本發(fā)明涉及血管內皮生長因子受體(vegfr)融合蛋白，其用于制備治療癌癥或眼病的藥劑(agent)。本發(fā)明的融合蛋白是多價雙特異性抗體，其中vegfr胞外結構域與免疫球蛋白樣結構域的fc區(qū)域融合。
背景技術：
：血管內皮生長因子(vegf)是在促進血管發(fā)生和血管生成兩者中起重要作用的信號蛋白。當血液循環(huán)不當時，vegf起到恢復和向組織供氧的系統的一部分的作用。vegf的眾所周知的功能是在胚胎發(fā)育期間、在受傷部位、在運動后的肌肉中以及在脈管(vessel)形成中產生新的血管以繞過阻塞的血管。然而，增加的vegf的量可能引起異常的血管生成。尤其地，血管生成與腫瘤發(fā)展相關，使得其參與原發(fā)性或轉移性腫瘤生成。此外，當原發(fā)性癌細胞通過血管生成引入血管時，發(fā)生癌癥轉移。據報道，血管生成引起例如哮喘、呼吸困難、子宮內膜異位；急性和慢性炎癥，例如動脈粥樣硬化和組織水腫；傳染病，例如肝炎和卡波西肉瘤；自身免疫性疾病，例如糖尿病、牛皮癬、風濕性關節(jié)炎和甲狀腺炎；和其他包括糖尿病視網膜病變、脈絡膜新生血管形成(cnv)、年齡相關性黃斑變性(amd)、血管纖維瘤等的疾病(carmeliet,p.yjain,rk.2000.nature407:249-257；kuwanom,等2001.internmed40:565-572)。在血管生成中起重要作用的vegf主要影響血管內皮細胞。根據體外試驗，vegf刺激內皮細胞的分裂(division)和漂移(wandering)，并且也增加毛細血管通透性。在哺乳動物中，vegf被分為5種類型，例如vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d和plgf(胎盤生長因子)。vegf-a刺激血管生成、內皮細胞漂移、分裂、血管管腔形成、巨噬細胞和粒細胞的趨化性和血管擴張。vegf-b促進胚胎血管生成，尤其是心肌組織的發(fā)育。vegf-c加速淋巴管生成，并且vegf-d對于包圍肺細支氣管的淋巴管的生長是必需的。此外，plgf對于血管發(fā)生、缺血、炎癥、損傷恢復和癌癥中的血管生成是重要的。vegf受體(vegfr)——一種其配體為vegf的受體，由3種亞型(vegfr1(flt-1)、vegfr2(kdr/flk-1)和vegfr3(flt-4))組成，并且通過基因的可變剪接以膜-結合vegfr(mbvegfr)或可溶性vegfr(svegfr)的形式存在。vegfr在神經細胞，卡波西氏肉瘤和造血干細胞中表達，而其通常在內皮細胞中被發(fā)現。一旦vegf結合至vegfr，信號通過受體的二聚化和受體酪氨酸殘基的磷酸化被傳遞。vegf以高親和力結合至其受體vegfr1和vegfr2，并且主要通過vegfr2傳遞信號，并誘導包括內皮細胞的生長和遷移的血管生成機制。因此，作為用于抑制或壓制由vegf誘導的血管生成的靶標，已經研究了vegf和vegfr2(ellis和hicklin,naturerev.cancer,8:579,2008；youssoufian等,clin.cancerres.,13:5544s,2007)。在先前研究中報道的雙特異性抗體或多特異性抗體包括i)由vegfr1結構域2、vegfr2結構域3、結構域4和igg1fc組成的康柏西普，ii)由vegfr1結構域2、vegfr2結構域3和igg1fc組成的vegf-trap(阿柏西普)和iii)由vegfr1結構域2、結構域3和igg1fc組成的vegf-grab。我們發(fā)明人已經急切地研究開發(fā)用于通過壓制或抑制血管生成來治療癌癥和眼病的多特異性抗體，并且已令人驚奇地發(fā)現本發(fā)明的免疫球蛋白樣結構域的融合蛋白構建體以高靈敏度和特異性結合至vegf-a和plgf，并且具有顯著優(yōu)異的抑制各種腫瘤的增殖、生長和/或血管生成的效果。本文引用的所有專利、公開的申請和參考文獻的教導通過引用以其整體并入。技術實現要素：技術問題因此，本發(fā)明的目的是提供用于治療由血管生成引起的癌癥和/或眼病的重組融合蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供核酸、包含所述核酸的重組載體和用于表達所述重組載體的宿主細胞。本發(fā)明的另一個目的是提供包含由宿主細胞表達的重組融合蛋白以預防或治療癌癥和/或眼病的藥物組合物。技術方案為了解決技術問題，本發(fā)明提供了一種4價多特異性抗體的vegfr融合蛋白。本發(fā)明的融合蛋白是免疫球蛋白樣結構域的重組融合蛋白，其包括(a)igg1的fc結構域，其中兩條重鏈通過二硫鍵連接，和(b)vegfr1的四個免疫球蛋白結構域2，其中兩個免疫球蛋白結構域2順序地與(a)的fc結構域的每條重鏈融合。此外，本發(fā)明提供了編碼所述重組融合蛋白的分離的核酸分子。此外，本發(fā)明提供了包括所述核酸分子的重組表達載體。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了用所述重組表達載體轉化的宿主細胞。將重組表達載體插入宿主細胞以產生轉化的細胞。用于重組表達載體的合適的宿主細胞可以是原核生物，例如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌屬、假單胞菌屬、變形桿菌屬或葡萄球菌屬。另外，合適的宿主細胞可以是真核細胞，包括例如真菌，例如曲霉屬；酵母，例如巴斯德畢赤酵母屬、釀酒酵母、裂殖酵母屬和粗糙脈孢菌；其他低等真核細胞；和高等真核細胞，例如昆蟲細胞。另外，真核細胞可以是植物細胞或哺乳動物細胞，優(yōu)選地，cos7細胞(猴腎細胞)、nso細胞、sp2/0細胞、cho細胞(中國倉鼠卵巢)、w138細胞、bhk細胞(幼地鼠腎細胞)、mdck細胞、多發(fā)性骨髓瘤細胞系、hut78細胞和hek293細胞可用于表達。在本發(fā)明中，用于宿主細胞轉化的方法包括將核酸引入生物體、細胞、組織或器官中，同時可以根據宿主細胞選擇最合適的方法?？捎玫霓D化方法包括例如電穿孔、原生質體融合、capo4沉淀、cacl2沉淀、碳化硅纖維攪拌、農桿菌介導的轉化和peg、葡聚糖硫酸酯、脂質體轉化(lipofectamine)和干燥/抑制介導的轉化。為了表達本發(fā)明的融合蛋白，可以使用重組表達載體和宿主細胞的各種組合。用于真核細胞的優(yōu)選表達載體包括來源于但不限于sv40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關病毒、巨細胞病毒和逆轉錄病毒的基因表達調控序列?？捎糜诩毦拗鞯谋磉_載體包括細菌質粒，例如從大腸桿菌獲得的pet、prset、pbluescript、pgex2t、puc載體、cole1、pcr1、pbr322、pmb9及其衍生物；具有寬宿主范圍的質粒，例如rp4；由各種噬菌體λ衍生物例如λgt10、λgt11和nm989示例的噬菌體dna；其它dna噬菌體，例如m13和絲狀單鏈dna噬菌體。可用于酵母細胞的表達載體可以是質粒及其衍生物。用于昆蟲細胞的表達載體包括pvl941。因此，在本發(fā)明中，重組表達載體可以是質粒、yac(酵母人工染色體)、yep(酵母附加型質粒)、yip(酵母整合型質粒)或重組病毒。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了用于產生vegfr融合蛋白的方法。該方法包括，(a)在產生融合多肽的條件下孵育宿主細胞，(b)回收產生的融合多肽。宿主細胞具有重組表達載體，其中編碼融合多肽的核酸序列可操作地連接到表達調控序列。在原核或真核表達系統中，融合多肽可以通過使用包括編碼下述的核酸序列的重組表達載體來表達：(a)第一vegfr1免疫球蛋白樣結構域2；(b)第二vegfr1免疫球蛋白樣結構域2；和(c)人igg的fc區(qū)域多肽。獲得的融合多肽可以通過用于產生生物學上穩(wěn)定的蛋白質的常規(guī)方法純化。例如，透析、離子交換色譜、親和色譜、hplc(高壓液相色譜)和page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)可用于此目的，但不限于此。此外，本發(fā)明提供通過上述方法制備的vegfr融合蛋白。根據本說明書的實施例2至4，與阿柏西普和貝伐單抗相比，本發(fā)明的融合蛋白與靶配體vegf-a和plgf具有顯著增加的結合親和力。此外，根據實施例5，本發(fā)明的融合蛋白(kp-vr2)可以用作抗-vegf，因為當施用于需要治療與vegf有關的疾病的受試者時，其以高靈敏度和選擇性結合至vegf。此外，根據實施例6，融合蛋白(kp-vr2)具有與阿柏西普類似的藥代動力學特征，因此其可以替代市售的抗-vegf或與其組合使用。因此，本發(fā)明的融合蛋白提供了用于治療腫瘤的藥物組合物和用于治療由眼中血管生成引起的眼病的藥物組合物。在本發(fā)明中，與血管生成有關的眼病包括例如年齡相關性黃斑變性(armd)、濕性年齡相關性黃斑變性、脈絡膜新生血管形成(cnv)、脈絡膜血管病變、病理性近視、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性黃斑水腫、視網膜血管阻塞、早產兒視網膜病變(rop)和新生血管性青光眼(nvg)。此外，脈絡膜新生血管形成可以是近視cnv、創(chuàng)傷性cnv、由葡萄膜炎引起的cnv、眼組織胞漿菌病或特發(fā)性脈絡膜新生血管形成。此外，根據實施例7，本發(fā)明的融合蛋白在較低濃度下更有效地抑制或壓制人臍靜脈內皮細胞(huvec)和ea-hy926(人內皮細胞雜交細胞系)的遷移和侵襲。這表明本發(fā)明的融合蛋白可用作有效的血管生長抑制劑用于治療包括癌癥和血管生成性眼病的疾病，因為細胞遷移和侵襲在內皮細胞的血管發(fā)生的進程中是重要的。此外，實施例8至10支持本發(fā)明的融合蛋白(kp-vr2)對來自人的各種癌和成纖維細胞系具有抑制活性，并且對裸鼠的異種移植物具有抑制活性。在一個實施方案中，可以通過本發(fā)明的融合蛋白治療的腫瘤包括例如表皮樣腫瘤，頭頸部鱗狀腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌(包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、胰腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌、肝癌、卡波西肉瘤、中樞神經系統(cns)增殖異常(神經母細胞瘤、毛細血管癌、腦膜瘤和腦轉移)、黑素瘤、腎腫瘤、胃腸道腫瘤、橫紋肌肉瘤(rms)、成神經細胞瘤、平滑肌肉瘤等。根據待治療的疾病，本發(fā)明的藥物組合物可以單獨或與其它治療同時或順序地被施用。本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學上可接受的賦形劑、緩沖溶液、穩(wěn)定劑或藥學上可接受的載體或本領域技術人員公知的其它材料。這些材料是無毒的，并且不干擾或不與活性成分的藥理作用相互作用，并且它們的精確性質可以取決于施用途徑，例如口服、粘膜和胃腸外(例如靜脈內)。本發(fā)明的融合蛋白可以以0.001至5㎎/一個眼睛或1～10㎎/kg的量注射。有益效果本發(fā)明的vegfr是4價抗體，是免疫球蛋白樣結構域的融合蛋白，并且包括(a)igg1的fc結構域，其中兩條重鏈通過二硫鍵連接，和(b)vegfr1的四個免疫球蛋白結構域2，其中兩個免疫球蛋白結構域2順序地與(a)的fc結構域的每條重鏈融合。本發(fā)明的vegfr對vegf和plgf具有顯著增強的的結合親和力，并且對內皮細胞的遷移和侵襲具有優(yōu)異的抑制活性，并抑制各種癌癥和成纖維細胞的生長和增殖。因此，本發(fā)明的融合蛋白可用于開發(fā)用于治療由血管生成引起的癌癥和眼病的藥劑。附圖說明圖1示出了包括本發(fā)明的融合蛋白和現有技術的其他融合蛋白的融合蛋白構建體。圖2a、2b和3示出了本發(fā)明的阿柏西普和kp-vr2(vegfr融合蛋白)的結構。圖4顯示通過sds-page和蛋白質印跡確認的kp-vr2融合蛋白的分子量。圖5顯示本發(fā)明的融合蛋白、阿柏西普和貝伐單抗對vegf-a165或vegf-a121的結合親和力。圖6顯示了本發(fā)明的融合蛋白、阿柏西普和貝伐單抗對plgf的結合親和力。圖7顯示了本發(fā)明的融合蛋白或阿柏西普和vegf-a165之間的最大結合相互作用。圖8a和8b顯示與阿柏西普相比本發(fā)明融合蛋白的施用途徑上的藥代動力學特征。圖9a和9b顯示了本發(fā)明的融合蛋白、阿柏西普和貝伐單抗對huvec侵襲的影響。圖10a和10b顯示了本發(fā)明的融合蛋白、阿柏西普和貝伐單抗對ea-hy926遷移的影響。圖11a和11b顯示了與阿柏西普相比，本發(fā)明的融合蛋白抑制9(九)種癌的增殖的能力圖12和13顯示了與阿柏西普相比，本發(fā)明的融合蛋白對抗-vegf抗性癌和成纖維細胞的細胞活力的抑制能力。圖14至17表示人癌癥模型(ht-29、lovo和skut1b)中腫瘤生長和腫瘤重量的比較。圖18顯示kp-vr2的重組表達載體。圖19顯示kp-vr3的重組表達載體。最佳實施方式本發(fā)明一般涉及4價fc-融合蛋白，并且更具體地，涉及fc-融合蛋白。fc-融合蛋白通常通過免疫球蛋白(ig)的fc片段與受體的配體結合區(qū)域的融合形成，并具有與抗體類似的結構。文獻中提出了多種免疫粘附分子。然而，根據本發(fā)明的免疫粘附分子與常規(guī)免疫粘附分子具有不同的結構，并且也沒有現有技術預測或描述根據本發(fā)明的免疫粘附分子的制劑。本發(fā)明的實施方式在下文中，將參考實施例更詳細地描述本發(fā)明。應當理解，這些實施例不以任何方式被解釋為限制本發(fā)明。實施例實施例1：vegfr融合蛋白kp-vr2的生產將與人igg1fc結構域融合的人vegfr2結構域3(kp-vr1)；與人igg1fc結構域(seqidno:2)融合的人vegfr1結構域2(seqidno:1)(kp-vr2)；與人igg1fc結構域融合的人vegfr2結構域3(seqidno:3)和vegfr1結構域2(kp-vr3)；與人igg1fc結構域融合的人vegfr1結構域2和vegfr2結構域3(kp-vr4，阿柏西普)分別克隆到pcho1.0載體(invitrogen)中。分別用kp-vr1、kp-vr2、kp-vr3和kp-vr4構建體轉染cho-s細胞(invitrogen)，并通過使用甲氨蝶呤和嘌呤霉素選擇轉染的細胞。用蛋白a-瓊脂糖親和色譜純化kp-vr2和kp-vr4(vegf-trap；阿柏西普；eylea)。純化的蛋白質通過hplc分析進行定量，然后順序地進行sds-page和蛋白質印跡。圖1顯示了每個構建體。圖3表示蛋白質印跡的結果。如圖3所示，與人igg1fc結構域融合的人vegfr1結構域2(kp-vr2)具有約120kda條帶大小。實施例2：確定本發(fā)明的kp-vr2、阿柏西普和貝伐單抗對vegf-a的結合親和力在本實驗中比較了本發(fā)明的kp-vr2、阿柏西普和貝伐單抗對vegf-a的結合親和力。elisa測定根據貝伐單抗概述驗證報告(bevacizumabsummaryvalidationreport)(2014年2月28日)進行。用50ng/mlvegfa165(i)或vegfa121(iii)(r&d系統)涂覆96孔板(培養(yǎng)皿)，然后將kp-vr2、kp-vr4(阿柏西普)或阿瓦斯丁(貝伐單抗)以從0.0122到1,000ng/ml逐漸增加的量添加到孔中。接下來，洗滌板并與過氧化物酶共軛的抗人fc抗體反應。然后，加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺(tmb)溶液(roche)，然后使用elisa讀數器(分光光度計，biorad)在450nm下檢測吸光度。圖5(i和iii)顯示結果。此外，用2nm的kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)涂覆96孔板，然后以從0.03125至64nm逐漸增加的量向其中加入vegf165(ii)或vegf121(iv)(r&d系統)，以比較kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)與vegf-a的結合量。接下來，洗滌該板，并與抗人vegf抗體反應1小時。然后，再次洗滌該板并與過氧化物酶共軛的抗山羊ig抗體反應。接著，加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺溶液，然后通過使用elisa讀數器(分光光度計，biorad)在450nm下檢測吸光度。圖5(ⅱ和ⅳ)顯示結果。實施例3：本發(fā)明的kp-vr2、阿柏西普或貝伐單抗的plgf(胎盤生長因子)的中和活性的比較進行elisa以檢測本發(fā)明的kp-vr2、阿柏西普或貝伐單抗對plgf(胎盤生長因子)的結合親和力。用50ng/ml的plgf(i)涂覆96孔板，然后將kp-vr2(0.0122～1,000ng/ml)、kp-vr4(阿柏西普)(0.390625～16,000ng/ml)或阿瓦斯丁(貝伐單抗)(0.0122～1,000ng/ml)以逐漸增加的量添加至孔中。然后，洗滌板并與過氧化物酶共軛的抗人fc抗體反應。接著，加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺溶液，并且通過使用elisa讀數器(分光光度計，biorad)在450nm下檢測吸光度。此外，用400ng/ml的kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)涂覆96孔板，然后以0.8至12,500ng/ml的遞增量向其中加入plgf，以比較kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)與plgf的結合量。接著，使板與生物素化-plgf抗體反應1小時，然后洗滌。此后，使板與過氧化物酶共軛的抗山羊ig抗體(r&d系統)進一步反應。接下來，加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺(tmb)溶液，然后通過使用elisa讀數器在450nm下檢測吸光度。此外，用50ng/ml的plgf涂覆96孔板，然后以從2至31,250ng/ml逐漸增加的量加入kp-vr2或阿柏西普，以比較kp-vr2和kp-vr4(阿柏西普)與plgf的結合量。接下來，洗滌該板并與抗人fc抗體反應。然后，加入3,3,5,5-四甲基聯苯胺(tmb)溶液(roche)，并通過使用elisa讀數器在450nm檢測吸光度。圖6(ⅰ、ⅱ和ⅲ)顯示結果。如圖6(i)所示，與kp-vr4(阿柏西普)相比，kp-vr2對plgf的滴度(titer)提高約42倍，并且與kp-vr4(阿柏西普)相比，kp-vr2對plgf的最大結合量提高約54.3％(圖6(ⅱ))。這些結果支持kp-vr2對plgf具有顯著更高的結合親和力。同時，本發(fā)明的kp-vr2顯示與kip-vr4(阿柏西普)類似的對plgf的結合親和力。實施例4：本發(fā)明的kp-vr2融合蛋白對其配體(vegfa165、vegfa121或plgf)的總親合力(avidity)的比較通過elisa測定kp-vr2和kp-vr4(阿柏西普)對vegfa165、vegfa121或plgf的親合力，并且結果示于下表1中(kp-vr2和阿柏西普對vegf和plgf的親合力的比較)。【表1】如表1所示，kp-vr2對于vegfa具有比阿柏西普高約的結合親和力，并且對于plgf具有比阿柏西普高約55％的結合親和力。實施例5：本發(fā)明的kp-vr2的融合蛋白和阿柏西普與vegf-a165的結合親和力的比較使用spr(表面等離子體共振)的結合親和力比較實驗遵循參考文獻(bindingandneutralizationofvascularendothelialgrowthfactor(vegf)andrelatedligandsbyvegftrap,ranibizumabandbevacizumab.angiogenesis.2012,15(2):171-185)進行。首先，用hbst緩沖液(50nmhepes，150nmnacl，0.1％tween20)穩(wěn)定spr芯片，然后以1,000ru(共振單位)的密度將蛋白a結合到其上。通過使用10mm甘氨酸緩沖液洗滌芯片，并從中除去剩余的未結合的蛋白a。接下來，分別加入kp-vr2、kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗(2nm)并結合到芯片上。將vegfa165(0.5～8nm)流過芯片上。結果顯示于圖7和表2(kp-vr2、kp-vr4和kp-vr3對vegf的結合親和力)?！颈?】如圖7所示，kp-vr2的量以與vegfa165的濃度成比例提高，而kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗在4nm達到最大結合值。此外，如表2所示，kp-vr2對vegf-a的最大結合值為約120ru，而kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗(阿瓦斯丁)的最大結合值分別為87ru和75ru。因此，確認了與kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗相比，本發(fā)明的kp-vr2具有顯著增加的對vegf-a的總親合力。實施例6：本發(fā)明kp-vr2在大鼠中的藥代動力學特征將大鼠分為兩組，以評估vr-2和kp-vr4(阿柏西普)的藥代動力學特征。將1㎎/㎏的kp-vr2和1㎎/㎏的kp-vr4(阿柏西普)i.v.(靜脈內)注射到一組大鼠中，并且s.c.(皮下注射)到另一組大鼠中。關于i.v.注射組，在對重180～200g的6周大的雌性sd(斯普拉格-杜勒)大鼠各尾靜脈注射kp-vr2和kp-vr4(阿柏西普)后的0分鐘、5分鐘、15分鐘、45分鐘、3小時、5小時、24小時、48小時、72小時、96小時和168小時，從大鼠頸靜脈收集血液(vegf-trap:avegfbiockerwithpotentantitumoreffects.pnas.2002,99(17):139311398)，然后評價注射材料的變化量。接下來，對于s.c.注射組，在對重180～200g的6周大的雌性sd(斯普拉格-杜勒)大鼠的大鼠頸部的背部區(qū)域上各注射kp-vr2和kp-vr4(阿柏西普)后的0小時、1小時、2小時、4小時、6小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、48小時、96小時、168小時、240小時和336小時，從大鼠頸靜脈收集血液，然后評價注射材料的變化量，結果顯示于圖8。如圖8a和8b所示，kp-vr2顯示與kp-vr4(阿柏西普)類似的體內半衰期和藥代動力學特征。實施例7：分析kp-vr2在內皮細胞中的細胞遷移和侵襲抑制實施例7-1.檢測用kp-vr2和kp-vr4(阿柏西普)處理huvec(人臍靜脈內皮細胞)后由vegf-a誘導的細胞侵襲抑制通過在transwell系統中使用趨化性運動性檢測(chemotacticmotilityassay)來評估細胞遷移，以通過kp-vr2檢測細胞遷移和內皮細胞的侵襲。將生長因子減少的matrigel(millipore)涂覆在transwell系統上，然后通過使用侵襲檢測測定細胞侵襲。細胞遷移和細胞侵襲檢測的定量分析如下進行。transwell的底部涂覆有10μl0.1％明膠，并干燥24小時。將qcm24-孔細胞侵襲檢測試劑盒(corning)用于該實驗。用細胞侵襲檢測培養(yǎng)基(內皮細胞基礎培養(yǎng)基，ebm，0.1％fbs)收集分離的細胞。將細胞數調節(jié)至5×104個細胞/300μl細胞侵襲培養(yǎng)基，并將細胞接種在每個插入物上。用0～200nmkp-vr2、kp-vr4(阿柏西普)(eylea，商標)或貝伐單抗(avastin，商標)處理6孔。處理6孔中的vegf(350ng/ml)，然后在37℃孵育48小時。孵育后，除去剩余的細胞和培養(yǎng)基，并將插入物移至新孔。接下來，將插入物置于225μl細胞分離溶液中，并在37℃下在培養(yǎng)器中進一步孵育30分鐘。攪拌插入物以分離剩余的細胞。然后，向細胞分離溶液和細胞的混合溶液中進一步加入75μl裂解緩沖液/染料溶液，并將所得溶液在室溫下放置15分鐘。接下來，將200μl的溶液移入96孔中，并獲得595μl熒光圖像。結果顯示于圖9a、9b和表3(kp-vr2對內皮細胞遷移和侵襲的抑制的分析)?！颈?】如圖9a和9b所示，當vegf誘導huvec(lonza)中的細胞遷移和侵襲時，kp-vr2、kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗抑制誘導的細胞遷移和侵襲。本發(fā)明的kp-vr2在相同濃度(13nm)下顯示出比kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗更高的抑制活性。此外，如表3所示，kp-vr2、kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗的ic50分別為約11nm、20nm和21nm，這解釋了kp-vr2對細胞侵襲具有突出的抑制活性。實施例7-2.在用kp-vr2，kp-vr4(阿柏西普)或貝伐單抗處理ea-hy926細胞系后檢測由vegf-a誘導的細胞侵襲抑制將ea-hy926細胞系(atcccrl-2922tm)(3.5×105個細胞/ml)接種在具有0.1％fbs的dmem(達爾伯克氏改良的伊格爾氏培養(yǎng)基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium),sigma)中的96孔板上。接著，在37℃、5％co2條件下，分別用kp-vr2(1500μg/ml)、kp-vr4(阿柏西普)(3000μg/ml)和貝伐單抗(3000μg/ml)處理該板24小時。作為陰性對照，使用未用融合蛋白處理的培養(yǎng)基。結果顯示于圖10a和10b。如圖10a和10b所示，本發(fā)明的kp-vr2以比kp-vr4(阿柏西普)和貝伐單抗更低的濃度，更有效地抑制由vegf誘導的ea-hy926細胞的生長和增殖。實施例8：比較kp-vr2和kp-vr4之間的癌細胞增殖抑制能力對9(九)種癌細胞系進行mts細胞增殖比色檢測，以確定kp-vr2對癌細胞分裂的抑制能力。表4顯示了本實驗中使用的9種癌細胞系。【表4】將9種癌細胞系ht-29(atcchtb-38tm)、lovo(atccccl-229tm)、hct116(atccccl-247tm)、skut1b(atcchtb-115tm)、caki-1(atcchtb-46tm)、ags(atcccrl-1739tm)、panc0203(atcccrl-2553tm)、sw480(atccccl-228tm)和pc-3(atcccrl-1435tm)在37℃、5％co2條件下孵育至達到完全融合(confluency)。接下來，除去癌細胞系，并在包括10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基(sigma)上接種(3×103個細胞/孔)。然后，將細胞系在37℃下孵育24小時。接著，用具有0.5％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基(sigma)取代培養(yǎng)基。隨后，用2、4或6nm的kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)處理細胞系，并進一步孵育72小時。將mts試劑(qiagen)加入板中，在490nm測定吸光度。結果顯示于圖11a、11b和表5。如圖11a和11b所示，本發(fā)明的kp-vr2對本實驗中使用的所有癌細胞顯示出顯著優(yōu)異的細胞分裂抑制活性?！颈?】此外，如表5(細胞生長抑制活性)中所公開的，本發(fā)明的kp-vr2對靶向vegf和plgf的9種癌顯示出高度增強的細胞生長抑制作用。實施例9：在抗vegf抗性癌和成纖維細胞系中kp-vr2和阿柏西普的細胞分裂抑制活性的比較對于抗vegfa或抗vegfr抗性的癌細胞和成纖維細胞系進行mts細胞生長檢測，以評估kp-vr2對癌細胞分裂的抑制活性。表6顯示了本實驗中使用的4種癌細胞系和2種成纖維細胞系?！颈?】將4種癌細胞系el-4(atcctib-39tm)、llc1(atcctib-39tm)、b16f10(atcccrl-6475tm)、ct-26(atcccrl-2638tm)和pc-3(atcccrl-1435tm)以及成纖維細胞系nih3t3(kclbno.21658)和hs27(atcccrl-1634tm)在37℃、5％co2條件下孵育至達到完全融合。然后除去癌和成纖維細胞系，并在含有10％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基(sigma)上接種(3×103細胞/孔)。其后，將細胞系在37℃下孵育24小時。然后用含有0.5％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基(sigma)取代該培養(yǎng)基，并用2、4或6nm的kp-vr2或kp-vr4(阿柏西普)分別處理細胞系，然后將處理的細胞系進一步孵育72小時。接下來，將mts試劑(qiagen)加入至板，并在490nm檢測吸光度。結果示于圖12、13和表7(癌和成纖維細胞系)?！颈?】類型檢測方法kp-vr4kp-vr2ct26體外效果-～56％生長抑制b16-f10體外效果-～30％生長抑制el4體外效果～49％生長抑制～67％生長抑制llc1體外效果～12％生長抑制～70％生長抑制nih3t3體外效果～41％生長抑制～52％生長抑制hs27體外效果～15％生長抑制～25％生長抑制如圖12、13和表7中所示，本發(fā)明的kp-vr2不僅對于癌細胞(參見實施例8)而且對于抗-vegf/vegfr抗性的癌細胞系(el-4、llc1、b16f10和ct-26)和成纖維細胞系(hs27和nih3t3)顯示顯著增強的細胞生長抑制活性。實施例10：比較kp-vr2和阿柏西普在裸鼠中的腫瘤生長抑制在balb/c裸鼠中使用各種腫瘤異種移植模型(ht-29、lovo&skut1b)進行體內實驗以評估kp-vr2的腫瘤生長抑制活性。實施例10-1.ht-29體內異種移植將ht-29細胞(atcchtb-38tm)(5×106個細胞/0.2ml)皮下注射到裸鼠(東方生物、雌性、4周齡)的背部區(qū)域。當腫瘤體積變得大于200mm3時，分別將kp-vr2(1㎎/㎏或2㎎/㎏)和kp-vr4(阿柏西普)(2㎎/㎏或3㎎/㎏)以每周兩次注射到小鼠的腹腔內，并且在相同的時間和周期將相同量的pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)注射到陰性對照小鼠的腹腔中。每3至4天測量腫瘤的體積，并且結果公開于圖14。如圖14所示，與相同量的阿柏西普(kp-vr4)相比，本發(fā)明的kp-vr2在2㎎/㎏的劑量對于ht-29結腸癌細胞系顯示約40％提高的生長抑制活性。此外，在kp-vr2(1㎎/㎏)和阿柏西普(kp-vr4)(3㎎/㎏)之間觀察到類似的效果。實施例10-2.lovo體內異種移植使用lovo(atccccl-229tm)細胞系代替ht-29細胞系進行與實施例10-1相同的實驗。將lovo細胞系(5×106個細胞/0.2ml)皮下注射到裸鼠(orientbio、雌性、4周齡)的背部區(qū)域。當腫瘤體積變得大于200mm3時，將kp-vr2(1mg/kg)和kp-vr4(阿柏西普)(1mg/kg)每周兩次分別注射到裸鼠的腹腔中，并且在相同的時間和周期將相同量的pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)注射到陰性對照小鼠的腹腔中。每3至4天測量腫瘤的體積，并在最后第42天提取腫瘤以比較重量。結果公開于圖15a和15b。如圖15a和15b所示，與相同量的阿柏西普(kp-vr4)相比，本發(fā)明的kp-vr2在1mg/kg的劑量對直腸癌細胞系(lovo)具有50％～60％提高的生長抑制活性(p<0.05)。從注射開始時觀察本發(fā)明的kp-vr2的腫瘤生長抑制活性，并且自注射起kp-vr2與阿柏西普(kp-vr4)之間的抑制活性的差異增加。此外，與在相同注射劑量下的阿柏西普相比，注射本發(fā)明的kp-vr2引起約50％減少的腫瘤重量。實施例10-3.skut1b體內異種移植將為vegfr1陽性細胞系的子宮癌skut1b細胞系(atcchtb-115tm)注射到裸鼠中。將skut1b細胞系(1×107個細胞/0.2ml)皮下注射到裸鼠的背部區(qū)域，并且注射后從第1天至第32天每周兩次將kp-vr2(2㎎/㎏)和kp-vr4(阿柏西普)(2㎎/㎏)分別注射到裸鼠的腹腔中。在相同的時間和周期將相同量的pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)注射到陰性對照小鼠的腹腔中。每3至4天觀察腫瘤的體積，并在最后第37天提取腫瘤以比較腫瘤的重量。結果公開于圖16。如圖16a和16b所示，與相同量的阿柏西普(kp-vr4)相比，本發(fā)明的kp-vr2在2㎎/㎏的劑量對本實驗中使用的細胞系具有60％～70％提高的生長抑制活性(p<0.05)。此外，與在相同注射劑量下的阿柏西普相比，注射本發(fā)明的kp-vr2引起約70％減少的腫瘤重量。7.工業(yè)應用如上所述，本發(fā)明的(vegfr)融合蛋白包括(a)igg1的fc結構域，其中兩條重鏈通過二硫鍵連接，和(b)vegfr1的四個免疫球蛋白結構域2，其中兩個免疫球蛋白結構域2被順序地融合到(a)的fc結構域的每條重鏈。因此，本發(fā)明能夠提供用于治療由血管生成引起的癌癥和/或眼病的藥物組合物。<110>韓國普瑞姆藥物股份有限公司<120>血管內皮生長因子融合蛋白<130>ckr0416p-0001-kr<160>3<170>kopatentin3.0<210>1<211>102<212>prt<213>人工序列<220><223>vegfr1結構域2<400>1seraspthrglyargprophevalglumettyrsergluileproglu151015ileilehismetthrgluglyarggluleuvalileprocysargval202530thrserproasnilethrvalthrleulyslyspheproleuaspthr354045leuileproaspglylysargileiletrpaspserarglysglyphe505560ileileserasnalathrtyrlysgluileglyleuleuthrcysglu65707580alathrvalasnglyhisleutyrlysthrasntyrleuthrhisarg859095glnthrasnthrileile100<210>2<211>233<212>prt<213>人工序列<220><223>人igg1fc區(qū)域<400>2alagluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocyspro151015alaprogluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolys202530prolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysval354045valvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyr505560valaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarggluglu65707580glntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhis859095glnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlys100105110alaleuproalaproileglulysthrileserlysalalysglygln115120125proarggluproglnvaltyrthrleuproproserargaspgluleu130135140thrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrpro145150155160seraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasn165170175tyrlysthrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleu180185190tyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnval195200205phesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrgln210215220lysserleuserleuserproglylys225230<210>3<211>103<212>prt<213>人工序列<220><223>vegfr2-d3<400>3aspvalvalleuserproserhisglyilegluleuservalglyglu151015lysleuvalleuasncysthralaargthrgluleuasnvalglyile202530asppheasntrpglutyrproserserlyshisglnhislyslysleu354045valasnargaspleulysthrglnserglyserglumetlyslysphe505560leuserthrleuthrileaspglyvalthrargseraspglnglyleu65707580tyrthrcysalaalaserserglyleumetthrlyslysasnserthr859095phevalargvalhisglulys100當前第1頁12