本發(fā)明屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種人工改造的具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，由于工業(yè)發(fā)展帶來的環(huán)境污染等問題，人類的生存環(huán)境質(zhì)量不斷下降，腫瘤疾病的發(fā)病率和致死率也不斷上升，嚴(yán)重威脅人們的健康和生活。癌癥的發(fā)生與多種原因影響，例如環(huán)境污染、化學(xué)污染、電離輻射、自由基毒素或微生物及其代謝毒素等致癌物的影響，也可能受機體自身的影響，例如遺傳特性、內(nèi)分泌失衡、免疫功能紊亂等也會導(dǎo)致正常細(xì)胞發(fā)生癌變。國際抗癌聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)，世界范圍內(nèi)癌癥死亡比艾滋病、瘧疾和結(jié)核病的總數(shù)還要多，如果不開發(fā)有效藥物，癌癥死亡人數(shù)將到2030年達(dá)到1700萬。目前，世界范圍內(nèi)還沒有開發(fā)出針對肝癌的特效藥物，采取預(yù)防和治療的手段，預(yù)防措施有定期體檢，治療一般臨床上采用化療，不僅患者痛苦而且康復(fù)情況也不樂觀。雖然市場上一些抗癌藥物，但是由于價格昂貴，副作用較強、療效不明顯等原因未能得到醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛使用。美洲大蠊，俗稱蟑螂，其應(yīng)用于藥物中最初是利用其抗菌特性，例如，藍(lán)江林等人報道從美洲大蠊中提取分離的抗菌肽對大腸桿菌有抑菌作用[藍(lán)江林,周先治,卓侃,等，美洲大蠊(periplanetaamericanal.)抗菌肽殺菌作用初步觀察，福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，33(2):166.]。近年來，隨著人們對蟑螂進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)蟑螂提取物具有抗腫瘤方面的應(yīng)用，例如陳利銘等人報道蟑螂提取物at2在抗腫瘤作用中的研究，藥理實驗表明：at2具有抗腫瘤活性，能增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，并能使脾臟重量增加，在體外可增加t淋巴細(xì)胞對cona的轉(zhuǎn)化反應(yīng)(陳利銘，蟑螂提取物at2抗癌作用的臨床及實驗研究，中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，(11):648)。盡管現(xiàn)有技術(shù)中公開了蟑螂中存在有效抗癌的活性成分，但是成功分離純化的抗癌活性成分種類較少，現(xiàn)有技術(shù)中大部分是研究美洲大蠊中活性物質(zhì)的提取方法，例如用醇水混合溶劑提取美洲大蠊蟲體具有抗腫瘤(cn101057872；zl200710067706.x；zl200810059054.x)和體外抗單純皰疹病毒的功效(zl200810060885.9)；以及用濾孔小于5000道爾頓(即<5kda)的超濾膜進(jìn)行分離，能得到新的抗單純皰疹病毒和光譜抗菌活性部位(zl201210137422.4；zl201210137410.1)。這些提取物對進(jìn)一步制備抗癌藥物存在較大影響，例如提取物中的雜質(zhì)容易引起超敏反應(yīng)，限制了用藥的途徑，同時進(jìn)一步分離純化還會大大降低藥物的療效。因此，目前對美洲大蠊中單一成分的活性物質(zhì)的研究不多，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足醫(yī)藥市場的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列及其應(yīng)用，不僅具有抗肝癌活性，而且還能夠方便經(jīng)濟地以人工合成方式大量生產(chǎn)。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了所述的美蠊肽a人工序列在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述美蠊肽a人工序列通過抑制vegf蛋白的表達(dá)從而抑制血管生成和/或腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，達(dá)到抗肝癌的目的。優(yōu)選的，藥物的劑型為注射劑或凍干粉。優(yōu)選的，所述注射劑包括美蠊肽a人工序列和藥用輔料。優(yōu)選的，所述注射劑中美蠊肽a人工序列的質(zhì)量濃度為6.25～200μg/ml。優(yōu)選的，所述注射劑中美蠊肽a人工序列的質(zhì)量濃度為25～150μg/ml。優(yōu)選的，所述藥用輔料為質(zhì)量濃度0.9％的氯化鈉溶液。本發(fā)明提供了一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。所述美蠊肽a人工序列能有效抑制肝癌細(xì)胞hepg2的細(xì)胞增殖和遷移，并且抑制強度隨著美蠊肽a人工序列的濃度增加而增大。與其他美洲大蠊提取物(醇提物脫脂膏和大孔樹脂60％醇水洗脫部位cⅱ-3)相比，美蠊肽a人工序列抑制hepg2增殖的作用具有明顯的優(yōu)勢；與沙利度胺陽性對照相比，美蠊肽a人工序列具有相同或相似的抗肝癌作用。本發(fā)明提供的美蠊肽a人工序列為多肽，能夠方便經(jīng)濟地以人工合成方式大量生產(chǎn)，從而擺脫活性物質(zhì)來源的限制，能夠滿足市場和生產(chǎn)的需求。本發(fā)明提供的所述的美蠊肽a人工序列在制備預(yù)防或治療抗肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的應(yīng)用沒有發(fā)現(xiàn)有毒副作用；具有用量小、安全、長期穩(wěn)定，機體無排除反應(yīng)等優(yōu)點。附圖說明圖1為實施例3中美蠊肽a人工序列對hepg2劃痕愈合率情況；圖2為對比例3中cⅱ-3對hepg2劃痕愈合率情況；圖3為對比例4中脫脂膏對hepg2劃痕愈合率情況。具體實施方式本發(fā)明提供了一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列，具有如序列表seqidno.1所示的氨基酸序列。本發(fā)明中，所述具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的多肽合成方法即可。本發(fā)明實施例中，所述美蠊肽a人工序列的來源委托生工生物工程(上海)股份有限公司按照seqidno.1所示的氨基酸序列合成。本發(fā)明中，所述美蠊肽a人工序列的設(shè)計方法包括以下步驟：在具有抗癌活性的美蠊肽a的n端的12個氨基酸殘基序列“nh2-thr-val-tyr-ser-arg-cys-gly-leu-val-gln-ala-lys-cooh”的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，具體是將所述序列的第6位的“cys”改造成“arg”，第8位的“l(fā)eu”改造成“asp”，并且刪除第11位的“ala”，形成美蠊肽a人工序列“thr-val-tyr-ser-arg-arg-gly-asp-val-gln-lys”。本發(fā)明中，美蠊肽a人工序列的分子量為1308.46da。所述美蠊肽a人工序列具有較好的水溶性。本發(fā)明還提供了所述的美蠊肽a人工序列在制備預(yù)防或治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，所述美蠊肽a人工序列抗肝癌的機理：通過抑制vegf蛋白的表達(dá)從而抑制血管生成和/或腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，達(dá)到抗肝癌的目的。本發(fā)明中，藥物的劑型優(yōu)選為注射劑或凍干粉，更優(yōu)選為注射劑。本發(fā)明中，所述注射劑優(yōu)選包括美蠊肽a人工序列和藥用輔料。本發(fā)明中，所述注射劑中美蠊肽a人工序列的質(zhì)量濃度優(yōu)選為6.25～200μg/ml，更優(yōu)選為25～150μg/ml，最優(yōu)選為100μg/ml。本發(fā)明中，所述藥用輔料優(yōu)選為質(zhì)量濃度的0.9％的氯化鈉溶液。本發(fā)明中，所述注射劑的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的注射劑的制備方法即可。本發(fā)明中，所述注射劑的注射劑量為250～2000ml/d，更優(yōu)選為500ml/d。所述注射劑的注射的間隔時間優(yōu)選為6～36h，更優(yōu)選為24h。。本發(fā)明中，所述凍干粉使用時，優(yōu)選配置成的注射液中美蠊肽a人工序列的質(zhì)量濃度優(yōu)選為6.25～150μg/ml，更優(yōu)選為25～100μg/ml。本發(fā)明中，除注射劑的藥物其他劑型的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備方法即可。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列及其應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實施例1美蠊肽a人工序列是在美蠊肽a的基礎(chǔ)上經(jīng)過人工改造制備得到。美蠊肽a是存在于美洲大蠊藥材中。所述美蠊肽a的提取方法包括以下步驟：將美洲大蠊藥材經(jīng)溶劑提取后，再經(jīng)反相柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、凝膠電泳及膠內(nèi)回收等反復(fù)提取分離后，得到含有美蠊肽a的樣品。美蠊肽a的n端的12個氨基酸殘基序列“nh2-thr-val-tyr-ser-arg-cys-gly-leu-val-gln-ala-lys-cooh”的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，具體是將所述序列的第6位的“cys”改造成“arg”，第8位的“l(fā)eu”改造成“asp”，并且刪除第11位的“ala”，形成美蠊肽a人工序列。將美蠊肽a人工序列的理化性質(zhì)如下所示：氨基酸殘基個數(shù):111字符:tvysrrgdvqk3字符:thr-val-tyr-ser-arg-arg-gly-asp-val-gln-lys分子量:1308.46g/mol等電點:10.5ph＝7時的凈電荷:2.0平均親水性:0.6親水殘基比例:55％將美蠊肽a人工序列送入ncbi數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)性比對檢索鑒定。ncbiblast在線序列比對軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)搜索比對結(jié)果顯示：與美蠊肽b最近似的為一個克雷伯桿菌肺炎鏈球菌的型限制性內(nèi)切酶亞基s(restrictionendonucleasesubunitsklebsiellaoxytoc])，且其最高得分(maxscore)只有32.0，而期望值(evalve)為3.9；由于其得分較低且期望值較高，提示數(shù)據(jù)庫中并沒有與美蠊肽a人工序列同源性高的多肽或蛋白質(zhì)，即沒有檢索到與之相匹配的多肽，顯示美蠊肽a人工序列應(yīng)該為一種未報道的新多肽。將美蠊肽a人工序列的多肽序列委托給生工生物(上海)股份有限公司合成。得到的多肽經(jīng)過注射用水配置成濃度為1mg/ml的母液，保存于4℃環(huán)境中，實驗時用培養(yǎng)基將藥物母液稀釋到所需濃度即可。實施例21、人肝癌hepg2細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌hepg2細(xì)胞株采用含10％的胎牛血清的高糖dmem完全培養(yǎng)基，置于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。2、mtt法檢測用藥后人肝癌細(xì)胞hepg2細(xì)胞存活率hepg2細(xì)胞種板(1×105ml-1，100μl)接種于96孔板，培養(yǎng)24h。配置成濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、150μg/ml的美蠊肽a人工序列溶液，用上述6個濃度的美洲大蠊多肽溶液進(jìn)行干預(yù)，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，每孔200μl，同時設(shè)置沙利度胺(濃度為100μg/ml，200μg/ml)陽性對照組和空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24h。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm檢測各孔吸光度值a。按下式計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率ir(％)＝[1-a加藥組/a空白對照組]×100％。3、統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)處理采用spss17.0統(tǒng)計軟件和originpro8.6作圖軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對比例1以美洲大蠊cⅱ-3(美洲大蠊醇提物經(jīng)大孔樹脂吸附、60％乙醇水洗脫的活性部位，黃褐色凍干粉末，大理大學(xué)劉光明教授提供)替換實施例2中的美蠊肽a人工序列溶液，將cⅱ-3濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(25、50、100μg/ml)，按照實施例2的方法處理hepg2細(xì)胞，計算抑制率。對比例2以美洲大蠊脫脂膏(褐色粘稠膏狀，美洲大蠊醇提物經(jīng)高溫脫脂而得，大理大學(xué)劉光明教授提供)替換實施例2中的美蠊肽a人工序列溶液，將脫脂膏濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(25、50、100μg/ml)，按照實施例2的方法處理hepg2細(xì)胞，計算抑制率。實施例2、對比例1和對比文件2的抑制率結(jié)果見表1。表1美蠊肽a人工序列以及陽性對照對hepg2細(xì)胞增殖的影響(n＝3)各組培養(yǎng)24、48和72h的細(xì)胞抑制率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點測量的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f＝4247.101，p＝0.000)；②不同藥物處理后的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f＝2460.773，p＝0.000)；③各組的細(xì)胞抑制率變化趨勢有差異(f＝85.030，p＝0.000)。從用藥濃度看，同一時間的美蠊肽a人工序列、cⅱ-3、脫脂膏對hepg2細(xì)胞增殖的抑制率呈濃度依賴性。100μg/ml和200μg/ml的沙利度胺對hepg2細(xì)胞的增殖抑制率亦呈時間依賴關(guān)系，其中以72h抑制率為最高。不同時間時間點的各藥之間作用比較，美蠊肽a人工序列抑制hepg2增殖的作用優(yōu)于脫脂膏和cⅱ-3，相較于脫脂膏，美蠊肽a人工序列抑制率提高了23.63％～64.65％，相較于cⅱ-3，美蠊肽a人工序列抑制率最高提高了51.14％～116.3％。實施例3細(xì)胞劃痕實驗檢測美洲大蠊提取物對hepg2細(xì)胞的遷移抑制情況實驗分組：空白對照組、沙利度胺對照組(濃度為100μg/ml，200μg/ml)、美蠊肽a人工序列設(shè)置為低、中、高劑量組(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)。hepg2細(xì)胞常規(guī)消化，按密度為2×105ml-1接種于6孔板，每孔2ml。培養(yǎng)24h后，用200μl槍頭在6孔板底部劃一條直線，pbs洗滌2～3次，按實驗分組加入藥物。分別對0h，24h的劃痕進(jìn)行拍照，并測量劃痕寬度。以上實驗重復(fù)三次，取平均值計算劃痕愈合率。劃痕愈合率＝(0h劃痕寬度-24h劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100％。數(shù)據(jù)處理采用spss17.0統(tǒng)計軟件和originpro8.6作圖軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析；p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對比例3以美洲大蠊cⅱ-3(黃褐色凍干粉末)替換實施例3中的美蠊肽a人工序列溶液，將cⅱ-3濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(37.5、75、150μg/ml)，按照實施例3的方法處理hepg2細(xì)胞，計算愈合率。對比例4以美洲大蠊脫脂膏替換實施例3中的美蠊肽a人工序列溶液，將脫脂膏濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(37.5、75、150μg/ml)，按照實施例3的方法處理hepg2細(xì)胞，計算愈合率。實施例3、對比例1和對比文件2的細(xì)胞遷移的影響見表2。表2美蠊肽a人工序列及對比例3和對比例4對hepg2細(xì)胞遷移的影響(n＝3)注：與對照組相比，ap<0.05；與沙利度胺相比，bp<0.05；與低劑量組相比，cp<0.05；與中劑量組相比，dp<0.05。實施例3、對比例1和對比文件2的劃痕愈合率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f＝433.771，p＝0.000)。與對照組、沙利度胺組比較，經(jīng)過美蠊肽a人工序列、cⅱ-3、脫脂膏處理后，hepg2細(xì)胞的劃痕愈合率降低，并且隨著濃度的增加，劃痕愈合率逐漸減小，抑制細(xì)胞遷移具有濃度依賴性(見表2)。劃痕24h后，各組hepg2細(xì)胞發(fā)生了明顯遷移，劃痕區(qū)域與0h相比明顯變窄，說明細(xì)胞hepg2細(xì)胞在劃痕后能自動愈合。然而，在經(jīng)過不同劑量的美蠊肽a人工序列、cⅱ-3、脫脂膏和200μg/ml沙利度胺干預(yù)24h后，hepg2細(xì)胞的遷移距離均明顯減小，劃痕愈合率逐漸減小。美蠊肽a人工序列的愈合率相比對照組，愈合率降低了64.56％，而與cⅱ-3和脫脂膏相比愈合率較為接近。實施例4elisa實驗檢測美洲大蠊提取物對細(xì)胞中vegf蛋白表達(dá)的影響hepg2細(xì)胞常規(guī)消化，以1×105個/ml的密度接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，按實施例3的實驗分組方法加入不同濃度的美蠊肽a人工序列溶液，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，每孔200μl。同時設(shè)置空白對照組和陽性對照組。分別培養(yǎng)24h和48h后收集細(xì)胞上清，3000rpm離心15min，取上清，保存于-20℃?zhèn)溆?。按照elisa試劑盒說明書(深圳欣博盛生物科技有限公司)進(jìn)行試驗，酶標(biāo)儀檢測450nm處各孔o(hù)d值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，od值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對應(yīng)的od值，即可算出樣品vegf的濃度。對比例5以cⅱ-3替換實施例4中的美蠊肽a人工序列溶液，將cⅱ-3濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(25、50、100μg/ml)，按照實施例4的方法計算vegf的濃度。對比例6以脫脂膏替換實施例4中的美蠊肽a人工序列溶液，將脫脂膏濃度設(shè)置為低、中、高劑量組(25、50、100μg/ml)，按照實施例4的方法計算vegf的濃度。實施例4、對比例5和對比例6的vegf含量見表3。表3美蠊肽a人工序列、對比例5和對比例6處理后hepg2細(xì)胞中vegf的含量(n＝3)各組培養(yǎng)24和48h后vegf含量比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點測量的vegf含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f＝4773.712，p＝0.000)；②不同藥物處理后的vegf含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f＝45.148，p＝0.000)；③各組的vegf含量抑制率變化趨勢有差異(f＝4.917，p＝0.001)。與對照組相比，美蠊肽a人工序列作用24h后，hepg2細(xì)胞上清中vegf的含量降低，且呈濃度依賴性。低劑量和中劑量的美洲大蠊cⅱ-3對hepg2細(xì)胞上清中vegf的表達(dá)無明顯作用，而高劑量的cⅱ-3促進(jìn)vegf的表達(dá)。低劑量和中劑量的脫脂膏對vegf的表達(dá)有下調(diào)作用，但隨著濃度增大，vegf的表達(dá)反而增多。各藥之間作用比較，美蠊肽a人工序列下調(diào)vegf含量作用優(yōu)于脫脂膏和cⅱ-3(見表3)。與空白對照相比，美蠊肽a人工序列對vegf表達(dá)的抑制率達(dá)到18.15％，而cⅱ-3與空白對照相比，對vegf表達(dá)沒有任何抑制作用，反而促進(jìn)vegf表達(dá)，促進(jìn)率得到58.74％，脫脂膏與空白對照相比，對vegf表達(dá)微弱抑制，抑制率僅為0.4％，由此可見，美蠊肽a人工序列相對于脫脂膏，對vegf表達(dá)抑制率達(dá)到46倍。隨著時間延長，作用48h后，各組hepg2細(xì)胞上清中vegf的含量增多，但是經(jīng)過美蠊肽a人工序列作用后，vegf的含量下降。而cⅱ-3和脫脂膏作用后，vegf的含量在一定程度上增加。這說明美蠊肽a人工序列能夠有效抑制vegf蛋白的表達(dá)，抑制效果上，優(yōu)于cⅱ-3和脫脂膏。與空白對照相比，美蠊肽a人工序列對vegf表達(dá)的抑制率達(dá)到16.60％，而cⅱ-3和脫脂膏與空白對照相比，對vegf表達(dá)沒有任何抑制作用，反而促進(jìn)vegf表達(dá)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>大理大學(xué)<120>一種具有抗肝癌活性的美蠊肽a人工序列及其應(yīng)用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列<400>1thrvaltyrserargargglyaspvalglnlys1510當(dāng)前第1頁12