(xì)胞中的效 價(jià)，作為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU/ml)。
當(dāng)在無(wú)血清條件下進(jìn)行4 h轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，MOI均為500的4種桿狀病毒 均產(chǎn)生平均為6.0xl05 TU/ml的慢病毒效價(jià)。MOI為750的桿狀病毒濃 度產(chǎn)生了平均為1.2 xl06 TU/ml的更高的慢病毒效價(jià)。在使用更高的桿 狀病毒濃度(4種桿狀病毒的MOI均為1000 )時(shí)，檢測(cè)到了效價(jià)的降低。 當(dāng)桿狀病毒被過(guò)夜轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，MOI為250的4種桿狀病毒產(chǎn)生平均為 2.5X106 TU/ml的最高效價(jià)。當(dāng)RPMI培養(yǎng)基被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，MOI為50 時(shí)就以達(dá)到平均為5.9xl05 TU/ml的最高效價(jià)。這些效價(jià)與由常規(guī)的四質(zhì) 粒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法(Follenzi and Naldini， 2002 )產(chǎn)生的效價(jià)是相當(dāng)?shù)?。不同的質(zhì)粒比可影響質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中的效價(jià)。當(dāng)使用與通常使用的質(zhì)粒
比相同的桿狀病毒比的時(shí)候，慢病毒效價(jià)比預(yù)期的低0.64倍。還將BAC-轉(zhuǎn)移體病毒加倍，以觀察是否能獲得更高的慢病毒效價(jià)。然而，所述效 價(jià)與用相似劑量的桿狀病毒進(jìn)行生產(chǎn)相比沒(méi)有顯著不同。以加倍量的 BAC-轉(zhuǎn)移體獲得的效價(jià)平均為1.4xl06 TU/ml。
作為陰性對(duì)照，每次不使用其中一種桿狀病毒(BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg)進(jìn)行慢病毒生產(chǎn)。收集的培養(yǎng)基被用于轉(zhuǎn)導(dǎo) HeLa細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后四天通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目 (% )進(jìn)行分析。在這些實(shí)驗(yàn)中未測(cè)定到GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
經(jīng)常使用的慢病毒生物效價(jià)(TU/ml)的滴定方法是通過(guò)ELISA測(cè) 量p24濃度(pg/ml)。 p24在培養(yǎng)基中的濃度為191 ± 105 ng/ml，這與 代表性病毒制品的值相當(dāng)。然而，p24濃度沒(méi)有將生物活性顆粒分開(kāi)。 為了比較感染顆粒和p24比率，從以不同量或比例的桿狀病毒產(chǎn)生的多 種制品測(cè)量了這兩個(gè)參數(shù)。結(jié)果顯示出良好的TU/p24比率。
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在收集的慢病毒培養(yǎng)基中殘留的桿狀病毒通過(guò)終點(diǎn)效價(jià)測(cè)定進(jìn)行評(píng) 估，并且效價(jià)為用于293T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的劑量的0.1-0.5%。為了確證轉(zhuǎn)基 因表達(dá)源自所產(chǎn)生的慢病毒，而不是源自殘留的桿狀病毒，將293T細(xì) 胞僅以BAC-轉(zhuǎn)移體桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后，將HeLa細(xì)胞以通過(guò)類(lèi)似于慢 病毒制備中的方式收集的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天以流式細(xì)胞儀 對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。未檢測(cè)到GFP陽(yáng)性細(xì)胞。
桿狀病毒載體不會(huì)在脊推動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制，并且它們無(wú)法整合至宿 主的基因組中。來(lái)自這些栽體的基因表達(dá)是瞬時(shí)的，通常在兩周內(nèi)消失。 然而，來(lái)自整合的慢病毒的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是相對(duì)穩(wěn)定的，被認(rèn)為不會(huì)出現(xiàn) 轉(zhuǎn)基因表達(dá)的沉默。桿狀病毒產(chǎn)生的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致有效的GFP表 達(dá)，這在轉(zhuǎn)導(dǎo)后43天后仍能觀察到(圖5A)。在第三天還通過(guò)熒光顯微 鏡在HeLa細(xì)胞中檢測(cè)到了表達(dá)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后17天，MOI為100和1000 (在第3天分別位18.7±1.9%和11.5±0.4 % )時(shí)桿狀病毒介導(dǎo)的GFP表 達(dá)消失。
^"復(fù)浙^力^度病毒
有復(fù)制能力的慢病毒(RCL)的測(cè)試是通過(guò)p24ELISA測(cè)定法進(jìn)行 的。將H6La細(xì)胞以包含慢病毒的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)流式細(xì)胞儀確證轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。將細(xì)胞培養(yǎng)4周，并重復(fù)地測(cè)量上清液中p24的濃度。p24濃 度升高表明病毒復(fù)制的進(jìn)行，但沒(méi)有檢測(cè)到這種升高。將2.5周后收集 自轉(zhuǎn)導(dǎo)的HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)一步用于轉(zhuǎn)導(dǎo)原初HeLa細(xì)胞，但用熒 光顯微鏡或流式細(xì)胞儀均未檢測(cè)到GFP表達(dá)。
總之，已證明，使用雜交桿狀病毒可成功地生成功能性慢病毒。由 桿狀病毒產(chǎn)生的慢病毒的效價(jià)與使用常規(guī)的四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生的效價(jià) 是相當(dāng)?shù)?。?dāng)使用最佳劑量的桿狀病毒及延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間的時(shí)候，獲得 了良好的慢病毒效價(jià)。當(dāng)使用高劑量的桿狀病毒的時(shí)候，觀察到慢病毒 效價(jià)的降低及細(xì)胞死亡。這一點(diǎn)可能歸因于VSV-G對(duì)生產(chǎn)細(xì)胞的毒性。 當(dāng)不使用表達(dá)VSV-G的桿狀病毒時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，桿狀病毒顆粒的總數(shù) 保持不變。通過(guò)以RPMI 1640替換DMEM培養(yǎng)基，最低的桿狀病毒劑 量(MOI50)產(chǎn)生最佳的慢病毒效價(jià)。這一點(diǎn)與這樣的事實(shí)是一致的， 即轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)基可影響桿狀病毒介導(dǎo)的基因在脊推動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。為 了確證所生成慢病毒的功能性，HeLa細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)，持續(xù)的GFP表達(dá)出 現(xiàn)6周。然而，用對(duì)照桿狀病毒時(shí)，GFP表達(dá)在17天內(nèi)消失。如果通 過(guò)不使用BAC-gag-pol、 BAC-Rev或BAC-VSVg來(lái)生產(chǎn)慢病毒，則無(wú)慢 病毒產(chǎn)生。
雖然桿狀病毒是安全的，但是慢病毒制品被桿狀病毒污染是不希望 的。在所述慢病毒制品中殘留的桿狀病毒的量?jī)H為簡(jiǎn)單慢病毒生產(chǎn)方案 中使用的桿狀病毒劑量的0.1-0.5%,所述簡(jiǎn)單慢病毒生產(chǎn)方案中的293T 細(xì)胞在桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后僅被洗滌一次。通過(guò)簡(jiǎn)單地增加額外的洗滌步驟 或者使用合適的下游純化策略，可進(jìn)一步降低殘留的桿狀病毒。
與使用慢病毒載體相關(guān)的一個(gè)主要關(guān)注點(diǎn)是生成人致病性病毒的可 能性。為了避免這一點(diǎn)，將慢病毒基因組分至4個(gè)不同的生產(chǎn)質(zhì)粒中， 目的是使通過(guò)重組形成RCL的風(fēng)險(xiǎn)最小。在桿狀病毒生成的慢病毒制品 中沒(méi)有檢測(cè)到RCL。 p24水平在延長(zhǎng)培養(yǎng)后沒(méi)有增加，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后2.5周 內(nèi)沒(méi)有檢測(cè)到GFP表達(dá)。
用貼壁細(xì)胞進(jìn)行用于臨床研究的病毒規(guī)模化生產(chǎn)仍很困難。因此， 使慢病毒生產(chǎn)與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物相適應(yīng)將是有利的。在無(wú)血清條件下 HEK293細(xì)胞適應(yīng)的懸浮物中的初步結(jié)果顯示了十分有效的桿狀病毒轉(zhuǎn) 導(dǎo)效率(95.1% GFP陽(yáng)性細(xì)胞)。Delenda, 2004. J. Gene /Wee/. 6 Suppl 1: S125-S138.
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權(quán)利要求
1.一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、gag、pol、包膜蛋白和rev中的每一種分別地克隆至相同的桿狀病毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述包膜蛋白為VSV-G。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、gtfg、 /^/、 VSV-G和rev被分別地克隆至BAC-轉(zhuǎn)移體、BAC-gtfg-/w/、 BAC-VSVg 和BAC-rev中。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、g"g、 /^/、 所述包膜蛋白和"v的每一種均被克隆至所述相同的桿狀病毒中。
5. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述生產(chǎn)細(xì)胞為293T細(xì) 胞、HepG2細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Sf9細(xì)胞、Sf21細(xì)胞、293 細(xì)胞、BTI-Tn 5 B 1-4細(xì)胞、COS細(xì)胞、NIH/3T3細(xì)胞、Vero細(xì)胞、NSO 細(xì)胞或PerC6細(xì)胞。
6. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體為 第3代慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體。
全文摘要
本發(fā)明是一種生成慢病毒載體的方法，包括將慢病毒轉(zhuǎn)移構(gòu)建體、gag、pol、包膜蛋白和rev的每一種分別地克隆至相同的桿狀病毒或不同的桿狀病毒中，并且以這些桿狀病毒或每種桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)生產(chǎn)細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/79GK101631863SQ200880004377
公開(kāi)日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2008年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月12日
發(fā)明者H·P·萊施, K·J·艾瑞尼, S·艾拉赫?qǐng)D阿拉 申請(qǐng)人:Ark治療學(xué)有限公司