專利名稱：螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物及其應用的制作方法
技術領域：
本申請涉及蛋白酶解產物及其應用。
背景技術：
螺旋藻是對節(jié)旋藻屬(Arthrospira)的兩種藍藻，即極大節(jié)旋藻(Arthrospira maxima)和鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)的通稱。這兩種藍藻最初被分入螺 旋藻屬(Spirulina)，后又分入節(jié)旋藻屬，但習慣上仍稱作“螺旋藻”。藻藍蛋白是螺旋 藻所含的捕光色素蛋白，可以抗氧化、抗炎癥、提高機體免疫力、促進動物細胞再生、抑制 癌細胞生長(Farooqet al.，Chem—Biol Interact, 2004,149,1-7 ；Subhashini et al.， BiochemPharmacol, 2004, 68 453-62 ；Chen and Wong, J Agric Food Chem,2008,56, 4352-4358。發(fā)明簡述第一方面提供螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。所述酶解可以使用胰蛋白酶、地衣芽 胞桿菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶或其組合。第二方面提供功能食品，包括第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。第三方面提供藥物組合物，包括第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物和藥學上 可接受的載體。再一方面涉及第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物在制備藥物組合物中的用 途，所述藥物組合物用于降低體內的自由基水平，或增強個體的抗氧化體系，和/或預防和 /或治療自由基相關疾病。


圖1顯示ABTS法檢測的螺旋藻藻藍蛋白的胰蛋白酶酶解產物的總抗氧化活性。圖2顯示ABTS法檢測的螺旋藻藻藍蛋白的地衣芽胞桿菌蛋白酶酶解產物的總抗 氧化活性。圖3顯示ABTS法檢測的螺旋藻藻藍蛋白的胰凝乳蛋白酶酶解產物的總抗氧化活 性。圖4顯示ABTS法檢測的螺旋藻藻藍蛋白的胃蛋白酶酶解產物的總抗氧化活性。圖5顯示基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F/MS)鑒定的螺旋藻藻 藍蛋白的胰蛋白酶酶解產物。
具體實施例方式第一方面提供螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。優(yōu)選地，所述的螺旋藻藻藍蛋白的酶 解產物分別是以下實施方式的酶解產物，或者是分別由以下實施方式中描述的方法或其任 意組合所產生的酶解產物。在一些實施方式中，螺旋藻選自極大節(jié)旋藻和鈍頂節(jié)旋藻的品系中的一種或多
3種。極大節(jié)旋藻的品系例如是極大節(jié)旋藻BJ 2000、極大節(jié)旋藻C0NC-040、極大節(jié)旋 藻CS-328、極大節(jié)旋藻FACHB438、極大節(jié)旋藻FACHBSM、極大節(jié)旋藻0UCLXC、極大節(jié)旋藻 0UQDSM 等。鈍頂節(jié)旋藻的品系例如是鈍頂節(jié)旋藻Ap-s、鈍頂節(jié)旋藻AV、鈍頂節(jié)旋藻C1、鈍頂 節(jié)旋藻CG590、鈍頂節(jié)旋藻EB 9602、鈍頂節(jié)旋藻Erdos-DD、鈍頂節(jié)旋藻FACHB341、鈍頂節(jié) 旋藻FACHB439、鈍頂節(jié)旋藻FACHB440、鈍頂節(jié)旋藻FACHB791、鈍頂節(jié)旋藻FACHB834、鈍頂 節(jié)旋藻FACHB869、鈍頂節(jié)旋藻FACHB0UQDS6、鈍頂節(jié)旋藻HN01、鈍頂節(jié)旋藻HZ01、鈍頂節(jié)旋 藻KCTC AG20590、鈍頂節(jié)旋藻M2、鈍頂節(jié)旋藻MMG-9、鈍頂節(jié)旋藻NJ 1999、鈍頂節(jié)旋藻PCC 7345、鈍頂節(jié)旋藻PCC 9438、鈍頂節(jié)旋藻S6、鈍頂節(jié)旋藻Sp_l、鈍頂節(jié)旋藻Sp_10、鈍頂節(jié)旋 藻Sp-11、鈍頂節(jié)旋藻Sp-12、鈍頂節(jié)旋藻Sp-14、鈍頂節(jié)旋藻Sp-15、鈍頂節(jié)旋藻Sp-16、鈍頂 節(jié)旋藻Sp-17、鈍頂節(jié)旋藻Sp-2、鈍頂節(jié)旋藻Sp-3、鈍頂節(jié)旋藻Sp-4、鈍頂節(jié)旋藻Sp-5、鈍頂 節(jié)旋藻Sp-6、鈍頂節(jié)旋藻Sp-7、鈍頂節(jié)旋藻Sp-8、鈍頂節(jié)旋藻Sp-9、鈍頂節(jié)旋藻Sp-DL、鈍頂 節(jié)旋藻Sp-S、鈍頂節(jié)旋藻str. Lefevre 1963/M-132-1、鈍頂節(jié)旋藻str. Paraca等。關于極大節(jié)旋藻和鈍頂節(jié)旋藻的形態(tài)學、生理學、培養(yǎng)方法及其應用，描述于例 如 Feng Chen, Yue Jiang 所編 Algae and their BiotechnologicalPotential (藻類及其 生物技術潛力)，Kluwer Academic Publishers，2001 和 Avigad Vonshak 所編 Spirulina platensis (Arthrospira) :physiology, cell-biology, and biotechnology (純頂節(jié)方寵藻 生理學、細胞生物學和生物技術)，Taylor & Francis Ltd，1997等。特別地，高生物量高富 硒量螺旋藻的培養(yǎng)模型描述于例如Chen et al.，2006，Enzyme Microb Techno 1 39，103 ; Chen et al.，2006，Biotechnol Tech 97,2260 ；Chen et al.，2008，J Integr PlantBiol 50,40 等。藻藍蛋白是捕光色素藻膽蛋白家族成員。藻藍蛋白吸收紅光和橙光、特別是620nm 附近的光，并且發(fā)射約650nm的熒光。它是葉綠素的輔助色素。在一些實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白是氨基酸序列選自NCBI(http://WWW. ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez)登錄號 AAX68409， AAP69774， AAP69773， CAC10037， ZP_03271569， ZP_03271568， EDZ96897, EDZ96896, AAX68411, AAX68410, ABU48451, AAP69778, AAP69777, AAP69776, AAP69775, AAP69770, AAP69769, AAL66232, AAL66231, ABN70846, ABN70845, ABD64608, BD64607, CAC37391, CAC37389, CAC37387, CAC37390, CAC37388, CAC37386, CAC10047, CAC10046, CAC10045, CAC10044, CAC10043, CAC10042, CAC10041, CAC10040, CAC10039, CAC10038, CAC10035 和 CAC10034 所示序列的螺旋藻藻藍蛋 白。在某些實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白具有a亞基和0亞基。在特定實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白是鈍頂節(jié)旋藻藻藍蛋白，并且其結構如NCBI 登錄號 1HA7_X、1HA7_W, 1HA7_V、1HA7_U、1HA7_T、1HA7_S、1HA7_R、1HA7_Q、1HA7_P、1HA7_0、 1HA7_N、1HA7_M、1HA7_L、1HA7_K、1HA7_J、1HA7_I、1HA7_H、1HA7_G、1HA7_F、1HA7_E、1HA7_D、 1HA7_C、1HA7_B 和 / 或 1HA7_A 所示。在一些實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白可以從螺旋藻提取。進行提取時，可以采用 反復凍融法、超聲波破碎法、勻漿法、物理破碎、酶溶法、化學滲透法和十二烷基苯磺酸鈉 裂解法等方法來破碎螺旋藻細胞(Santiago-Santos et al.，Process Biochem，2004，39，2047-2052)。反復凍融-超聲破碎聯(lián)用法可獲得大量的蛋白粗產品，適合于規(guī)模化開發(fā)。關 于蛋白沉淀，可以使用硫酸胺鹽析或冷凍丙酮沉淀。進行純化時，可以使用離子交換色譜和體積排阻色譜法(Chen andffong, Phytochemistry, 2006,67, 2424-2430)(Benedetti etal, J Chromatogr B，2006，833 :12-18)、膨脹床吸附色譜(Niu et al, JChromatogr B，2007，850 :267_276)、疏 水性相互作用色譜等，優(yōu)選單獨使用或聯(lián)用離子交換色譜和體積排阻色譜。也可以采用雙 水相萃取方法多次萃取得到純化的藻藍蛋白(Patil G and Raghavarao，Biochem Eng J, 2007,34 156-164)。此外，還可以使用“硫酸銨分步沉淀_離子色譜層析_分子篩層析柱”(Chen and Wong, Phytochemistry, 2006,67, 2424-2430)純化藻藍蛋白。“硫酸銨分步沉淀-離子色譜 層析-分子篩層析柱”將含藻藍蛋白的純化因子提高到7. 92。另外，選用DEAE-S印hadex 填料，使用單一離子色譜層析也可獲得純化因子達到5的Se-PC。在一個實施方式中，所用螺旋藻藻藍蛋白是干粉形式。在另一些實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白是可商購的藻藍蛋白。例如是廠商 Sigma-Aldrich Co.的產品。在本文中，術語“酶解”意指使用蛋白酶裂解。蛋白酶是對水解蛋白肽鍵的酶的總稱。按水解方式，可以將其分為內肽酶和外肽 酶。內肽酶將蛋白分子內部切斷，形成分子量較小的肽片段。外肽酶從蛋白分子的游離氨 基或羧基末端逐個將肽鍵水解，游離出氨基酸，其中，前者為氨基肽酶，后者為羧基肽酶。按 活性中心，又可將蛋白酶分為絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋 白酶、谷氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶等。按水解反應的最適PH值，則分為酸性蛋白酶、中性蛋 白酶和堿性蛋白酶。蛋白酶對所作用的反應底物有嚴格的特異性。蛋白酶僅能作用于蛋白分子中的特 異肽鍵，例如胰蛋白酶催化水解堿性氨基酸所形成的肽鍵。在一些實施方式中，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋 白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、地衣芽胞桿菌蛋白酶、或其組合。所述蛋白酶可以從例 如 Novo Nordisk A/S 和 Sigma-Aldrich Co.的廠商購買。在一些實施方式中，酶解在適當?shù)木彌_液中進行。適當?shù)木彌_液例如是磷酸鹽緩 沖液、Tris-HCl緩沖液和Ifepes緩沖液等?？梢詫⒙菪逶逅{蛋白和蛋白酶一同加入緩沖 液，從而開始酶解過程。然而，優(yōu)選地，在向緩沖液加入蛋白酶前，還包括使螺旋藻藻藍蛋白 溶解于緩沖液的步驟。在一個實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物的制備還包括，在向 緩沖液加入蛋白酶前，配制以重量計，1-5%螺旋藻藻藍蛋白磷酸鹽緩沖液。在酶解過程中，可以將緩沖液的pH維持在特定的范圍。在某些實施方式中，當所 用蛋白酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或地衣芽胞桿菌蛋白酶時，使緩沖液PH維持在約6. 5 至約7.5。在特定的實施方式中，將緩沖液pH維持在約7.0。在另一個實施方式中，當所用 蛋白酶為胃蛋白酶時，使緩沖液PH維持在約2. 0至約3. 0。對于所用緩沖液，可以通過選用適當?shù)木彌_液濃度來維持酶解過程中的pH。適 當濃度例如是，對于1-5%的螺旋藻藻藍蛋白磷酸鹽緩沖液，所用磷酸鹽緩沖液的濃度為 10mM。
優(yōu)選地，螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物的制備還包括，在向緩沖液加入蛋白酶前，將 已溶解螺旋藻藻藍蛋白的緩沖液的PH調至待維持的pH范圍內。在酶解前，可以使用如氫 氧化鈉和/或氫氧化鉀的苛性堿溶液和/或鹽酸調節(jié)緩沖液PH。在一些實施方式中，對于酶解過程，可以將緩沖液的溫度維持在特定的范圍。在某 些實施方式中，緩沖液的溫度維持在約35-45°C，特別地約37°C。溫度可以借助如水浴鍋和 恒溫箱的裝置來維持。在一些實施方式中，酶解進行0-36小時，特別地1-24小時，更特別地1、2、4、6、10、 12、16、20 或 24 小時。在一些實施方式中，所用蛋白酶的量為螺旋藻藻藍蛋白干重的約0.3-1.6%，特別 地約 0. 4-1. 0%。在一些實施方式中，酶解是部分水解。在本文中，術語“部分水解”意指，對于反應 底物中的蛋白酶作用位點，其中的一些位點被蛋白酶水解，而另一些卻未被水解。在另一些實施方式中，酶解是完全水解。在本文中，術語“完全水解”意指，對于反 應底物中的蛋白酶作用位點，所有位點均被蛋白酶水解?？刂泼附膺^程的緩沖液pH、溫度、反應底物量與酶量之比等，尤其是控制酶解進行 的時間，可以使酶解為部分水解。可以采用美國藥典(USP)甲醛滴定法，通過氫氧化鈉滴定 評估酶解過程中游離氨基的增加量，從而監(jiān)控水解程度。為了確保蛋白酶酶解產物的恒定，優(yōu)選使酶解產物接受酶滅活，以終止酶解過程。 酶滅活步驟可以是，在高于約80°C、優(yōu)選約90-100°C下，處理酶解產物多于約10分鐘、優(yōu)選 約15分鐘，其中，所述溫度例如通過水浴提供。在一些實施方式中，可以將酶解產物以液體狀態(tài)存儲于室溫、優(yōu)選低于4°C、更優(yōu) 選低于-20°C的溫度。在另一些實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物的制備還包括，將酶解產物濃 縮干燥的步驟。在一個實施方式中，通過噴霧干燥液體酶解產物產生粉末形式的酶解產物。 在另一個實施方式中，濃縮干燥是冷凍干燥。任選地，在濃縮干燥前，包括分離酶解產物的 步驟，其中，分離例如使用離心?？梢越柚|譜，鑒定螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。所述質譜例如是基質輔助激光 解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F/MS)和表面增強激光解吸電離蛋白芯片飛行時間質譜 (SELDI-T0F/MS)等。采用MALDI-T0F/MS或SELDI-T0F/MS獲得肽質量指紋譜(PMF)。PMF是蛋白被識 別特異酶切位點的蛋白酶水解后得到的肽片段的質量圖譜。由于每種蛋白的氨基酸序列不 同，當?shù)鞍妆凰夂螅a生的肽片段序列也各不相同，因此其PMF也具有特征性。在一些實施方式中，根據(jù)獲得的PMF，利用例如MASCOT、ProFound、Aldente和 MS-Fit等軟件對例如SWIS S-PR0T、NCBI和UniProt的數(shù)據(jù)庫進行搜索，從而鑒定蛋白。在一個實施方式中，螺旋藻藻藍蛋白的胰蛋白酶酶解產物具有如表1所示的肽片 段。在優(yōu)選的實施方式中，所述螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物具有高于螺旋藻藻藍蛋白 的抗氧化性。在更優(yōu)選的實施方式中，相對于完全酶解，部分酶解的螺旋藻藻藍蛋白的酶 解產物具有更高的抗氧化性?？寡趸缘拇_定例如可以使用ABTS自由基清除活性測定法
6(Chen andffong, J Agric Food Chem，2008，56，4352-4358)。在特定實施方式中，在使用 ABTS 自由基清除活性測定法確定酶解產物抗氧化性時，使用例如10mM的磷酸鹽緩沖液，將螺旋 藻藻藍蛋白的酶解產物稀釋至濃度小于5mg/ml，特別地至3mg/ml，從而獲得待測樣品。在某些實施方式中，酶解1-24小時的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物相對于螺旋藻 藻藍蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定實施方式中，胰蛋白酶酶解16小時的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物相對于 螺旋藻藻藍蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定實施方式中，地衣芽胞桿菌蛋白酶酶解10小時的螺旋藻藻藍蛋白的酶解 產物相對于螺旋藻藻藍蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定實施方式中，胰凝乳蛋白酶酶解10小時的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物相 對于螺旋藻藻藍蛋白，具有更高的抗氧化性。在特定實施方式中，胃蛋白酶酶解16小時的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物相對于 螺旋藻藻藍蛋白，具有更高的抗氧化性。第二方面提供功能食品，其包括第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。在本文中，術語“功能食品”意指具有特定功能的食品。功能食品具有一般食品的 共性，并且能調節(jié)個體生理機能。在一些實施方式中，所述特定功能是增強個體抗氧化能力 或自由基清除能力。在本文中，術語“個體”涉及任意哺乳動物，優(yōu)選人。在一些實施方式中，所述功能食品包括，lwt % -lOOwt %的、特別地 10wt% -lOOwt %的、更為特別地30wt% -lOOwt %的所述螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。在某 些實施方式中，所述功能食品還包括作為余量的其它任何食品。在本文中，術語“wt% ”意 指重量百分比，所述重量百分比以功能食品的重量為基準。在所述功能食品還包括其它任何食品時，通過例如將第一方面的螺旋藻藻藍蛋白 的酶解產物與所述的其它任何食品混合，獲得所述功能食品。在一些實施方式中，所述功能食品具有第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物的 形態(tài)，例如是溶液或干粉。在另一些實施方式中，所述功能食品具有所述的其它任何食品的 形態(tài)。在又一些實施方式中，所述功能食品為片劑、丸劑或膠囊。制劑的方法為本領域技術 人員所熟知。所述功能食品可以用于生理機能正常的個體，也可以用于生理機能異常、例如抗 氧化能力降低或自由基清除能力降低的個體。對于個體而言，在包括但不限于下列的情況 下，尤其需要增強抗氧化體系移植手術、心臟手術、選擇性血管成形術、冠狀動脈搭橋術、 腦手術、止血器械的應用；使用產生自由基的化療藥物進行抗腫瘤或驅蟲治療；暴露于電 離輻射；以及暴露于屬于或能產生自由基的外源性化學物質等。第三方面提供藥物組合物，包括第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物和藥學上 可接受的載體。在本文中，術語“藥學上可接受的載體”包括任何標準藥用載體，例如在Merck & Co.的Merck索引中列出的載體等。所述載體通常含有賦形劑，如淀粉、奶、糖、明膠、滑石、 植物脂或植物油、樹膠或其它已知的賦形劑。所述載體還可以包括香料和顏色添加劑，或其 它組分。所述組合物可以通過常規(guī)方法、例如Remington ‘ s
7PharmaceuticalSciences (Remington 藥劑學)，Mack Pub. Co. 17 版(1985)中記載的方法 制成制劑。根據(jù)給藥途徑和使用目的的不同，藥物組合物可以是固體、半固體或液體劑型， 如粉末、顆粒、晶體、溶液、懸液、脂質體、糊劑、乳膏、軟膏等?；罴毎谛惺拐Ｉ砉δ軙r，持續(xù)產生自由基。自由基是高化學反應性的原子、 分子或分子片段，其具有游離的或未成對的電子。自由基能夠與許多生物分子不可逆地反 應，引起生物系統(tǒng)的逐漸衰退。許多自由基反應會對細胞組分造成嚴重損傷，例如可以造成蛋白交聯(lián)、DNA突變 和脂質過氧化等。自由基可以和生物分子相互作用而引發(fā)鏈式反應，還可以和核酸分子的 嘌呤和嘧啶堿基反應。由自由基造成的損傷可以引發(fā)例如輻射誘導的腫瘤形成(Breimer， L. H. (1988) Brit. J. Cancer 57 6)。自由基通常為體內生成的抗氧化酶(antioxidant enzymes)和從營養(yǎng)物中吸收的 抗氧化劑所中和。在本文中，術語“抗氧化劑”意指，具有抗氧化性的物質，例如是自由基抑 制劑、清除劑或催化劑。抗氧化劑的實例包括但不限于，第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解 產物、谷胱甘肽、抗壞血酸、維生素E、泛醌和類胡蘿卜素等?？寡趸瘎┤珙惡}卜素與諸如 冠心病、白內障和腫瘤的慢性疾病之間的關系記載在例如，Canfield, et al. (1992)，Proc. Soc. Exp. Biol. Med.，200 :260 中。抗氧化狀態(tài)是促氧化劑(pro-oxidant)和抗氧化體系之間的平衡。有利于氧化的 不平衡為氧化應激(oxidative stress)。氧化應激可由自由基的過量產生引起。氧化應激 也可由抗氧化體系的削弱引起，而抗氧化體系的削弱由抗氧化劑攝入降低、抗氧化劑的內 源性生成降低和/或抗氧化劑的利用增加導致。氧化應激可導致細胞損傷，引發(fā)自由基相 關疾病。在本文中，術語“自由基相關疾病”意指，自由基造成的損傷促成了該疾病的發(fā)生 和/或進展，或者當給予抗氧化劑時可以減輕該疾病的臨床癥狀、提高存活率和/或提供有 助于治療和/或預防疾病的其它臨床效果。自由基相關疾病的實例包括但不限于，缺血性 再灌注損傷、炎癥性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心肌梗死、中風、創(chuàng)傷性出血、腦及脊索創(chuàng)傷、自 身免疫病(例如類風濕關節(jié)炎、糖尿病)、白內障、肺氣腫、潰瘍、氧毒性、腫瘤、非正常細胞 調亡、放射病、毒血癥、急性肺損傷和神經變性疾病(例如肌萎縮性側索硬化癥(ALS)、多發(fā) 性硬化癥、帕金森氏病、阿爾茨海默病)等。另外，對于個體而言，在包括但不限于下列的情況下，尤其需要增強抗氧化體系 移植手術、心臟手術、選擇性血管成形術、冠狀動脈搭橋術、腦手術、止血器械的應用；使用 產生自由基的化療藥物進行抗腫瘤或驅蟲治療；暴露于電離輻射；以及暴露于屬于或能產 生自由基的外源性化學物質等?；诼菪逶逅{蛋白的酶解產物的抗氧化活性、例如自由基清除能力，本方面的 藥物組合物可以降低個體體內的自由基水平，或增強個體的抗氧化體系，和/或預防和/或 治療自由基相關疾病。根據(jù)目的的不同，藥物組合物可以經例如腸胃外、吸入、局部或全身性給藥，并且 以治療有效量給藥。腸胃外給藥例如靜脈、腹膜內、肌內、皮下、直腸或陰道給藥。吸入給藥例如鼻內或 口腔吸入給藥。局部給藥例如向表皮外部、口腔給藥，以及向耳、眼和鼻中以及不顯著進入血流的部位滴注給藥。全身性給藥例如口服、靜脈、腹膜內或肌內給藥。在本文中，術語“治療有效量”意指，足以預防和/或治愈或至少部分緩解疾病的 劑量。治療有效量根據(jù)疾病的嚴重程度、患者的一般狀況及給藥途徑不同而異，通常使用一 次劑量含有約0. Img-IOg的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物，更常用地使用10mg-2000mg。在另一實施方案中，所述藥物組合物被制備成含有所述有效劑量至1/20所述有 效劑量、例如含有1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/8或1/10所述有效劑量的適合所述給藥途徑的 劑型。因此，再一方面涉及第一方面的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物在制備藥物組合物中 的用途，所述藥物組合物可以用于降低個體體內自由基水平或增強個體的抗氧化體系，和/ 或預防和/或治療本文所述的自由基相關疾病。以下實施例意在闡述本發(fā)明的實施方式，而不應被理解為對發(fā)明范圍的限定。實施例實施例1制備螺旋藻藻藍蛋白的胰蛋白酶酶解產物在40_60°C下，用IOmM的磷酸鹽緩沖液溶解分離自鈍頂節(jié)旋藻(取自廣州暨南大 學水生生物研究所)的螺旋藻藻藍蛋白干粉，將其配制成濃度為(10mg/ml)的反應底物 緩沖液。添加胰蛋白酶(購自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量為藻藍蛋白干粉重量的 0. 4-1. 0%，攪拌溶解，調節(jié)pH值至6. 5-7. 5。于35-45°C進行恒溫酶解，酶解時間為1-24 小時。酶解完成后，將反應溶液在90-10(TC水浴中放置15分鐘，隨后冷卻至室溫。離心分 離酶解產物，濃縮凍干，收集酶解產物。實施例2制備螺旋藻藻藍蛋白的地衣芽胞桿菌蛋白 酶酶解產物在40_60°C下，用IOmM的磷酸鹽緩沖溶液溶解分離自鈍頂節(jié)旋藻(取自廣州暨南 大學水生生物研究所)的螺旋藻藻藍蛋白干粉，將其配制成濃度為(10mg/ml)的反應底 物緩沖液。添加地衣芽胞桿菌蛋白酶(丙二醇水性溶液，購自Sigma-Aldrich公司)，加酶 量為藻藍蛋白干粉重量的0. 4-1. 0%，攪拌溶解，調節(jié)pH值至6. 5-7. 5。于35_45°C進行恒 溫酶解，酶解時間為1-24小時。酶解完成后，將反應溶液在90-100°C水浴中放置15分鐘， 隨后冷卻至室溫。離心分離酶解產物，濃縮凍干，收集酶解產物。實施例3制備螺旋藻藻藍蛋白的胰凝乳蛋白酶酶解產物在40_60°C下，用IOmM的磷酸鹽緩沖溶液溶解分離自鈍頂節(jié)旋藻(取自廣州暨南 大學水生生物研究所)的螺旋藻藻藍蛋白干粉，將其配制成濃度為(10mg/ml)的反應底 物緩沖液。添加胰凝乳蛋白酶(購自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量為藻藍蛋白干粉 重量的0. 4-1. 0%，攪拌溶解，調節(jié)pH值至6. 5-7. 5。于35_45°C進行恒溫酶解，酶解時間為 1-24小時。酶解完成后，將反應溶液在90-100°C水浴中放置15分鐘，隨后冷卻至室溫。離 心分離酶解產物，濃縮凍干，收集酶解產物。實施例4制備螺旋藻藻藍蛋白的胃蛋白酶酶解產物在40_60°C下，用IOmM的磷酸鹽緩沖溶液溶解分離自鈍頂節(jié)旋藻(取自廣州暨南 大學水生生物研究所)的螺旋藻藻藍蛋白干粉，將其配制成濃度為(10mg/ml)的反應 底物緩沖液。添加胃蛋白酶(購自Sigma-Aldrich公司)干粉，加酶量為藻藍蛋白干粉重 量的0. 4-1.0%,攪拌溶解，調節(jié)pH值至2. 0-3. O。于35-45°C進行恒溫酶解，酶解時間為 1-24小時。酶解完成后，將反應溶液在90-100°C水浴中放置15分鐘，隨后冷卻至室溫。離
9心分離酶解產物，濃縮凍干，收集酶解產物。實施例5ABTS自由基清除法檢測螺旋藻藻藍蛋 白及其酶解產物的抗氧化活性ABTS 自由基清除活性的測定如 Chen and Wong，J Agric FoodChem，2008，56， 4352-4358 所述。ABTS試劑的制備如下。將ABTS儲液(5mM)通過二氧化錳產生自由基，再通 過0.2μΜ PVDF注射過濾器。濾出液用5mM PBS緩沖液(pH = 7. 4)稀釋至吸光度 0. 70士0. 05 (A734nm)。測定時，將3. Oml ABTS試劑與50 μ L待測樣品混和。6分鐘后，測定 734nm處吸光度。根據(jù)吸光度的變化計算抑制百分比。其中，A734nm越小，則ABTS+自由基的 量越少，說明所測試物質的抗氧化活性越強。檢測實施例1-4中的螺旋藻藻藍蛋白及其酶解產物的抗氧化活性，其中，使用磷 酸鹽緩沖液將所述藻藍蛋白和酶解產物的濃度調節(jié)為3mg/ml，從而獲得待測樣品。結果如 圖1至圖4所示。酶解1-24小時所得酶解產物均具有較高的抗氧化活性，且顯著高于藻藍 蛋白。實施例6MALDI-T0F/MS鑒定螺旋藻藻藍蛋白的胰蛋白酶酶解產物將實施例1所得24小時酶解產物溶解于0. 1 %的三氟醋酸(TFA)水溶液中，過Zip Tip U-C18柱(Milipore)，以除去鹽和其它雜質。將除鹽多肽重新溶解于含0. 的TFA的 50%乙腈(ACN)溶液中，加到MALDI192孔板上，風干后上樣，利用ABI 4700蛋白組系統(tǒng)進 行MALDI-T0F/MS分析，其中解析離子源為337nm、200Hz激光。根據(jù)各肽段的m/z數(shù)據(jù)，用 Mascot軟件，設置適當?shù)乃阉鲄?shù)，在NCBI等蛋白數(shù)據(jù)庫中搜索匹配到圖5所列肽段。由 此結果可以看出螺旋藻藻藍蛋白基本完全水解。對于本文中引用的參考文獻，在此將其全部內容并入本文以成為本說明書的一部 分。上述對本發(fā)明的一般性描述和對具體實施方式
的描述不應理解為是對本發(fā)明技 術特征構成的限制。本領域所屬技術人員根據(jù)本申請的公開，可以在不違背本發(fā)明構成要 素的前提下，對上述一般性描述和/或具體實施方式
(包括實施例)中的技術特征進行增 加、減少或任意組合，形成屬于本發(fā)明的其它的技術方案。序列表
<110>香港中文大學
<120>螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物及其應用
<130>09C10612CN
<160>18
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>鈍頂節(jié)旋藻(Arthrospira platensis)
<400>1
Asp lie Gly Tyr Tyr Leu Arg
1 5
<210>2
<211>13<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>2Phe Leu Ser Ser Thr Glu lie Gln Val Ala Phe Gly Arg1510<210>3<211>15<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>3Ala Asp Ser Leu lie Ser Gly Ala Ala Gln Ala Val Tyr Asn Lys151015<210>4<211>15<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>4Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser lie Ala Asp Ser Gln Gly Arg151015<210>5<211>14<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>5Thr Phe Glu Leu Ser Pro Ser Trp Tyr lie Glu Ala Leu Lys1510<210>6<211>17<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>6Met Lys Thr Pro Leu Thr Glu Ala Val Ser lie Ala Asp Ser Gln Gly151015Arg<210>7<211>17<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻
<400>7Phe Pro Tyr Thr Thr Gln Met Gln Gly Pro Asn Tyr Ala Ala Asp Gln151015Arg<210>8<211>25<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>8Ala Asn His Gly Leu Ser Gly Asp Ala Ala Val Glu Ala Asn Ser Tyr151015Leu Asp Tyr Ala lie Asn Ala Leu Ser2025<210>9<211>6<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>9Met Ala Ala Cys Leu Arg15<210>10<211>6<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>10Cys Leu Asn Gly Leu Arg15<210>11<211>7<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>11Arg Met Ala Ala Cys Leu Arg15<210>12<211>7<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>12
12Met Phe Asp Ala Phe Thr Lys 15
<210>13 <211>7 <212>PRT <213>鈍頂節(jié)旋藻 <400>13
Asp Met Glu lie lie Leu Arg 15
<210>14 <211>14 <212>PRT <213>鈍頂節(jié)旋藻 <400>14
lie Thr Ser Asn Ala Ser Thr lie Val Ser Asn Ala Ala Arg 1510
<210>15 <211>19 <212>PRT <213>鈍頂節(jié)旋藻 <400>15
Glu Thr Tyr Leu Ala Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Val Ala Val Gly 151015
Val Gly Lys <210>16 <211>17 <212>PRT <213>鈍頂節(jié)旋藻 <400>16
Tyr Val Thr Tyr Ala Val Phe Ala Gly Asp Ala Ser Val Leu Glu Asp 151015
Arg
<210>17 <211>20 <212>PRT <213>鈍頂節(jié)旋藻 <400>17
Ser Leu Phe Ala Glu Gln Pro Gln Leu lie Ala Pro Gly Gly Asn Ala 151015
Tyr Thr Ser Arg20
<210>18<211>22<212>PRT<213>鈍頂節(jié)旋藻<400>18Gly Glu Met Leu Ser Thr Ala Gln lie Asp Ala Leu Ser Gln Met Val151015Ala Glu Ser Asn Lys Arg20
權利要求
螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。
2.如權利要求1所述的酶解產物，其中所述酶選自胰蛋白酶、地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或其組合。
3.如權利要求1或2所述的酶解產物，其中所述酶選自胰蛋白酶、地衣芽胞桿菌蛋白 酶、胰凝乳蛋白酶或其組合，并且所述酶解在PH6. 5-7. 5下進行。
4.如權利要求1或2所述的酶解產物，其中所述酶是胃蛋白酶，并且所述酶解在pH 2. 0-3. 0下進行。
5.如權利要求1-4中任一項所述的酶解產物，其中所述酶解在緩沖液、優(yōu)選磷酸鹽緩 沖液中進行。
6.如權利要求1-5中任一項所述的酶解產物，其中所述酶解在35-45°C下進行。
7.如權利要求1-6中任一項所述的酶解產物，其中以重量計，所述酶是所述藻藍蛋白 的 0. 4% -1. 0%。
8.如權利要求1-7中任一項所述的酶解產物，其中所述酶解進行1-24小時。
9.如權利要求1、3和5-8中任一項所述的酶解產物，其中所述酶解產物具有如圖5所 示的肽片段。
10.功能食品，包含如權利要求1-9中任一項所述的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物。
11.藥物組合物，包含如權利要求1-9中任一項所述的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物和 藥學上可接受的載體。
12.如權利要求1-9中任一項所述的螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物在制備藥物組合物中 的用途，所述藥物組合物用于降低個體體內的自由基水平，或增強個體的抗氧化體系，和/ 或預防和/或治療自由基相關疾病。
全文摘要
本申請?zhí)峁┞菪逶逅{蛋白的酶解產物、包含螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物的功能食品、以及包含螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物和藥學上可接受的載體的藥物組合物。本申請還涉及螺旋藻藻藍蛋白的酶解產物在制備藥物組合物中的用途，所述藥物組合物用于降低個體體內的自由基水平，或增強個體的抗氧化體系，和/或預防和/或治療自由基相關疾病。
文檔編號A61K38/01GK101928743SQ20091017886
公開日2010年12月29日 申請日期2009年9月29日 優(yōu)先權日2009年9月29日
發(fā)明者陳填烽, 黃蔭成 申請人:香港中文大學