本發(fā)明涉及一種氮哌酮人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

氮哌酮（azaperone，又稱阿扎哌?。┦且环N丁酰苯類神經(jīng)安定藥。動(dòng)物經(jīng)肌肉注射此藥后可消除緊張感，活動(dòng)力下降，對(duì)環(huán)境淡漠并長(zhǎng)期處于安靜狀態(tài)，有助于避免動(dòng)物因“聚居應(yīng)激”和在混群時(shí)發(fā)生互相攻擊和打斗的現(xiàn)象，降低因應(yīng)激及創(chuàng)傷引起的死亡率，因此在長(zhǎng)途運(yùn)輸中常常給豬等動(dòng)物使用該藥。我國(guó)動(dòng)物性食品中最高殘留限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定豬的肌肉、皮和脂肪、肝、腎中氮哌酮的最大殘留限量值（mrl）分別為60，60，100，100mg/kg。因此，建立快速有效的檢測(cè)氮哌酮含量的方法具有重要意義及市場(chǎng)價(jià)值。

酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測(cè)方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆抗體是免疫學(xué)檢測(cè)的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氮哌酮人工抗原的合成方法，所制備的產(chǎn)品用于氮哌酮免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了必需的人工抗原。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種氮哌酮人工抗原的合成方法，其由4-苯丁酸甲酯與4-氯丁酰氯反應(yīng)得到具有羧基的產(chǎn)物，即半抗原azap，用碳二亞胺法將半抗原azap與載體蛋白偶聯(lián)，即得到氮哌酮人工抗原；步驟為：

（1）半抗原azap的合成：

合成路線如下：

將1.00g4-苯丁酸甲酯(化合物1)，4-氯丁酰氯1.19g，和氯化鋁1.50g，加入10ml二硫化碳中，升溫至室溫并攪拌過(guò)夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得黃色油狀中間產(chǎn)物2；

將1.20g中間產(chǎn)物2，碘化鉀98.5mg，碳酸鉀1.17g，加入12ml乙腈溶液中，加入1-（2-吡啶基）哌嗪700mg，反應(yīng)液升溫至70℃過(guò)夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮；經(jīng)硅膠柱純化得到黃色油狀中間產(chǎn)物3；

將360mg中間產(chǎn)物3，氫氧化鋰90.2mg，加入3ml四氫呋喃和1ml水；反應(yīng)液升溫至室溫，攪拌過(guò)夜；用鹽酸酸化至ph為6，飽和食鹽水水洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得白色固體，制備得半抗原azap；

（2）完全抗原的制備：步驟（1）制備的半抗原azap，與bsa偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原azap-bsa。

步驟（2）所述完全抗原azap-bsa制備方法如下：

a、稱取步驟（1）制得的azap1.8mg，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽2.6mg，n-羥基琥珀酰亞胺1.6mg，用300μl無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h，稱為a液；稱取牛血清蛋白bsa10mg（azap與bsa摩爾比為30：1），加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液）；在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得偶聯(lián)物azap-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物azap-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原azap-bsa。

氮哌酮人工抗原的鑒定

（1）采用核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用偶聯(lián)物中小分子與蛋白的濃度，計(jì)算其偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比測(cè)定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率（偶聯(lián)比率）的方法，雖然測(cè)定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測(cè)偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量（或相對(duì)含量）的原理建立起來(lái)的。紫外法是依據(jù)合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯(lián)比的。

用pbs配制0.5mg/ml的蛋白溶液與完全抗原溶液，以pbs建立基線，在波長(zhǎng)200~500nm間掃描，得到蛋白溶液與完全抗原溶液在半抗原的紫外吸收特征峰處的吸光值分別為a1，a2；用甲醇配制5~50μg/ml的半抗原即為xμg/ml，以甲醇建立基線，在波長(zhǎng)200~500nm間掃描，得到半抗原紫外吸收特征峰處的吸光值a3，半抗原的相對(duì)分子質(zhì)量為m1，蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為m2，則偶聯(lián)比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明成功合成了氮哌酮的人工抗原，合成步驟簡(jiǎn)潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了方便的途徑。

附圖說(shuō)明

圖1半抗原azap的nmr鑒定圖。

圖2半抗原azap的lc-ms鑒定圖。

圖3azap-bsa人工抗原的免疫原紫外鑒定圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1半抗原azap的合成

合成路線如下：

將1.00g4-苯丁酸甲酯(化合物1)，4-氯丁酰氯1.19g，和氯化鋁1.50g，加入10ml二硫化碳中，升溫至室溫并攪拌過(guò)夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得黃色油狀中間產(chǎn)物2；

將1.20g中間產(chǎn)物2，碘化鉀98.5mg，碳酸鉀1.17g，加入12ml乙腈溶液中，加入1-（2-吡啶基）哌嗪700mg，反應(yīng)液升溫至70℃過(guò)夜；向反應(yīng)液中加冰水，二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮；經(jīng)硅膠柱純化得到黃色油狀中間產(chǎn)物3；

將360mg中間產(chǎn)物3，氫氧化鋰90.2mg，加入3ml四氫呋喃和1ml水；反應(yīng)液升溫至室溫，攪拌過(guò)夜；用鹽酸酸化至ph為6，飽和食鹽水水洗一次，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮得白色固體，制備得半抗原azap；

實(shí)施例2完全抗原的制備

制備的半抗原azap與bsa偶聯(lián)得到偶聯(lián)物完全抗原azap-bsa；

a、稱取制備的azap1.8mg，1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽2.6mg，n-羥基琥珀酰亞胺1.6mg，用300μl無(wú)水n,n-二甲基甲酰胺溶解，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4～5h，稱為a液；稱取牛血清蛋白bsa10mg（azap與bsa摩爾比為30：1），加入等體積硼酸緩沖溶液（稱為b液）；在室溫條件，逐滴將a液加入到b液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜，即得偶聯(lián)物azap-bsa混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水沖洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯(lián)物azap-bsa混合液放入透析袋于0.01mol/l的pbs中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原azap-bsa。azap-bsa免疫原的紫外鑒定圖如圖3所示；

實(shí)施例3氮哌酮人工抗原的鑒定

（1）采用核磁共振和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定半抗原。

（2）人工抗原采用紫外法鑒定其偶聯(lián)結(jié)果，利用偶聯(lián)物中小分子與蛋白的濃度，計(jì)算其偶聯(lián)比。

偶聯(lián)比測(cè)定：估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率（偶聯(lián)比率）的方法，雖然測(cè)定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測(cè)偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量（或相對(duì)含量）的原理建立起來(lái)的。紫外法是依據(jù)合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯(lián)比的。

偶聯(lián)物蛋白濃度測(cè)定：將反應(yīng)前蛋白的質(zhì)量除以透析后偶聯(lián)物的體積即可得到偶聯(lián)物中蛋白的含量。

偶聯(lián)物azap-bsa的特征吸收峰在303nm處，此處的吸光值a2=0.589148，bsa在此處的吸光值a1=0.073550，azap的特征吸收峰a3=0.300935，azap的相對(duì)分子質(zhì)量m1=495，bsa的相對(duì)分子質(zhì)量m2=67000，x為50μg/ml，則根據(jù)偶聯(lián)比公式：

偶聯(lián)比=[(a2-a1)(x/m1)/a3]/(0.5/m2)，azap-bsa中半抗原azap與蛋白bsa的偶聯(lián)比為697.8:1。