本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄球菌屬(staphylococcus)中的金黃色葡萄球菌(s.aureus)致病力最強，常引起食物中毒。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，直徑為0.8～1.0μm，呈葡萄狀。無芽抱、無鞭毛。需氧和兼性厭氧菌，生長溫度在6.5～46℃之間，最適溫度為30～37℃?？稍趐h4.0～9.8范圍內(nèi)生長，最適生長ph7.4。能在15％nacl和40％膽汁中生長。在普通肉湯固體培養(yǎng)基上能形成光滑、低凸、閃光、邊緣整齊的菌落，菌落色素不穩(wěn)定，但多數(shù)為金黃色。

該菌在20～37℃條件下，能產(chǎn)生引起食物中毒的腸毒素。其中，金黃色葡萄球菌腸毒素b(seb)是由金黃色葡萄球菌分泌的一種細菌性超抗原，具有多種生物學(xué)活性。超抗原活化t細胞的方式與通?？乖煌刹唤?jīng)過抗原提呈細胞(apc)的內(nèi)化、降解過程，直接與mhcⅱ類分子及tcr-β鏈的v區(qū)結(jié)合，選擇性地大量擴增和激活t細胞，故表達mhcⅱ類分子的細胞都能與之結(jié)合，激活的t細胞能對表達mhcⅱ類分子的靶細胞產(chǎn)生細胞毒作用，這種作用被稱為超抗原依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(superantigen-dependentcellmediatedcytotoxicity，sdcc)。與此同時還能誘導(dǎo)腫瘤敏感性細胞因子如ifn-γ、tnf-α、il-2的產(chǎn)生，從而達到間接殺傷腫瘤細胞、抑制腫瘤生長的作用。與普通抗原相比，超抗原seb不需apc的處理，亦不受mhcⅱ類分子的限制，又由于vβ基因的多態(tài)性，針對某一特定的超抗原，在t細胞庫中約有5％～20％細胞可發(fā)生反應(yīng)?；诖耍乖璼eb目前被越來越多地應(yīng)用于腫瘤治療方面，成為免疫學(xué)研究的一個重要方向。

最早獲得的葡萄球菌腸毒素超抗原是從金黃色葡萄球菌的發(fā)酵液中提取的。但天然毒素的產(chǎn)量低，其研究和應(yīng)用方面受到了限制。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點，本發(fā)明的首要目的在于提供一種重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組質(zhì)粒pet32a-seb。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株。

本發(fā)明的第四個目的在于提供上述重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的制備方法。

本發(fā)明的第五個目的在于提供上述重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白，其氨基酸序列如下所示：

enlyfqgesqpdpkpdelhksskftglmenmkvlyddnhvsainvksidqflyfdliysikdtklgnydnvrvefknkdladkykdkyvdvfganyyyqcyfskktndinshqtdkrktcmyggvtehngnqldkyrsitvrvfedgknllsfdvqtnkkkvtaqeldyltrhylvknkklyefnnspyetgyikfienensfwydmmpapgdkfdqskylmmyndnkmvdskdvkievylttkkk

一種編碼上述重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因，其核苷酸序列如下所示：

gagaacctgtacttccagggcgaaagccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcagcaaattcaccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgacaaccacgtctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgtacttcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaactacgacaacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggacaagtacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactactactaccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcccaccagaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgaccgaacacaacggcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgtgttcgaggacggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaagaaaaaagtgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacctggtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgtacgaaaccggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttctggtacgacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtccaagtacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagcaaagacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaataatga

一種重組質(zhì)粒pet32a-seb，是通過將上述編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因的核苷酸序列與載體pet-32a連接得到的；

所述的重組載體pet32a-seb的制備方法，包含如下步驟：

(1)通過全基因合成，得到上述編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白

的基因；

(2)使用引物x5523-1和引物x5523-34對步驟(1)得到的基因進行pcr

擴增，得到目的片段并回收純化；

(3)將步驟(2)回收純化后的目的產(chǎn)物與載體pet-32a進行連接，得到重

組質(zhì)粒et32a-seb；

所述的引物x5523-1和引物x5523-34的核苷酸序列如下所示：

引物x5523-1：gacacggtaccgagaacctgtacttccag；

引物x5523-34：gtgtcctcgagtcattatttctttttggtggtcagg；

一種表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株，是將上述重組質(zhì)粒pet32a-seb轉(zhuǎn)入宿主細胞中得到的；

所述的宿主細胞優(yōu)選為大腸桿菌bl21(de3)；

所述的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的制備方法，包含如下步驟：

將上述表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株作為表達菌株，基于大腸桿菌表達系統(tǒng)進行誘導(dǎo)表達；離心收集菌體，洗滌懸浮，然后超聲破碎，離心，收集上清，純化，得到重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白；

所述的誘導(dǎo)表達的具體操作優(yōu)選為：將上述表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株進行液體擴大培養(yǎng)至od值達到0.5～0.6時，添加終濃度為0.5mm的iptg，220rpm、37℃誘導(dǎo)4h；

所述的液體擴大培養(yǎng)，包含如下步驟：

挑取表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株的單菌落于含有終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm過夜培養(yǎng)，得到種子液；將培養(yǎng)的種子液按1：100體積比接種于含有終濃度為50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm培養(yǎng)；

所述的洗滌懸浮的試劑優(yōu)選為破碎buffer，所述的破碎buffer為含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs緩沖液，ph值為7.4；

所述的超聲破碎的條件優(yōu)選為：冰浴下，超聲功率為400～450w，超聲時間為5～25min，其中，超聲2s，暫停6s為一個循環(huán)；

所述的純化，包含如下步驟：

(1)第一次鎳瓊脂糖親和層析

①將ni-ida(鎳-亞氨基二乙酸，親和層析介質(zhì))裝柱，用3倍柱床體積的bindingbuffer1清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②將超聲破碎、離心、收集得到的上清上柱，流速為2ml/min；

③5倍柱床體積的bindingbuffer1清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer洗雜，流速3ml/min，收集穿透液；

(2)酶切去除蛋白標(biāo)簽

將步驟(1)收集的穿透液進行透析，然后加入tev酶，酶切去除標(biāo)簽，得到酶切后的穿透液；

(3)第二次鎳瓊脂糖親和層析

①將ni-ida裝柱，用3倍柱床體積的bindingbuffer2清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②將步驟(2)酶切后的穿透液上柱，流速為2ml/min，收集穿透液；

(4)過濾

將步驟(3)收集的穿透液經(jīng)過0.22μmca(醋酸纖維素)濾膜過濾，得到重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白；

步驟(1)中所述的bindingbuffer1優(yōu)選為含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs緩沖液，ph值為7.4；

步驟(1)中所述的washbuffer優(yōu)選為含20mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph值為7.4；

步驟(2)中所述的透析優(yōu)選為采用到ph值為7.4的1×pbs緩沖液透析2h；

步驟(2)中所述的酶切的條件優(yōu)選為25℃酶切過夜；

步驟(3)中所述的bindingbuffer2優(yōu)選為ph值為7.4的1×pbs緩沖液；

所述的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白在醫(yī)藥和日化領(lǐng)域中的應(yīng)用；

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明通過蛋白序列優(yōu)化，得到金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因的核苷酸序列，將該核苷酸序列重組于大腸桿菌表達系統(tǒng)中，大腸桿菌表達得到的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素融合蛋白表達水平高，產(chǎn)量高。

(2)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明選用pet-32a載體結(jié)合大腸桿菌bl21(de3)原核表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白，其中，pet-32a載體帶有his蛋白標(biāo)簽，易于蛋白純化和鑒定；大腸桿菌bl21(de3)生長周期短，誘導(dǎo)表達快，產(chǎn)量高。

(3)本發(fā)明提供的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的制備方法更為簡單，大幅節(jié)約了蛋白產(chǎn)出耗時。

(4)與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過控制低溫超聲條件、選擇兩次鎳瓊脂糖親和層析以及tritonx-114試劑的添加嚴(yán)格控制去內(nèi)毒素，為后續(xù)蛋白的應(yīng)用安全提供保障。

(5)本發(fā)明的制備提純的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的濃度不低于2.01mg/ml，純度＞90％。

附圖說明

圖1是實施例1第二輪擴增得到的編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；其中，m：dnamarker；1：編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因。

圖2是實施例1酶切后的載體pet-32a的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；其中，m：dnamarker；1和2：kpni和xhoi酶切后的載體pet-32a。

圖3是實施例1構(gòu)建好的重組載體pet32a-seb酶切后的瓊脂糖凝膠電泳檢測圖；其中，m：marker；1：酶切后的重組質(zhì)粒pet32a-seb。

圖4是實施例3小試培養(yǎng)選擇最佳的誘導(dǎo)條件的sds-page電泳分析圖；其中m：proteinmarker；1：陰性對照；2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。

圖5是實施例3中第一次鎳瓊脂糖親和層析純化sds-page電泳分析圖；其中，m：marker；1：細菌破碎上清；2：流出(穿透液a)；3：20mmimidazole洗脫組分(穿透液b)；4：50mmimidazole洗脫組分(穿透液c)；5：500mmimidazole洗脫組分(洗脫液d)，loading中含有還原劑。

圖6是是實施例3中第二次鎳瓊脂糖親和層析純化sds-page電泳分析圖；其中，m：proteinmarker；1：酶切前的穿透液b；2：酶切后的穿透液b；3:流出(穿透液e)；4～5：20mmimidazole洗脫組分(穿透液f)；6：500mmimidazole洗脫組分(洗脫液g)，loading中含有還原劑。

圖7是實施例3純化過濾后的目的蛋白的sds-page電泳分析圖。

圖8是純化后的融合蛋白和去標(biāo)簽后的目的蛋白的westernblot分析圖；其中，m：prestainedmarker；1：融合蛋白；2：去標(biāo)簽后目的蛋白。

圖9是實施例3構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)蛋白bsa含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1重組質(zhì)粒pet32a-seb的構(gòu)建

(1)擴增編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因

根據(jù)已公開的金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白序列(ncbireferencesequence:wp_072497559.1)，重新優(yōu)化設(shè)計金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白序列，根據(jù)優(yōu)化后的基因序列設(shè)計合成引物34條，通過第一輪pcr擴增出足夠量的目的產(chǎn)物dna，其中，反應(yīng)體系(50μl)如下所示：

其中，引物mix為引物x5523-1～x5523-34，共34條，0.4μl×34＝13.6μl；引物序列如下所示：

x5523-1：gacacggtaccgagaacctgtacttccag；

x5523-2：cgggtccggctggctttcgccctggaagtacaggttctcg；

x5523-3：gccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcag；

x5523-4：tccatcaggccggtgaatttgctgcttttgtgcagttcat；

x5523-5：caccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgac；

x5523-6：acgttgatggcggagacgtggttgtcgtcgtacagcactt；

x5523-7：tctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgta；

x5523-8：atggagtagatcaggtcgaagtacaggaactgatcgatgc；

x5523-9：tcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaa

x5523-10：tcgacgcggacgttgtcgtagttacccagtttggtgtctt；

x5523-11：caacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggac；

x5523-12：gtccacgtatttgtctttgtacttgtccgccaggtctttg；

x5523-13：tacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactact；

x5523-14：ttttggagaagtagcactggtagtagtagttcgcgccgaa；

x5523-15：ccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcc；

x5523-16：tcttgcgtttatcggtctggtgggagttgatgtcgttggt；

x5523-17：agaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgac；

x5523-18：ttgtccagctggttgccgttgtgttcggtcacgccgccgt；

x5523-19：gcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgt；

x5523-20：tcagcaggtttttgccgtcctcgaacacgcgcacggtgat；

x5523-21：cggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaag；

x5523-22：gttcctgcgcggtcacttttttcttgttggtctgcacatc；

x5523-23：tgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacct；

x5523-24：cgtacagttttttgtttttcaccaggtagtgacgggtcag；

x5523-25：gtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgt；

x5523-26：gaacttgatgtagccggtttcgtacggggagttgttgaac；

x5523-27：accggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttct；

x5523-28：cgccggcatcatgtcgtaccagaagctgttttcgttttcg；

x5523-29：gacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtcca；

x5523-30：tcgttgtacatcatcaggtacttggactggtcgaacttgt；

x5523-31：tacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagca；

x5523-32：acacttcgattttcacgtctttgctgtcaaccattttgtt；

x5523-33：gacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaat；

x5523-34：gtgtcctcgagtcattatttctttttggtggtcagg；

第一輪pcr程序為：95℃3min；95℃22sec，55℃20sec，72℃30sec，20cyc；72℃5min；

(2)以第一輪pcr的pcr產(chǎn)物為模板，進行第二輪pcr，得到編碼重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的基因序列(或直接由合成公司合成得到優(yōu)化后序列)，其中，反應(yīng)體系(50μl)為：

第二輪pcr程序：95℃3min；95℃22sec，58℃20sec，72℃30sec，24cyc；72℃5min；

(3)將載體pet-32a進行雙酶切，酶切體系(50μl)為：pet-32a1μg；10×fdbuffer5μl；kpni1μl(10u/μl)；xhoi1μl(10u/μl)；ddh2o補足50μl；37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2h；

(4)將步驟(2)擴增得到的pcr產(chǎn)物(圖1)回收純化，然后與步驟(3)酶切后的載體(圖2)連接；其中，連接體系(20μl)為：無縫克隆酶mix8.5μl；目的片段：5μl；酶切載體2μl；ddh2o補充至20μl。50℃pcr儀反應(yīng)1h。

(5)將步驟(4)制得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)，酶切檢測篩選出陽性克隆(圖3)，提取質(zhì)粒pet32a-seb并進行測序，測序結(jié)果如下所示(橫線+斜體為kpni和xhoi酶切位點)：

gagaacctgtacttccagggcgaaagccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcagcaaattcaccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgacaaccacgtctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgtacttcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaactacgacaacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggacaagtacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactactactaccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcccaccagaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgaccgaacacaacggcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgtgttcgaggacggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaagaaaaaagtgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacctggtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgtacgaaaccggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttctggtacgacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtccaagtacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagcaaagacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaataatga

帶his蛋白標(biāo)簽的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的氨基酸序列如下所示：

msdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlagsgsghmhhhhhhssglvprgsgmketaaakferqhmdspdlgtenlyfqgesqpdpkpdelhksskftglmenmkvlyddnhvsainvksidqflyfdliysikdtklgnydnvrvefknkdladkykdkyvdvfganyyyqcyfskktndinshqtdkrktcmyggvtehngnqldkyrsitvrvfedgknllsfdvqtnkkkvtaqeldyltrhylvknkklyefnnspyetgyikfienensfwydmmpapgdkfdqskylmmyndnkmvdskdvkievylttkkk

去his蛋白標(biāo)簽的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白，其氨基酸序列如下所示：

enlyfqgesqpdpkpdelhksskftglmenmkvlyddnhvsainvksidqflyfdliysikdtklgnydnvrvefknkdladkykdkyvdvfganyyyqcyfskktndinshqtdkrktcmyggvtehngnqldkyrsitvrvfedgknllsfdvqtnkkkvtaqeldyltrhylvknkklyefnnspyetgyikfienensfwydmmpapgdkfdqskylmmyndnkmvdskdvkievylttkkk

實施例2表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株的構(gòu)建

取1μl實施例1步驟(5)制得的重組質(zhì)粒pet32a-seb轉(zhuǎn)化bl21(de3)，42℃熱擊90s，冰上靜置2min；然后涂布含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素的lb固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜后，挑取單克隆提取質(zhì)粒并進行測序驗證，得到表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株。

實施例3重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的制備與純化

一、小試培養(yǎng)選擇最佳的誘導(dǎo)條件

(1)挑取實施例2中的表達重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白的菌株的單菌落于試管中加入3ml含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基37℃，220rpm過夜培養(yǎng)；

(2)將過夜培養(yǎng)的菌液按1:100體積比接種于4ml含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)；

(3)當(dāng)od值達到0.6時，添加終濃度為0.5mm的iptg，220rpm，進行如下處理：20℃誘導(dǎo)過夜或37℃誘導(dǎo)4h，未加iptg誘導(dǎo)劑的作為陰性對照。

(4)4000rpm離心10min收集菌體，棄上清，菌體用500μlpbs(ph7.4)緩沖液洗滌懸浮，冰浴中超聲破碎菌體6min，功率400w，超0.5s停1.5s；分別離心收集上清和沉淀，沉淀用500μl包涵體溶解液(8murea，50mmtris-hcl，300mmnacl，ph8.0)溶解，分別取40μl樣品和10μl5×proteinloadingbuffer混勻，沸水浴10min，sds-page檢測。

檢測結(jié)果如圖4所示，37℃誘導(dǎo)4h條件最佳。

二、大量培養(yǎng)與蛋白純化

(1)如小試培養(yǎng)步驟(2)和(3)所示，培養(yǎng)菌液，然后將培養(yǎng)的菌液按1:100體積比接種于4l含有終濃度50μg/ml氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)；當(dāng)od值達到0.6時，添加終濃度為0.5mmiptg，37℃，220rpm，4h誘導(dǎo)，離心收集細胞菌體；

(2)超聲破碎菌體(控制內(nèi)毒素)

①將收集的細菌菌體用破碎buffer(含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗滌懸浮，冰浴中超聲破碎菌體，功率400w，20min(超聲2s，暫停6s為一個循環(huán))；

②超聲完畢，15000rpm，4℃，離心20min，收集上清進行下一步純化；

(3)第一次鎳瓊脂糖親和層析(控制內(nèi)毒素)

①10mlni-ida裝柱，用3倍柱床體積的bindingbuffer1(含0.1％w/vtritonx-114的1×pbs緩沖液，ph7.4)清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②細菌破碎上清上柱，流速為2ml/min，收集穿透液a；

③5倍柱床體積的bindingbuffer1清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer1(含20mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗雜，流速3ml/min，收集穿透液b即為純化后的融合蛋白(蛋白大小為45.7kd)；

⑤washbuffer2(含50mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗雜，流速3ml/min，收集穿透液c；

⑥elutionbuffer(含500mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液d；其中，圖5為細菌破碎上清、穿透液a、穿透液b、穿透液c和洗脫液d的sds-page電泳檢測結(jié)果。

(4)酶切去除蛋白標(biāo)簽

將(3)中收集的穿透液b在1×pbs緩沖液(ph7.4)中透析2h，然后向透析袋內(nèi)加入tev酶，25℃酶切過夜去除標(biāo)簽；

(5)第二次鎳瓊脂糖親和層析

①取5mlni-ida裝柱，用3倍柱床體積的bindingbuffer2(1×pbs緩沖液，ph7.4)清洗平衡柱子，流速5ml/min；

②將步驟(4)酶切后的穿透液b上柱，流速為2ml/min，收集穿透液e；

③2倍柱床體積的bindingbuffer2清洗柱子，流速3ml/min；

④washbuffer1(含20mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗雜，流速3ml/min，收集穿透液f；

⑤elutionbuffer(含500mmimidazole的1×pbs緩沖液，ph7.4)洗脫，流速2ml/min，收集洗脫液g；其中，圖6為酶切前的穿透液b、酶切后的穿透液b、穿透液e、穿透液f和洗脫液g的sds-page電泳檢測結(jié)果。

(6)將步驟(5)收集得到的穿透液e經(jīng)過0.22μmca濾膜過濾，得到重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白(去標(biāo)簽的目的蛋白，蛋白大小為28.4kd)，其中，圖7為該蛋白的sds-page電泳檢測結(jié)果圖。

將步驟(3)制得的純化后的融合蛋白(穿透液b)和步驟(6)制得的去標(biāo)簽的目的蛋白進行westernblot分析，其中，一抗是兔抗his標(biāo)簽(sangonbiotech，編號：d110002)，二抗為羊抗兔(sangonbiotech，編號：d110058)；結(jié)果如圖8所示，圖8泳道2沒有條帶證明蛋白標(biāo)簽去除干凈。

采用sk3071非干擾型蛋白定量試劑盒測定去標(biāo)簽后的目的蛋白的濃度(待測樣品體積為10μl)，根據(jù)圖9和表1所測蛋白吸收值可知，目的蛋白濃度為2.01mg/ml。

表1蛋白量和對應(yīng)測量的480nm波長處的吸收值

本發(fā)明質(zhì)粒構(gòu)建耗時10個工作日；表達檢測耗時5個工作日；表達純化及檢測耗時10個工作日。耗時短，操作簡單，成本低，制得的重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白純度高，活性好?？蛇M一步分裝500μl/tube，-80℃保存，或凍干。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>曾慶明

<120>一種重組金黃色葡萄球菌b型腸毒素蛋白及應(yīng)用

<160>36

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>246

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gluasnleutyrpheglnglygluserglnproaspprolysproasp

151015

gluleuhislysserserlysphethrglyleumetgluasnmetlys

202530

valleutyraspaspasnhisvalseralaileasnvallysserile

354045

aspglnpheleutyrpheaspleuiletyrserilelysaspthrlys

505560

leuglyasntyraspasnvalargvalgluphelysasnlysaspleu

65707580

alaasplystyrlysasplystyrvalaspvalpheglyalaasntyr

859095

tyrtyrglncystyrpheserlyslysthrasnaspileasnserhis

100105110

glnthrasplysarglysthrcysmettyrglyglyvalthrgluhis

115120125

asnglyasnglnleuasplystyrargserilethrvalargvalphe

130135140

gluaspglylysasnleuleuserpheaspvalglnthrasnlyslys

145150155160

lysvalthralaglngluleuasptyrleuthrarghistyrleuval

165170175

lysasnlyslysleutyrglupheasnasnserprotyrgluthrgly

180185190

tyrilelyspheilegluasngluasnserphetrptyraspmetmet

195200205

proalaproglyasplyspheaspglnserlystyrleumetmettyr

210215220

asnaspasnlysmetvalaspserlysaspvallysilegluvaltyr

225230235240

leuthrthrlyslyslys

245

<210>2

<211>744

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gagaacctgtacttccagggcgaaagccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaa60

agcagcaaattcaccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgacaaccacgtc120

tccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgtacttcgacctgatctactccatc180

aaagacaccaaactgggtaactacgacaacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctg240

gcggacaagtacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactactactaccagtgc300

tacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcccaccagaccgataaacgcaagacctgc360

atgtacggcggcgtgaccgaacacaacggcaaccagctggacaaataccgcagcatcacc420

gtgcgcgtgttcgaggacggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaagaaa480

aaagtgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacctggtgaaaaacaaaaaa540

ctgtacgagttcaacaactccccgtacgaaaccggctacatcaagttcatcgaaaacgaa600

aacagcttctggtacgacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtccaagtac660

ctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagcaaagacgtgaaaatcgaagtgtac720

ctgaccaccaaaaagaaataatga744

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gacacggtaccgagaacctgtacttccag29

<210>4

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgggtccggctggctttcgccctggaagtacaggttctcg40

<210>5

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gccagccggacccgaaaccggatgaactgcacaaaagcag40

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

tccatcaggccggtgaatttgctgcttttgtgcagttcat40

<210>7

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

caccggcctgatggaaaacatgaaagtgctgtacgacgac40

<210>8

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

acgttgatggcggagacgtggttgtcgtcgtacagcactt40

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tctccgccatcaacgtgaaaagcatcgatcagttcctgta40

<210>10

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

atggagtagatcaggtcgaagtacaggaactgatcgatgc40

<210>11

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tcgacctgatctactccatcaaagacaccaaactgggtaa40

<210>12

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

tcgacgcggacgttgtcgtagttacccagtttggtgtctt40

<210>13

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

caacgtccgcgtcgagttcaaaaacaaagacctggcggac40

<210>14

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

gtccacgtatttgtctttgtacttgtccgccaggtctttg40

<210>15

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

tacaaagacaaatacgtggacgttttcggcgcgaactact40

<210>16

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

ttttggagaagtagcactggtagtagtagttcgcgccgaa40

<210>17

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

ccagtgctacttctccaaaaagaccaacgacatcaactcc40

<210>18

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>18

tcttgcgtttatcggtctggtgggagttgatgtcgttggt40

<210>19

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>19

agaccgataaacgcaagacctgcatgtacggcggcgtgac40

<210>20

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>20

ttgtccagctggttgccgttgtgttcggtcacgccgccgt40

<210>21

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>21

gcaaccagctggacaaataccgcagcatcaccgtgcgcgt40

<210>22

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>22

tcagcaggtttttgccgtcctcgaacacgcgcacggtgat40

<210>23

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>23

cggcaaaaacctgctgagcttcgatgtgcagaccaacaag40

<210>24

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>24

gttcctgcgcggtcacttttttcttgttggtctgcacatc40

<210>25

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>25

tgaccgcgcaggaactggactacctgacccgtcactacct40

<210>26

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>26

cgtacagttttttgtttttcaccaggtagtgacgggtcag40

<210>27

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>27

gtgaaaaacaaaaaactgtacgagttcaacaactccccgt40

<210>28

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>28

gaacttgatgtagccggtttcgtacggggagttgttgaac40

<210>29

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>29

accggctacatcaagttcatcgaaaacgaaaacagcttct40

<210>30

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>30

cgccggcatcatgtcgtaccagaagctgttttcgttttcg40

<210>31

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>31

gacatgatgccggcgccgggcgacaagttcgaccagtcca40

<210>32

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>32

tcgttgtacatcatcaggtacttggactggtcgaacttgt40

<210>33

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>33

tacctgatgatgtacaacgacaacaaaatggttgacagca40

<210>34

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>34

acacttcgattttcacgtctttgctgtcaaccattttgtt40

<210>35

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>35

gacgtgaaaatcgaagtgtacctgaccaccaaaaagaaat40

<210>36

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>36

gtgtcctcgagtcattatttctttttggtggtcagg36