本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及蠟梅cpsoc1基因及其在花期調(diào)控中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蠟梅(chimonanthuspraecox(l.)link)，屬于蠟梅科(calycanthaceae)蠟梅屬(chimonanthuslindl.)，是我國(guó)特有的名貴觀賞花木。蠟梅是少有的冬季開(kāi)花植物，先花后葉，花朵甜美，花色金黃，花瓣蠟質(zhì)，花香馥郁，是冬季最好的切花材料。蠟梅在園林觀賞方面得到了廣泛應(yīng)用，其藥用和食用價(jià)值也得到了開(kāi)發(fā)和利用。蠟梅是叢生灌木，可高達(dá)3至4米。落葉，葉對(duì)生，半革質(zhì)；花著生于葉腋；最外輪的花被片成褐色鱗片狀，向內(nèi)過(guò)渡為黃色；花期12月至第二年3月；果期8月至9月，屬于聚合瘦果。

在世界范圍內(nèi)將蠟梅科植物分為4個(gè)屬，10個(gè)種。這四個(gè)屬分別是位于澳大利亞昆士蘭的椅子樹(shù)屬(idiospermunblake)，美國(guó)東南部和加利福尼亞州生長(zhǎng)的美國(guó)蠟梅屬(calycantusl.)，還包括原產(chǎn)中國(guó)溫帶的夏蠟梅屬(sinocalycanthuscheng)及蠟梅屬(calycantusl.)。李燁(1998)通過(guò)研究蠟梅各屬之間的演化及發(fā)展關(guān)系，又把蠟梅科分為了兩個(gè)亞科，分別是椅子樹(shù)亞科(idiospermoideae)及蠟梅亞科(calycanthoideae)，其中蠟梅亞科包括夏蠟梅屬、蠟梅屬及美國(guó)蠟梅屬，而椅子樹(shù)亞科只有椅子樹(shù)屬。四個(gè)屬中演化水平最高的屬是椅子樹(shù)屬，而最原始的屬是蠟梅屬。

蠟梅屬是4個(gè)屬中我國(guó)特有的屬，張若蕙(1999)曾在《世界蠟梅》中提到蠟梅屬有6種1變種。六個(gè)種包括西南蠟梅(c.campanulatusr.h.changetc.s.ding)位于我國(guó)云南的東北部，柳葉蠟梅(c.salicifoliuss.y.hu)分布于江浙一帶，浙江蠟梅(c.zhejiangensism.c.liu)產(chǎn)于我國(guó)的浙江南部及福建北部，山臘梅(c.nitenoliv.)生長(zhǎng)在廣西東北部、湖北南部及湖南南部，蠟梅(c.praecox(l.)link)分布在我國(guó)的中部，突托蠟梅(c.grammatusm.c.liu)目前只生長(zhǎng)在江西安遠(yuǎn)，一個(gè)變種是分布在貴州興義的貴州蠟梅(c.campanulatusr.h.changetc.s.dingvar.guizhouensisr.h.chang,var.nov.)，是由西南蠟梅(c.campanulatusr.h.changetc.s.ding)演變發(fā)展而來(lái)。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，生物技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物和微生物的研究中。有關(guān)蠟梅的分子生物學(xué)研究主要分為品種分類和基因功能兩部分。目前rapd、issr等分子標(biāo)記技術(shù)已熟練地用于蠟梅的品種分類和群居遺傳結(jié)構(gòu)分析等。杜靈娟(2012)等人采用rapd技術(shù)對(duì)南京地區(qū)38個(gè)蠟梅品種自然居群遺傳變異進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)群內(nèi)每個(gè)單株之間的遺傳差異比較大，而居群間的遺傳距離較近，因此得出遺傳變異主要發(fā)生于群居內(nèi)，這與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相符合。趙明曉等(2011)分別將蠟梅成熟葉及嫩葉的基因組進(jìn)行提取檢測(cè)比較，為后人利用aflp技術(shù)對(duì)蠟梅品種分類及自然居群遺傳多樣性分析進(jìn)行了鋪墊。而趙冰等人建立有關(guān)蠟梅的aflp分子標(biāo)記體系，為aflp技術(shù)用于研究蠟梅系統(tǒng)發(fā)育及遺傳多樣性打下基礎(chǔ)(趙冰，2007)；楊佳(2012)采用了est-ssr技術(shù)對(duì)蠟梅的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析，對(duì)蠟梅的遺傳結(jié)構(gòu)特征及遺傳多樣性水平進(jìn)行了初步探討。

此外，眭順照(2006)構(gòu)建了第一個(gè)蠟梅花cdna文庫(kù)，且對(duì)蠟梅開(kāi)花過(guò)程中的基因進(jìn)行了表達(dá)分析，在其基礎(chǔ)上先后克隆出不同功能相關(guān)的基因，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究；如cpcor413pm1(秦華，2006)與蠟梅的抗寒性相關(guān)，將其轉(zhuǎn)入煙草，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行處理發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力提高；cpap3與花瓣?duì)钇鞴侔l(fā)育形成有關(guān)；cppex22與抗衰老、抗氧化存在一定關(guān)系；將cpagl6轉(zhuǎn)入擬南芥中，與野生型擬南芥相比出現(xiàn)提前開(kāi)花、植株矮化、雄蕊的形態(tài)及數(shù)目都發(fā)生了變化；cpkti胰蛋白酶抑制基因，將其轉(zhuǎn)入煙草超量表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草的抗蟲(chóng)性提高；cpchia(謝樹(shù)章，2009)幾丁質(zhì)酶基因；cppr-4(秦朝，2012)病程相關(guān)蛋白基因等。上述蠟梅基因功能的初步研究，為以后蠟梅分子生物學(xué)研究做出一定貢獻(xiàn)。

花發(fā)育相關(guān)基因中大部分都來(lái)自一個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子基因家族—mads-box基因家族。mads的名稱來(lái)源于mcm1(minichromosomemaintenancegene)(來(lái)自啤酒酵母)(passmoreetal.1988)、ag(來(lái)自擬南芥)(yanofskyetal.1990)、def(deficiens)(來(lái)自金魚(yú)草)(schwarz-sommeretal.1992)和srf(serumresponsefactor)(來(lái)自現(xiàn)代人)(normanetal.1988)四個(gè)最早被鑒定的該家族成員的首字母。

人們已經(jīng)從被子植物各大類群中分離到了大量的mikc^c型mads-box基因，并對(duì)這些基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了重建，研究表明被子植物中的這些mads-box基因可被劃歸到12個(gè)主要的基因亞家族(genesubfamilies)中去：ap1/squa、ap3/pi、ag/stk、sep、agl6、ggm13、svp/stmads11、soc1/tm3、agl12、agl17、agl15和flc(beckerandtheissen2003)。在許多雙子葉植物如擬南芥、番茄和金魚(yú)草中,大多數(shù)svp基因在花分生組織的確定和控制開(kāi)花時(shí)間中起作用。soc1是mads-box基因家族soc1/tm3亞家族中的一員，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要作用，尤其是在植物成花誘導(dǎo)過(guò)程中。soc1可以誘導(dǎo)植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)。植物開(kāi)花過(guò)程十分復(fù)雜，但是開(kāi)花信號(hào)在網(wǎng)絡(luò)途徑傳播中最終還是將開(kāi)花信號(hào)集中與開(kāi)花整合子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控上。soc1在植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段被flc和svp形成的復(fù)合體所抑制，但在成花過(guò)程中g(shù)a途徑，自主途徑等都會(huì)下調(diào)flc及svp的表達(dá)水平，從而消除對(duì)soc1抑制作用，促進(jìn)植物開(kāi)花(taoetal.,2012)。目前已克隆了多個(gè)soc1的同源基因，例如大豆(glycinemax)中g(shù)mgal1，甜橙(citrussinensis)中cscl1和cssl2，矮牽牛(petuniahybrid)中uns等。但蠟梅中還未有相關(guān)報(bào)道，所以本實(shí)驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上對(duì)蠟梅cpsoc1的功能進(jìn)行研究。

蠟梅作為少有的冬季開(kāi)花植物，且花香濃郁，具有較高經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值。因此對(duì)其花發(fā)育研究十分有意義。而soc1基因是與花發(fā)育相關(guān)的重要基因，所以，對(duì)蠟梅中cpsoc1基因功能分析可以為進(jìn)一步研究蠟梅開(kāi)花機(jī)制提供一些有價(jià)值的參考，并且為植物分子育種提供基因資源。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供蠟梅cpsoc1基因及其在花期調(diào)控中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的蠟梅cpsoc1蛋白，其為：

1)由seqidno.2所示的氨基酸組成的蛋白質(zhì)；或

2)在seqidno.2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供蠟梅cpsoc1蛋白的編碼基因，即cpsoc1基因的cdna序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明還提供含有cpsoc1基因的載體、宿主細(xì)胞及工程菌。

本發(fā)明還提供cpsoc1基因在調(diào)控植物花期中的應(yīng)用。所述植物為擬南芥。

本發(fā)明還提供cpsoc1基因在延長(zhǎng)植物花萼宿存時(shí)間中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供cpsoc1基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將含有cpsoc1基因的載體轉(zhuǎn)入植物組織中，篩選轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明首次克隆獲得蠟梅cpsoc1基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在植物(擬南芥)中驗(yàn)證了該基因的功能，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥花期較對(duì)照提前，轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)量高的株系和表達(dá)量中等的株系花萼的宿存時(shí)間較對(duì)照顯著延長(zhǎng)，為植物的花期調(diào)控和觀賞價(jià)值提升提供了可能。

附圖說(shuō)明

圖1為蠟梅cpsoc1蛋白序列比對(duì)(a)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(b)；其中，cp：蠟梅chimonanthuspraecox；mv：弗吉尼亞木蘭magnoliavirginiana(acv88635.1)；nu：荷花nelumbonucifera(xp_010272601.1)；atrr：無(wú)油樟amborellatrichopoda(xp_006829116.1)；jr：胡桃juglansregia(xp_018820387.1)；gm：大豆glycinemax(np_001236377.1)；vv：葡萄vitisvinifera(xp_010661478.1)；cc：山核桃caryacathayensis(ahi85950.1)；c：黃麻corchoruscapsularis(omo78683.1)；ph：矮牽牛petuniaxhybrida(aak21253.1)；nt：煙草nicotianatabacum(caa53782.1)；pt：美洲山楊populustremuloides(aap46287.1)；pm：車前plantagomajor(caj38368.1)；md：蘋(píng)果malusdomestica(np_001280844.1)；ta：小麥triticumaestivum(abf57922.1)；hv：大麥hordeumvulgare(baj99551.1)；os：水稻oryzasativa(xp_015630979.1)；cs：甜橙citrussinensis(abs84660.1)；g：非洲菊gerberahybrid(cbx45125.1)；eg：桉樹(shù)eucalyptusgrandis(np_001289658.1)；at：擬南芥arabidopsisthaliana，soc1(np_182090.1)、svp(oap09055.1)和agl24(np_194185.1)。mi：杧果mangiferaindica(akj85721.1)；zm：玉米zeamays(air75259.1)。

圖2為cpsoc1實(shí)時(shí)定量pcr分析結(jié)果，actin基因作為內(nèi)參。

圖3為35s::cpsoc1#超量表達(dá)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(col-0)t2代在長(zhǎng)日照(14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗)條件下實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)結(jié)果；cpsoc1相對(duì)表達(dá)量。三個(gè)重復(fù)，actin作為內(nèi)參。

圖4為35s::cpsoc1超量表達(dá)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(col-0)t2代的表型分析結(jié)果。

圖5為35s::cpsoc1超量表達(dá)轉(zhuǎn)化野生型擬南芥(col-0)t2代在長(zhǎng)日照(14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗)條件下實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)結(jié)果；tfl1(5a)、flc(5b)、svp(5c)、ga(5d)、ft(5e)、co(5f)、soc1(5g)、lfy(5h)、ap1(5i)相對(duì)表達(dá)量。三個(gè)重復(fù)，tubulin作為內(nèi)參。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

實(shí)施例1蠟梅cpsoc1基因的克隆及表達(dá)分析

1蠟梅cpsoc1基因克隆

1.1總rna的提取

(1)取罄口蠟梅(chimonanthuspraecox)(種植于重慶市北碚區(qū)天生路2號(hào)西南大學(xué)校園內(nèi)第四運(yùn)動(dòng)場(chǎng)旁邊，常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理)花芽、花蕾(4、5、7、9月份)、盛開(kāi)、衰敗及葉片混合樣品。rna提取所用的玻璃器皿、研缽、研杵、剪刀、鑷子、藥勺等均用0.1％depc水溶液在37℃下浸泡處理12h，然后用錫紙包裹于180℃烘箱中干熱滅菌4h后冷卻備用。

rna提取采用北京天根公司生產(chǎn)的rnapreppure植物總rna提取試劑盒，提取過(guò)程根據(jù)說(shuō)明書(shū)略有改動(dòng)，具體操作如下：

(1)取500μl裂解液rl轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入1％β-巰基乙醇，混勻備用。液氮中研磨適量植物組織成細(xì)粉后，取50mg細(xì)粉轉(zhuǎn)入離心管中，加入上述rl500μl,立即用渦旋振蕩器劇烈震蕩混勻，使其充分裂解。

(2)將溶液于12,000rpm離心5min，小心吸取收集管中的上清至新的rnase-free離心管中，吸頭盡量避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀。

(3)緩慢加入0.5倍上清體積的無(wú)水乙醇(通常為250μl)，混勻(此時(shí)可能出現(xiàn)沉淀)，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

(4)dnasei工作液的配制：取10μldnasei儲(chǔ)存液放入新的rnase-free離心管中，加入70μlrdd溶液，輕柔混勻。

(5)向吸附柱cr3中央加入80μldnasei工作液，室溫放置15min。

(6)向吸附柱cr3中央加入350μl去蛋白液rw1，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。

(7)向吸附柱cr3中央加入500μl漂洗液rw(使用前加入無(wú)水乙醇)，室溫靜置2min，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中。重復(fù)該步驟一次。

(8)12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cr3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(9)將吸附柱cr3放入一個(gè)新的rnase-free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加20-100μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12,000rpm離心2min，得到rna溶液。

1.23’race技術(shù)克隆cpsoc1基因3’末端cdna

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)與蠟梅親緣關(guān)系較近物種的soc1基因保守部分序列設(shè)計(jì)3'race簡(jiǎn)并引物，以蠟梅cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到蠟梅cpsoc1的部分3'racecdna序列，在獲得的序列5'端用軟件primerprimer5.0設(shè)計(jì)兩輪race的特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將獲得5'端的序列與原來(lái)序列進(jìn)行電子拼接得到蠟梅cpsoc1全長(zhǎng)cdna序列，通過(guò)分析蠟梅cpsoc1全長(zhǎng)cdna序列，用軟件primerprimer5.0在跨最大開(kāi)放閱讀框的兩端設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物的序列(見(jiàn)表1)：

表1蠟梅cpsoc1基因克隆引物

注：r：a/g；s：g/c；y：c/t；k：g/t；w：a/t；引物后f代表上游，r代表下游。

(1)3'race第一鏈cdna的反轉(zhuǎn)錄合成

以上面提取的蠟梅花芽、花蕾、盛開(kāi)、衰敗及葉片總rna混合樣為模板，用引物3'-racecdsprimera(表1)，使用美國(guó)clontech公司的smarterrace5'3'kit試劑盒進(jìn)行3'racecdna第一鏈合成。按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行，具體反轉(zhuǎn)錄體系與程序如下：

反轉(zhuǎn)錄體系：

蠟梅總rna1-11μl

3'-cdsprimera1μl

sterileh2o0-10μl

充分混勻，短暫離心。42℃，溫育90min，72℃加熱10min。-20℃放置可保存3個(gè)月。

(2)3'racepcr擴(kuò)增第一輪

以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cdna為模板，以3'race上游簡(jiǎn)并引物和upm(universalprimermix)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)程序：

94℃變性5min；94℃變性30s，63℃退火30s，72℃延伸1min，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，3個(gè)循環(huán)；94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，15個(gè)循環(huán)72℃延伸10min。

電泳檢測(cè)：取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(1％)電泳，用凝膠成像系統(tǒng)(bio-radmolecμlarimagergeldoxxr+紫外與可見(jiàn)分析系統(tǒng))進(jìn)行觀察，拍照。

(3)3'racepcr擴(kuò)增第二輪

3'racepcr擴(kuò)增第二輪以稀釋50倍的第一輪的產(chǎn)物為模板，正向引物為3'race第二輪簡(jiǎn)并引物，反向引物用nesteduniversalprimera，反應(yīng)體系，pcr程序及其他同3'racepcr擴(kuò)增第一輪相同。

(4)結(jié)果檢測(cè)：取pcr產(chǎn)物5μl，電泳檢測(cè)。

1.35’race技術(shù)克隆cpsoc1基因5’末端cdna

以上面提取的蠟梅花芽、花蕾、盛開(kāi)、衰敗及葉片總rna的混合樣為模板，用引物5'-cdsprimera和smarteriiaoligonucleotide引物的序列，使用美國(guó)clontech公司的smarterrace5'3'kit試劑盒進(jìn)行5'racecdna第一鏈的合成。按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作，具體反應(yīng)體系及pcr程序如下：

反轉(zhuǎn)錄體系：

充分混勻，短暫離心。72℃，溫育3min，42℃冷育2min。

充分混勻，短暫離心。42℃，溫育90min，72℃加熱10min。-20℃放置可保存3個(gè)月。用時(shí)加tricineedtabuffer稀釋。

1.45'racepcr擴(kuò)增

(1)5'racepcr擴(kuò)增第一輪

以反轉(zhuǎn)錄合成的5'racecdna第一鏈為模板，正向引物為upm(universalprimermix)，反向引物為5'race第一輪引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系：

pcr反應(yīng)程序：

94℃變性5min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，26個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

電泳檢測(cè)：取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠(％)電泳，用凝膠成像系統(tǒng)(bio-radmolecμlarimagergeldoxxr+紫外與可見(jiàn)分析系統(tǒng))進(jìn)行觀察，拍照。

(2)5'racepcr擴(kuò)增第二輪

5'racepcr擴(kuò)增第二輪以稀釋50倍的第一輪的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，正向引物為nesteduniversalprimera，反向引物為5'race第二輪特異引物，反應(yīng)體系，pcr程序及其他同5'racepcr擴(kuò)增第一輪相同。

1.5pcr回收產(chǎn)物的純化

pcr擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物用l％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測(cè)，將3’race擴(kuò)增產(chǎn)物中大小為800-1000bp之間的條帶和5’race特異條帶切下來(lái)，進(jìn)行回收，并按照天根公司普通瓊脂糖凝膠dna膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)目的dna片段進(jìn)行回收。

1.6pcr回收產(chǎn)物的連接

連接反應(yīng)體系見(jiàn)表3。

表3連接反應(yīng)體系

4℃過(guò)夜,進(jìn)行連接反應(yīng)。

1.7cacl2法制備大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞

(1)從新活化的大腸桿菌平板上挑取一單菌落，接種于3-5mllb液體培養(yǎng)中，37℃振蕩培養(yǎng)12h左右，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將該菌懸液以1：100-1：50轉(zhuǎn)接于50mllb液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，至od600為0.4-0.6時(shí)停止培養(yǎng)。

(2)將培養(yǎng)液倒入在冰上預(yù)冷好的無(wú)菌50ml離心管中，冰上放置10min，于4℃，4,100rpm，離心10min。

(3)倒凈上清培養(yǎng)液，在無(wú)菌濾紙上倒置1min，用30ml冰上預(yù)冷的0.1mcacl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，4℃，4,100rpm，離心10min。

(4)棄去上清液，加入2ml冰上預(yù)冷的0.1mo1/lcacl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞。冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液；制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積15％左右高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻分裝后用液氮澆于其上迅速結(jié)凍后于-80℃保存。

1.8連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞

(1)將大腸桿菌感受態(tài)從-80℃冰箱取出，置于冰上融化。將連接產(chǎn)物于70℃水浴鍋中滅活10min。

(2)將連接產(chǎn)物或待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，按照每200μl感受態(tài)細(xì)胞加入100ng已純化質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)，加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后在冰上靜置30min。

(3)42℃水浴中熱激90s，迅速取出后立即置于冰上2min。

(4)加入600μl37℃預(yù)熱的無(wú)抗lb液體培養(yǎng)基，混勻后于37℃，130rpm震蕩培養(yǎng)1h。

(5)室溫下10,000rpm離心1min，棄掉400μl上清液，將剩余的200μl菌夜重懸，用無(wú)菌的涂棒將重懸菌液均勻涂在含有相應(yīng)抗生素的lb固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-14h。

1.9陽(yáng)性克隆培養(yǎng)與pcr鑒定

單克隆通過(guò)iptg/x-gal篩選，取無(wú)菌的1.5ml離心管，加入0.5ml含50mg/lamp的lb液體培養(yǎng)基，從轉(zhuǎn)化過(guò)的平板上用無(wú)菌牙簽輕輕挑取單菌落置于離心管中，37℃200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)8-10h，待菌液渾濁后，以其作為模板進(jìn)行pcr鑒定。

菌液pcr擴(kuò)增體系：

pcr反應(yīng)程序：

94℃變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，26個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.10測(cè)序及序列分析

選擇插入片段大小與預(yù)期接近且特異的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。蠟梅cpsoc1基因的cdna序列如seqidno.2所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。

蠟梅cpsoc1基因cdna全長(zhǎng)917個(gè)核苷酸，包含1個(gè)12bp(1-12bp)的5'-utr區(qū)(5'-untranslatedregion)，1個(gè)678bp(13-690bp)的完整開(kāi)放閱讀框(openingreadframe，orf)和1個(gè)227bp(691-917bp)的3'-utr區(qū)(3'-untranslatedregion)。編碼區(qū)由241個(gè)a、169個(gè)g、131個(gè)c、和137個(gè)t組成，a+t含量約為55.75％，g+c含量約為44.25％。

將蠟梅cpsoc1蛋白與荷花、木蘭、大豆、葡萄、擬南芥(arabidopsisthaliana)等植物的soc1蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)。結(jié)果(如圖1a)，蠟梅cpsoc1蛋白與其他soc1蛋白具有較高的相似性，相似度約59.29％，結(jié)構(gòu)比較保守。與其他同源蛋白一樣，蠟梅soc1蛋白具有最保守的m區(qū)，半保守的k區(qū)，保守性相對(duì)較差的i區(qū)及最不保守的c末端。

蠟梅cpsoc1各類基因的系統(tǒng)發(fā)育分析除了來(lái)自于本發(fā)明所獲得的基因及蛋白序列之外，其他數(shù)據(jù)均來(lái)自ncbi中公開(kāi)發(fā)表的數(shù)據(jù)?；趍ikc結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列用mega4.0構(gòu)建的nj樹(shù)(tamuraetal,2007)。結(jié)果如圖1b，圖中可以看出不同物種的soc1同源基因聚為一支，擬南芥的atsvp和atagl24聚為一支；單子葉植物的soc1同源基因聚為一支，雙子葉植物的soc1同源基因聚為一支，且蠟梅與無(wú)油樟、荷花、木蘭聚為一支親緣關(guān)系較近，說(shuō)明其進(jìn)化地位比較低。

2蠟梅cpsoc1基因表達(dá)分析

對(duì)蠟梅cpsoc1基因在不同月份的花序原基或花序中表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)該基因在4月(4im)，5月(5im)，7月(7fm)和9月(9fm)中均有表達(dá)，但表達(dá)水平有較大差異(圖2)。該基因在5im時(shí)期表達(dá)量最高，是其他月份中表達(dá)量的6倍以上，其他月份中表達(dá)量相差不大(圖2)。

實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟梅cpsoc1基因轉(zhuǎn)化(擬南芥)

1表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，本實(shí)施例中利用了載體pcambia2301g上的多克隆酶切位點(diǎn)特性，將克隆載體上的cdna片段酶切后連接到表達(dá)載體當(dāng)中。

2農(nóng)桿菌gv3101和eha105電激感受態(tài)細(xì)胞的制備和表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化

(1)挑取新鮮的農(nóng)桿菌gv3101和eha105單菌落于10mllb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)晚期；

(2)取1ml菌液加入100ml新鮮lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至od600約為0.5-1.0；

(3)將菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，冰浴30分鐘；

(4)4℃，4000rpm離心10分鐘，收集菌體，棄上清；

(5)沉淀用50ml預(yù)冷的hepes滅菌蒸餾水重懸；

(6)4℃，4000rpm離心10分鐘，收集菌體，棄上清；

(7)重復(fù)操作(5)、(6)兩次，每次hepes減半；

(8)用含10％甘油的滅菌蒸餾水重懸菌體，按每管50μl體積分裝至1.5mleppendorf管中，即為農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，分裝后直接使用或于-70℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(9)取50μl上述制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入0.5μg質(zhì)粒，輕輕混勻，置于冰上；

(10)2500伏電擊5ms，立刻加入500μllb液體培養(yǎng)基；

(11)28℃，150rpm，恢復(fù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)；

(12)涂布適量的細(xì)胞于篩選lb固體培養(yǎng)基平板上，超凈臺(tái)吹干表層液體，28℃培養(yǎng)2-3天。

3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化(花芽浸泡法)

待擬南芥花序抽苔約1cm高時(shí)，剪去主花序。待植株發(fā)出側(cè)生花序，并生長(zhǎng)至花蕾未展開(kāi)時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。接種含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌克隆于5mllb液體培養(yǎng)基(gen：50mg/l，kan：50mg/l)中，28℃，200rpm中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；按1:50的比例轉(zhuǎn)接到200mllb液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，振蕩培養(yǎng)5小時(shí)；5000rpm，離心15分鐘，收集菌體；重懸于緩沖液(5％蔗糖，0.03％silwetl-77)中，調(diào)od600至0.8。將花序倒置放入混好的農(nóng)桿菌菌液中10秒，用保鮮膜覆蓋整個(gè)花序，24小時(shí)后取下保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)于培養(yǎng)室(22℃，14小時(shí)光照/10小時(shí)黑暗)，直至收獲種子(cloughandbent,1998)。

4擬南芥陽(yáng)性苗的篩選

(1)將收獲的轉(zhuǎn)化擬南芥種子在70％乙醇中浸泡2分鐘，去上清；

(2)次氯酸鈉溶液浸泡5分鐘進(jìn)一步進(jìn)行消毒處理，用無(wú)菌水漂洗3－5次；

(3)將擬南芥種子播于含50μg/ml抗生素kan的1/2ms培養(yǎng)基平板上；

(4)如果穿梭載體上具kan抗性的報(bào)告基因，將培養(yǎng)平板置于光照培養(yǎng)室(22℃，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)7-10天；選擇經(jīng)過(guò)kan篩選后長(zhǎng)勢(shì)良好，真葉葉片及生長(zhǎng)點(diǎn)呈深綠色且根部可以扎入培養(yǎng)基的植株，初步確定為陽(yáng)性苗，移栽入土中。

5實(shí)時(shí)定量rt-pcr

以轉(zhuǎn)基因擬南芥t2代和以蠟梅各器官為材料，用trizol試劑盒提取總rna，然后用primescriptrtreagentkit(takara,japan)進(jìn)行cdna第一鏈的反轉(zhuǎn)錄。將cdna第一鏈稀釋10倍后作為模板進(jìn)行pcr反應(yīng)。然后利用sybrpremixextaq(bio-rad,usa)反應(yīng)試劑盒，在bio-radcfx96熒光定量pcr儀(bio-rad，美國(guó))上完成反應(yīng)。分析所獲得的數(shù)據(jù)并計(jì)算樣品中目的基因濃度。pcr反應(yīng)體系為10μl，共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，反應(yīng)條件為40個(gè)循環(huán)，95℃60秒，95℃5秒，60℃34秒。

6轉(zhuǎn)基因擬南芥株系cpsoc1基因表達(dá)分析

(1)轉(zhuǎn)基因擬南芥表達(dá)量檢測(cè)

為了可以進(jìn)一步驗(yàn)證cpsoc1基因在轉(zhuǎn)基因的擬南芥中的表達(dá)水平，提取野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥較嫩葉片的總rna，進(jìn)行cdna第一鏈反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cdna第一鏈做為模板，把擬南芥actin基因作為內(nèi)參基因，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥中cpsoc1基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)及分析，熒光定量pcr結(jié)果(圖3)。野生型的擬南芥中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到cpsoc1基因的表達(dá)，在檢測(cè)的11個(gè)轉(zhuǎn)基因的擬南芥單株中，cpsoc1基因的表達(dá)水平差異較大，其中5號(hào)株系的表達(dá)量最高，16號(hào)株系中高，8號(hào)株系表達(dá)量次之，其余單株系的表達(dá)量較低。在后期對(duì)轉(zhuǎn)基因的擬南芥分析時(shí)，根據(jù)熒光定量的結(jié)果，選取表達(dá)量最高的5-30號(hào)、表達(dá)量中等的16-27號(hào)和表達(dá)量稍低的8-27號(hào)代表不同表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型觀察。

7轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

(1)花期提前：野生型擬南芥作為對(duì)照，對(duì)純合的轉(zhuǎn)基因擬南芥t2株系進(jìn)行表型觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的顯蕾時(shí)間、抽葶時(shí)間、第一朵花開(kāi)的時(shí)間和第一個(gè)果莢出現(xiàn)時(shí)間均比野生型擬南芥植株早，但是現(xiàn)蕾時(shí)間cpsoc1/8-27與wt之間沒(méi)有顯著差異，而cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30與wt相比具有顯著差異；抽葶時(shí)間cpsoc1/8-27和cpsoc1/16-27與wt之間沒(méi)有顯著差異，而cpsoc1/5-30與wt相比具有顯著差異；第一朵花開(kāi)的時(shí)間cpsoc1/8-27，cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30與wt相比三者都具有顯著差異；第一個(gè)果莢的時(shí)間cpsoc1/8-27與wt之間沒(méi)有顯著差異，而cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30與wt相比且具有顯著差異；轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系與野生型擬南芥相比蓮座葉的數(shù)量均比野生型的減少，其中cpsoc1/8-27與wt之間差異不顯著(蓮座葉平均數(shù)為10.08和11.02片)，而cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30(蓮座葉平均數(shù)為6.53和6.33片)與wt相比具有顯著差異；轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系與野生型擬南芥相比，cpsoc1/5-30莖生葉數(shù)量比野生型的增多，而其他兩個(gè)株系都比野生型的少，其中cpsoc1/5-30與wt之間差異不顯著，而cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30與wt相比具有顯著差異；轉(zhuǎn)基因三個(gè)株系的葉片總數(shù)都比野生型減少，其中cpsoc1/8-27與wt之間差異不顯著，而cpsoc1/16-27和cpsoc1/5-30與wt相比具有顯著差異(表2，圖4)。

(2)株高變高、花萼宿存：轉(zhuǎn)基因擬南芥的三個(gè)株系與野生型擬南芥相比株高都變高了，其中cpsoc1/8-27和cpsoc1/16-27與野生型相比具有顯著差異，而cpsoc1/5-30與野生型相比則具有極顯著差異(表2，圖4)。轉(zhuǎn)基因擬南芥還發(fā)現(xiàn)了表達(dá)量高的株系和表達(dá)量中等的株系花萼的宿存時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)低的株系和野生型的擬南芥卻不會(huì)有花萼宿存的現(xiàn)象。

表235s::cpsoc1/擬南芥t2代株系表型相關(guān)指標(biāo)觀察

每組數(shù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；a、b、c、d表示p<0.05水平上差異顯著；

可以看出，表達(dá)量越高顯蕾時(shí)間、抽葶時(shí)間、開(kāi)花時(shí)間越提前，其蓮座葉和葉片總數(shù)的數(shù)量越少。由于植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的時(shí)間提前，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)間變短，所以蓮座葉和葉片總數(shù)的數(shù)目變少，開(kāi)花時(shí)間提前等。由以上的結(jié)果可以得出cpsoc1基因具有促進(jìn)植物開(kāi)花和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能。

8轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)源基因的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)

為了研究轉(zhuǎn)入擬南芥的cpsoc1基因的超表達(dá)對(duì)其自身開(kāi)花基因的影響，分別對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及野生型擬南芥提取rna，進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)，結(jié)果表明擬南芥中轉(zhuǎn)入cpsoc1會(huì)使其自身的ap1和lfy表達(dá)量升高，對(duì)其他基因的表達(dá)量影響較小(圖5)。擬南芥開(kāi)花過(guò)程受到flc、ap1、soc1和lfy等基因的共同調(diào)節(jié)，其中flc對(duì)ft和soc1起到抑制作用，soc1和ap1等基因可以促進(jìn)植物開(kāi)花，flc對(duì)植物開(kāi)花起到抑制作用。由此可以推測(cè)出cpsoc1的超量表達(dá)使植物開(kāi)花的ap1基因和lfy基因的表達(dá)量上調(diào)，從而促使轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花時(shí)間提前。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>西南大學(xué)

<120>蠟梅cpsoc1基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用

<130>

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>917

<212>dna

<213>蠟梅（chimonanthuspraecox）

<400>1

acatgggtgaggatggtgagagggaaaacgcagatgcggcggatagagaacgcggcgagc60

aggcaagtaaccttctccaagcggaggaatgggctgttgaagaaggcgttcgagctctcc120

gttctctgcgatgctgaggtcgctcttattgtcttctctccgaggggcaagctctacgaa180

ttcgccagctccagcataccaaagacgatagaacgttaccgaggccaatcgaaagaagta240

agcatcaacaacaaaacagtggaacaaagcatgcagcatttgaaatatgaagctacacac300

cttgtgaagaagatggagcttcttgaactctccaaaaggaaacttttgggtgaaaatctg360

gattcatgttctgttgaggaactgcaacacatagaaaaccagttggaaagaagtgttagc420

aacattagaagaagaaagactcaattatataaggatctgatcgaacaactaaaagagaag480

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attcagaaggaaactgccacccacaatcatggtgacaaagaaattgccccctgccatcat600

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aaatacaactcttagaagggaagctgattccgttgtttatttatttcaaatcatgtgtgt780

acgacactcttaagctttgattttaatgattcttagtgaaataatttacagagaagaaaa840

atgtatgagtttggaagattttattcagagaaacagctaccttgtaatgcaaaaaaaaaa900

aaaaaaaaaaaaaaagt917

<210>2

<211>225

<212>prt

<213>mvrgktqmrrienaasrqvtfskrrngllkkafelsvlcdaevalivfsprgklyefasssipktieryrgqskevsinnktveqsmqhlkyeathlvkkmellelskrkllgenldscsveelqhienqlersvsnirrrktqlykdlieqlkekerilseenailckkaeeqsiiqketathnhgdkeiapchhhnstgesdvetglyigrpergrtryalqd

<400>2

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151015

argglnvalthrpheserlysargargasnglyleuleulyslysala

202530

phegluleuservalleucysaspalagluvalalaleuilevalphe

354045

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505560

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65707580

lysthrvalgluglnsermetglnhisleulystyrglualathrhis

859095

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100105110

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115120125

asnglnleugluargservalserasnileargargarglysthrgln

130135140

leutyrlysaspleuilegluglnleulysglulysgluargileleu

145150155160

serglugluasnalaileleucyslyslysalaglugluglnserile

165170175

ileglnlysgluthralathrhisasnhisglyasplysgluileala

180185190

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195200205

leutyrileglyargprogluargglyargthrargtyralaleugln

210215220

asp

225

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>nisa,c,g,ort

<400>3

aagcagtggtatcaacgcagagtactvn28

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cargtsaccttytgcaarcg20

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tcygtkctytgtgatgcwg19

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctgaatgattgattgctcttctgcc25

<210>7

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgttctatcgtctttggtatgctggag27

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tgggtgaggatggtgagag19

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gtatggtcaccgcacagat19

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

agcggataacaatttcacacagg23

<210>11

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

cgccagggttttcccagtcacgac24