本發(fā)明涉及多肽藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種純化分離阿托西班的方法。
背景技術(shù)：
阿托西班是一種合成的9肽，英文名為：atosiban，為一種環(huán)狀多肽，其序列如下：
c[mpa-d-tyr(et)-ile-thr-asn-cys]-pro-orn-gly-nh2
阿托西班是婦產(chǎn)科藥物中的一種突破產(chǎn)品，它是一種催產(chǎn)素類似物，是子宮內(nèi)基蛻膜、胎膜上受體的催產(chǎn)素競爭性拮抗劑，可以直接與催產(chǎn)素競爭催產(chǎn)素受體，抑制催產(chǎn)素和催產(chǎn)素受體結(jié)合，從而直接抑制催產(chǎn)素作用于子宮，抑制子宮收縮；也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用，阻斷第二信使的生成以及ca2+的活動，從而間接抑制子宮對催產(chǎn)素的反應，使子宮收縮得到抑制，達到保胎的目的。在中國，年出生率約2000萬，按目前臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)，約10-15％的孕婦需要進行保胎治療，按10％計算，病人數(shù)量約為200萬。
gly9-oh-阿托西班和asp5-阿托西班均有較大的毒性，且在阿托西班合成過程中，上述2種雜質(zhì)的比例較高。
gly9-oh-阿托西班序列如下
c[mpa-d-tyr(et)-ile-thr-asn-cys]-pro-orn-gly-oh
asp5-阿托西班序列如下：
c[mpa-d-tyr(et)-ile-thr-asp-cys]-pro-orn-gly-nh2
現(xiàn)有技術(shù)中，專利cn103421092采用陽離子交換方法對gly9-oh-阿托西班雜質(zhì)進行分離。對asp5-阿托西班雜質(zhì)的分離尚未有報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種純化分離阿托西班的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種純化分離阿托西班的方法，包括如下步驟：
步驟1、將阿托西班粗品用乙腈水溶液溶解，濾膜過濾，得到粗品溶液待用；
步驟2、使用流動相a：磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的水溶液平衡反相色譜柱；
步驟3、將步驟1的粗品溶液載入反相色譜柱；
步驟4、采用流動相a：磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的水溶液、流動相b：乙腈進行梯度洗脫，并收集洗脫峰；
步驟5、將收集的純度大于99.7％目的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，得到濃縮液待用；
步驟6、將步驟5的濃縮液轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液；
步驟7、將步驟6轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，后進行冷凍干燥得到阿托西班成品。
進一步地，步驟2和步驟4中流動相a中磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.05wt％～6.0wt％，ph值為4.0-6.0。
進一步地，步驟2和步驟4中流動相a中磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.1wt％-1.0wt％，ph值為4.5-5.5。
進一步地，步驟4按體積分數(shù)設(shè)置流動相梯度，0到60分鐘a：b由85～65：15～35到45～25：55～75。
進一步地，步驟1中阿托西班粗品純度不低于55％，asp5-阿托西班含量不高于2％，gly9-oh-阿托西班含量不高于5％。
進一步地，步驟1乙腈水溶液為20v/v％乙腈水溶液。
進一步地，步驟1用孔徑為0.45μm濾膜過濾。
進一步地，反相色譜柱內(nèi)的固定相為反相c18填料。
進一步地，步驟6用0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液平衡反相色譜柱后，將步驟5的濃縮液上樣至反相色譜柱中，0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液洗脫，收集洗脫液即轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液。
進一步地，平衡、洗脫、沖洗反相色譜柱的流速根據(jù)反相色譜柱的規(guī)格進行設(shè)定，2*25cm反相色譜柱采用5～20ml/min的流速，其它規(guī)格的反相色譜柱流速線性放大。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明采用反相c18柱、磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀緩沖體系(ph＝4.0-6.0)進行純化分離。此純化方法能有效分離阿托西班生產(chǎn)過程中的難分離工藝雜質(zhì)：asp5-阿托西班，即阿托西班5號位的氨基酸asn脫酰胺變成asp；gly9-oh-阿托西班，即阿托西班脫酰胺雜質(zhì)?？捎行Ы鉀Q現(xiàn)有技術(shù)中由于asp5-阿托西班和gly9-oh-阿托西班未有效分離而造成收率低的難題，大大提高了純化收率，收率高達55％，降低生產(chǎn)成本，且所得阿托西班產(chǎn)物純度高達99.7％，毒性雜質(zhì)被完全分離，提高了藥品的安全性。獲得的產(chǎn)品穩(wěn)定性好，可應用于工業(yè)化生產(chǎn)。此純化分離方法具有良好的經(jīng)濟價值和廣泛的應用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做更進一步地解釋。下列實施例僅用于說明本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明的實施范圍。
一種純化分離阿托西班的方法，包括如下步驟：
步驟1、將阿托西班粗品用20v/v％乙腈水溶液溶解，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，得到粗品溶液待用；其中，阿托西班粗品純度不低于55％，asp5-阿托西班含量不高于2％，gly9-oh-阿托西班含量不高于5％。
步驟2、使用流動相a：磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的水溶液平衡反相色譜柱；其中，反相色譜柱內(nèi)的固定相為反相c18填料；平衡、洗脫、沖洗反相色譜柱的流速根據(jù)反相色譜柱的規(guī)格進行設(shè)定，通常2*25cm反相色譜柱采用5～20ml/min的流速，其它規(guī)格的反相色譜柱流速線性放大即可。
步驟3、將步驟1的粗品溶液載入反相色譜柱。
步驟4、采用流動相a：磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的水溶液、流動相b：乙腈，按體積分數(shù)設(shè)置流動相梯度，0到60分鐘a：b由85～65：15～35到45～25：55～75，進行梯度洗脫，并收集洗脫峰。其中，流動相a中磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.05wt％～6.0wt％，ph值為4.0-6.0；鹽濃度過低或過高均影響分離效果；ph值過高或過低，亦影響毒性雜質(zhì)的分離，在此ph值下既可以保證分離度，也可以保證收集液的穩(wěn)定性。優(yōu)選地，磷酸二氫鈉或磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度為0.1wt％-1.0wt％，ph值為4.5-5.5。
步驟5、將收集的純度大于99.7％目的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，得到濃縮液待用。
步驟6、將步驟5的濃縮液轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液：用0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液平衡反相色譜柱后，將步驟5的濃縮液上樣至反相色譜柱中，0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.1v/v～1v/v％醋酸水溶液洗脫，收集洗脫液即轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液。
步驟7、將步驟6轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，后進行冷凍干燥得到阿托西班成品。
根據(jù)阿托西班序列，采用固相合成法逐步偶聯(lián)獲得阿托西班肽樹脂，經(jīng)裂解后得到450g阿托西班粗品，其純度為59％，asp5-阿托西班含量為1.6％，gly9-阿托西班含量為3.4％，用于以下實施例。
實施例1
1、取阿托西班粗品100g，每克阿托西班粗品溶解于200ml20v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，待粗品完全溶解后，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。
2、使用流動相a平衡反相色譜柱，流動相a：0.6wt％磷酸二氫鈉水溶液(氫氧化鈉調(diào)ph值至5.5)，流速800ml/min。檢測波長220nm。反相色譜柱規(guī)格為：20*25cm，柱內(nèi)的固定相為反相c18填料。
3、將步驟1的濾液載入到反相色譜柱中。
4、用b(乙腈)％：25-65％(60min)的梯度進行洗脫，收集洗脫峰。
5、將收集的純度大于99.7％目的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，至約50mg/ml后備用。
6、將反相色譜柱用0.3v/v％醋酸水溶液平衡后上樣，上樣后用0.3v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.3v/v％醋酸水溶液洗脫，收集轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液。
7、將步驟6轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮至約50mg/ml，轉(zhuǎn)至大小合適的不銹鋼盤中，冷凍干燥后得到純度大于99.7％的阿托西班，收率為49％。本實施例制備的成品阿托西班未檢測出asp5-阿托西班和gly9-阿托西班。
實施例2
1、取阿托西班粗品80g，每克阿托西班粗品溶解于200ml20v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，待粗品完全溶解后，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。
2、使用流動相a平衡反相色譜柱，流動相a：1.0wt％磷酸二氫鈉水溶液(磷酸調(diào)ph值至4.5)，流速600ml/min。檢測波長220nm。反相色譜柱規(guī)格為：20*25cm，柱內(nèi)的固定相為反相c18填料。
3、將步驟1的濾液載入到反相色譜柱中。
4、用b(乙腈)％：21-61％(60min)的梯度進行洗脫，收集洗脫峰。
5、將收集的純度大于99.7％目的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，至約50mg/ml后備用。
6、將反相色譜柱用0.5v/v％醋酸水溶液平衡后上樣，上樣后用0.5v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的0.5v/v％醋酸水溶液洗脫，收集轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液。
7、將步驟6轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮至約50mg/ml，轉(zhuǎn)至大小合適的不銹鋼盤中，冷凍干燥后得到純度大于99.7％的阿托西班，收率為52％。本實施例制備的成品阿托西班未檢測出asp5-阿托西班和gly9-阿托西班。
實施例3
1、取阿托西班粗品60g，每克阿托西班粗品溶解于200ml20v/v％乙腈水溶液中，超聲處理，待樣品完全溶解后，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，收集濾液待用。
2、使用流動相a平衡反相色譜柱，流動相a：0.7wt％磷酸二氫鉀水溶液(氫氧化鉀調(diào)ph值至5.0)，流速1000ml/min。檢測波長220nm。反相色譜柱規(guī)格為：20*25cm，柱內(nèi)的固定相為反相c18填料。
3、將步驟1的濾液載入到反相色譜柱中。
4、用b(乙腈)％：25-65％(60min)的梯度進行洗脫，收集洗脫峰。
5、將收集的純度大于99.7％目的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮，至約50mg/ml后備用。
6、將反相色譜柱用1v/v％醋酸水溶液平衡后上樣，上樣后用1v/v％醋酸水溶液沖洗柱子3個柱體積；再用50％的乙腈和50％的1v/v％醋酸水溶液洗脫，收集轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液。
7、將步驟6轉(zhuǎn)成醋酸鹽的肽溶液于不超過35℃下進行減壓旋蒸濃縮至約50mg/ml，轉(zhuǎn)至大小合適的不銹鋼盤中，冷凍干燥后得到純度大于99.7％的阿托西班，收率為55％。本實施例制備的成品阿托西班未檢測出asp5-阿托西班和gly9-阿托西班。
本發(fā)明方法可完全分離阿托西班中的毒性雜質(zhì)：asp5-阿托西班和gly9-oh-阿托西班，在提高產(chǎn)品收率的同時提高了藥品的安全性。且此純化方法下獲得的樣品穩(wěn)定性好，可應用于工業(yè)化生產(chǎn)。