本發(fā)明涉及生物制品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

螺旋藻(spirulinaplatensis)是一類低等植物，屬于藍(lán)藻門(cyanophyta)、顫藻科(oscillatoriaceae)。它們與細(xì)菌一樣，細(xì)胞內(nèi)沒有真正的細(xì)胞核，所以又稱藍(lán)細(xì)菌。螺旋藻通常為多細(xì)胞構(gòu)成的絲狀體、圓柱狀，呈疏松或緊密而規(guī)則的螺旋狀彎曲，但形狀往往受生長環(huán)境的影響而發(fā)生改變，有的甚至產(chǎn)生穩(wěn)定的直線形變異。螺旋藻性喜高溫（25－36℃）、高堿（ph8~12），營光合自養(yǎng)，但也能利用環(huán)境中的一些有機(jī)物作兼養(yǎng)生長，行無性繁殖，通常依靠藻絲體中橫隔的產(chǎn)生或藻絲體中偽空胞的產(chǎn)生而形成藻殖段。螺旋藻含有大量蛋白質(zhì)、極其豐富均衡的營養(yǎng)成分和多種生物活性物質(zhì)，其細(xì)胞壁幾乎不含纖維素，因此極易被人體消化吸收，研究表明螺旋藻的消化吸收率在94%以上，其蛋白消化率達(dá)75%，是一種優(yōu)良的純天然食品，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織推薦為“全球人類最理想的食品”。螺旋藻蛋白質(zhì)含量高達(dá)50－70%，由18種氨基酸組成，其中人體與動(dòng)物所必須的8種氨基酸的含量接近或超過了fao推薦的標(biāo)準(zhǔn)，是自然界中具有重大開發(fā)價(jià)值的食用和餌料蛋白資源，具有一定的醫(yī)療保健作用。螺旋藻還含有七種維生素，其中維生素e是一種天然抗氧化劑，β－胡蘿卜素是活性最高的維生素a源，維生素a是一種自由基清除劑，對(duì)腫瘤(尤其是上皮組織癌變)的防治有明顯效果。螺旋藻多糖和藻膽蛋白更有著顯著的生理活性和多方面的藥用價(jià)值，如防治腫瘤和潰瘍、提高機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生等。綜上所述，螺旋藻及其活性成分在功能性食品研究與開發(fā)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為cn103044520b的中國發(fā)明專利，公開了一種節(jié)旋藻蛋白的分離純化方法，具體方法是將藻粉在pbs中充分浸泡，混勻后常溫下避光放置24-72小時(shí)離心，收集上清液；將上清液經(jīng)濾膜進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液中加入甲殼胺使混合液ph達(dá)到6.5-7.2，并進(jìn)行攪拌；上述攪拌均勻的混合液離心取上清液，上清液中加入水經(jīng)濾膜進(jìn)行超濾濃縮，超濾置換鈉離子得到純化濃縮液；濃縮液噴霧干燥，即得藥品級(jí)節(jié)旋藻蛋白。該方法生產(chǎn)成本低，簡單有效，適合制備藥品級(jí)節(jié)旋藻蛋白，但是制備效率低，節(jié)旋藻蛋白得率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種活性蛋白提取效率高、得率高、純度高、能耗低、對(duì)環(huán)境友好的鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法。

本發(fā)明針對(duì)上述技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法，包括粗蛋白的提取、鹽析、透析、純化，具體步驟為：

粗蛋白的提?。喊戳弦罕葹?:2~3在藻粉中加入蒸餾水，抽濾，去離子水洗滌2~3次，加入ph為6.5~7、濃度為0.008~0.012mol/l的磷酸鹽緩沖液和活性多肽，藻粉與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為1:14~16，攪拌110~130min，在-22~-20℃快速冷凍，然后在3~5℃下解凍，反復(fù)凍融3~4次，在3~5℃、10000~12000rpm下高速冷凍離心28~33min，上清液即為粗蛋白液，活性蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì)，首先要破碎細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜使其溶出，細(xì)胞破碎程度越高，活性蛋白的得率也越高，反復(fù)凍融法利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液鹽濃度增高引起溶脹使細(xì)胞破碎，操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，該步驟采用蛋白肽和反復(fù)凍融法相結(jié)合，提高粗蛋白提取的工作效率和活性蛋白的得率；

鹽析：向粗蛋白液中加入濃度為1.8~2.2wt%的殼聚糖溶液，藻粉與殼聚糖溶液的重量體積比為1:4~6，調(diào)節(jié)ph至6.5~7，攪拌20~25min，在3~5℃、10000~12000rpm下高速冷凍離心28~33min，將上清液放入冰水浴中，加入硫酸銨使其濃度為50~55wt%，攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置過夜后低溫離心，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，排除氣泡，封口，置于磷酸鹽緩沖液中透析，更換緩沖液4~6次，袋內(nèi)溶液即為透析液，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到分離小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

純化：將用緩沖液浸泡10~12h的羥基磷灰石裝入含有預(yù)加緩沖液和的柱子中，加入透析液，完全進(jìn)入柱體后，加入緩沖液洗脫，冷凍干燥，即得鈍頂螺旋藻活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生，并且具有顯著的抗腫瘤活性。

作為優(yōu)選，活性多肽的添加量為藻粉的0.5~0.8%，活性多肽的氨基酸序列為hshacasysrcycrclrcrpgcvncyrcsr，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率。

作為優(yōu)選，層析柱規(guī)格為直徑2~3cm，長48~52cm，緩沖液選用ph為6.5~7、濃度為0.008~0.012mol/l的磷酸鹽緩沖液和0.1~0.12mol/l的kcl緩沖液，流速為0.6~0.8ml/min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明采用活性蛋白肽和反復(fù)凍融法提取粗蛋白相結(jié)合的方法提取活性蛋白，提高了提取效率和活性蛋白的得率，操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備；本發(fā)明制得的活性蛋白純度高，顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生，并且具有顯著的抗腫瘤活性。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1：

鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法，包括粗蛋白的提取、鹽析、透析、純化，具體步驟為：

1）粗蛋白的提?。喊戳弦罕葹?:3在藻粉中加入蒸餾水，用布氏漏斗抽濾，去離子水洗滌3次，加入ph為6.7、濃度為0.008mol/l的磷酸鹽緩沖液和活性多肽，藻粉與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為1:15，攪拌120min，在-20℃快速冷凍，然后在4℃下解凍，反復(fù)凍融3次，在4℃、12000rpm下高速冷凍離心30min，上清液即為粗蛋白液，活性蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì)，首先要破碎細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜使其溶出，細(xì)胞破碎程度越高，活性蛋白的得率也越高，反復(fù)凍融法利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液鹽濃度增高引起溶脹使細(xì)胞破碎，操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，該步驟采用蛋白肽和反復(fù)凍融法相結(jié)合，提高粗蛋白提取的工作效率和活性蛋白的得率；

2）鹽析：向粗蛋白液中加入濃度為2wt%的殼聚糖溶液，藻粉與殼聚糖溶液的重量體積比為1:5，調(diào)節(jié)ph至6.7，攪拌20min，在4℃、12000rpm下高速冷凍離心30min，將上清液放入冰水浴中，加入硫酸銨使其濃度為52wt%，攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置過夜，在4℃、12000rpm下高速冷凍離心30min，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）透析：將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，排除氣泡，封口，置于磷酸鹽緩沖液中透析，更換緩沖液5次，袋內(nèi)溶液即為透析液，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到分離小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

4）純化：將用緩沖液浸泡12h的羥基磷灰石裝入含有預(yù)加緩沖液和的柱子中，加入透析液，完全進(jìn)入柱體后，加入緩沖液洗脫，冷凍干燥，即得鈍頂螺旋藻活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生，并且具有顯著的抗腫瘤活性。

上述活性多肽的添加量為藻粉的0.6%，活性多肽的氨基酸序列為hshacasysrcycrclrcrpgcvncyrcsr，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率。

上述層析柱規(guī)格為直徑2.5cm，長50cm，緩沖液選用ph為6.7、濃度為0.008mol/l的磷酸鹽緩沖液和0.1mol/l的kcl緩沖液，流速為0.8ml/min。

實(shí)施例2：

鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法，具體步驟為：

1）按料液比為1:2.5在藻粉中加入蒸餾水，抽濾，去離子水洗滌3次，加入ph為7、濃度為0.012mol/l的磷酸鹽緩沖液和活性多肽，藻粉與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為1:14，攪拌110min，在-22℃快速冷凍，然后在5℃下解凍，反復(fù)凍融4次，高速冷凍離心，上清液即為粗蛋白液，活性蛋白屬于胞內(nèi)蛋白質(zhì)，首先要破碎細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜使其溶出，細(xì)胞破碎程度越高，活性蛋白的得率也越高，反復(fù)凍融法利用細(xì)胞內(nèi)冰粒的形成和細(xì)胞液鹽濃度增高引起溶脹使細(xì)胞破碎，操作簡單，不需要特殊的儀器設(shè)備，該步驟采用蛋白肽和反復(fù)凍融法相結(jié)合，提高粗蛋白提取的工作效率和活性蛋白的得率；

2）向粗蛋白液中加入濃度為2.2wt%的殼聚糖溶液，藻粉與殼聚糖溶液的重量體積比為1:6，調(diào)節(jié)ph至7，攪拌20min，高速冷凍離心，將上清液放入冰水浴中，加入硫酸銨使其濃度為55wt%，攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置過夜后低溫離心，即得鹽析沉淀物，該步驟中加入大量的硫酸銨，使蛋白質(zhì)得溶解度降低而沉淀析出，該方法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化具有連續(xù)性，鹽析效果好，節(jié)約能耗；

3）將鹽析沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，排除氣泡，封口，置于磷酸鹽緩沖液中透析，更換緩沖液5次，袋內(nèi)溶液即為透析液，該方法利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過透析袋，而大分子物質(zhì)不能通過透析袋的性質(zhì)，達(dá)到分離小分子雜質(zhì)的目的，操作簡單，效果好，節(jié)約能耗；

4）將用緩沖液浸泡11h的羥基磷灰石裝入含有預(yù)加緩沖液和的柱子中，加入透析液，完全進(jìn)入柱體后，加入緩沖液洗脫，冷凍干燥，即得鈍頂螺旋藻活性蛋白，該活性蛋白顏色鮮艷，營養(yǎng)豐富，能提高淋巴細(xì)胞活性，通過淋巴系統(tǒng)提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體的防病、抗病能力，還能清除生物體內(nèi)的自由基及促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生，并且具有顯著的抗腫瘤活性。

上述活性多肽的添加量為藻粉的0.6%，活性多肽的氨基酸序列為hshacasysrcycrclrcrpgcvncyrcsr，該活性肽具有親水性和親脂性，親水性使其溶于蒸餾水中，親脂性使其與螺旋藻細(xì)胞膜結(jié)合，使細(xì)胞膜下形成小孔，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，提高粗蛋白提取的工作效率，也提高活性蛋白的得率。

上述層析柱規(guī)格為直徑3cm，長52cm，緩沖液選用ph為7、濃度為0.012mol/l的磷酸鹽緩沖液和0.1mol/l的kcl緩沖液，流速為0.6ml/min。

實(shí)施例3：

鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法的具體步驟為：按料液比為1:2.8在藻粉中加入蒸餾水，抽濾，去離子水洗滌2~3次，加入ph為6.5、濃度為0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液和活性多肽，其中藻粉與磷酸鹽緩沖液的重量體積比為1:14~16，活性多肽的添加量為藻粉的0.5%，攪拌130min，在-20℃快速冷凍，然后在3℃下解凍，反復(fù)凍融3次，離心；向上清液中加入濃度為1.8wt%的殼聚糖溶液，藻粉與殼聚糖溶液的重量體積比為1:4，調(diào)節(jié)ph至6.5，攪拌25min后離心，將上清液放入冰水浴中，加入硫酸銨使其濃度為53wt%，攪拌至硫酸銨完全溶解，靜置過夜后離心；將沉淀物溶解于磷酸鹽緩沖液，然后裝入透析袋，置于磷酸鹽緩沖液中透析，更換緩沖液6次；將透析液采用羥基磷灰石吸附層析法制備活性蛋白純品，層析柱規(guī)格為直徑3cm，長52cm，緩沖液選用ph為6.5、濃度為0.01mol/l的磷酸鹽緩沖液和0.12mol/l的kcl緩沖液，流速為0.7ml/min，冷凍干燥，即得鈍頂螺旋藻活性蛋白。

本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。

以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>樂清瑞耀食品技術(shù)有限公司

<120>鈍頂螺旋藻活性蛋白的制備方法

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