本發(fā)明涉及一種試劑盒及其制備方法，具體涉及一種從血清中獲取天然前白蛋白的方法及其制備方法。
背景技術(shù)：
重組pa純度高，但在抗原決定簇和蛋白結(jié)構(gòu)上與天然pa有差異，導(dǎo)致pa抗體對(duì)重組pa和天然pa存在不同的識(shí)別情況，并且重組pa價(jià)格昂貴，因而從血清中獲取高濃度天然前白蛋白是一種最為有效的方式。但是由于pa蛋白和alb蛋白具有相近的等電點(diǎn)和分子量，現(xiàn)有技術(shù)中的分離純化過(guò)程難區(qū)分兩種蛋白，蛋白測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在alb和pa的復(fù)合物中，隨著alb蛋白濃度的逐漸升高pa蛋白濃度測(cè)定值逐步降低。因此，去除alb蛋白顯得尤為重要。
東華大學(xué)的專利公開了一種固相萃取劑富集人血漿中前白蛋白的方法(申請(qǐng)?zhí)?01610109013.1)，包括：將氧化石墨烯分散液超聲霧化，然后通過(guò)400℃～450℃的石英管，收集，干燥，得到石墨烯微球固相萃取劑；將氯化鈉加入到含有前白蛋白的血漿中，然后加入苯酚溶液，攪拌，靜置，離心，得上清液；將石墨烯微球加入到固相萃取柱，然后活化固相萃取柱，然后將上清液通過(guò)固相萃取柱，淋洗，真空泵抽至進(jìn)干，洗脫，氮吹濃縮，進(jìn)入hplc分析檢測(cè)。該方法并未考慮去除白蛋白步驟，并且提取過(guò)程繁瑣、復(fù)雜。
山西瑞亞力科技有限公司的專利公開了從血漿中純化前白蛋白和視黃醇結(jié)合蛋白的方法(申請(qǐng)?zhí)?01510019329.7)。該方法包括下述步驟：取血漿，使用陰離子交換柱對(duì)其進(jìn)行第一次層析純化處理，獲得pa-rbp復(fù)合物初體；使用疏水柱對(duì)所述pa-rbp復(fù)合物初體進(jìn)行第二次層析純化處理，得到純化后的pa-rbp復(fù)合物；將所述純化后的pa-rbp復(fù)合物進(jìn)行解離處理，得到含有pa和rbp的混合樣品；使用疏水柱對(duì)將所述混合樣品進(jìn)行第三次層析純化處理，分離得到pa和rbp。該方法并未考慮去除白蛋白步驟，并且提取過(guò)程繁瑣、復(fù)雜。
財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所的專利公布了去除人血清白蛋白的方法(申請(qǐng)?zhí)枺?1805629.6)。具體而言，是將含有人血清白蛋白多聚體的人血清白蛋白溶液用鹽濃度為50～75mm的緩沖液進(jìn)行透析，強(qiáng)陰離子交換體選擇性吸附白蛋白。該過(guò)程需要用到陰離子交換柱，去除過(guò)程還不夠快、簡(jiǎn)化。
溫州醫(yī)學(xué)院的專利公布了一種用檸檬酸乙醇去除血清中白蛋白的方法。具體而言，包括如下步驟：1)將血清離心去除脂質(zhì)；2)加入血清蛋白提取液，混勻后置于-20℃冰箱，靜置30min；3)樣品提取液離心；4)分別收集離心沉淀與上清液。去除過(guò)程中甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑可以提供自己的羥基或羰基上的氫或氧去形成氫鍵，從而破壞了蛋白質(zhì)中原有的氫鍵，可能會(huì)使血清中的目標(biāo)蛋白變性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：現(xiàn)有技術(shù)中去除pa蛋白中的alb蛋白的方式步驟復(fù)雜、速度慢或會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白變性的問(wèn)題，目的在于提供了一種從血清中獲取天然前白蛋白的方法，其通過(guò)試劑和工藝步驟的優(yōu)化，在避免目的蛋白變性的同時(shí)，能有效達(dá)到快速去除pa蛋白中的alb蛋白的目的，且該方法成本低廉、效果顯著。
本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種從血清中獲取天然前白蛋白的方法，包括：
(1)血清過(guò)濾除脂肪后，調(diào)節(jié)ph值至4.60～4.90，加入alb特異性結(jié)合物使alb沉淀，離心過(guò)濾后收集濾液；
(2)降低濾液的ph值至4.40～4.70，加入pa蛋白促凝劑后獲得pa蛋白沉淀；
(3)pa蛋白沉淀復(fù)溶，透析制成成品。
由于蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度取決于蛋白質(zhì)周圍親水基團(tuán)與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分子帶有的電荷。如改變這兩個(gè)因素蛋白質(zhì)就容易沉淀折出。
等電點(diǎn)沉淀主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的分離提純。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負(fù)電荷相等)，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒(méi)有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。等電點(diǎn)時(shí)的許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利于懸浮液的過(guò)濾。
透析是膜技術(shù)的一種，利用透析膜可以選擇性地透過(guò)一定大小分子，從而將待分離純化的物質(zhì)和雜質(zhì)離子分離開。
本發(fā)明利用等電點(diǎn)沉淀的原理，即采用將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，調(diào)節(jié)血清ph值至alb等電點(diǎn)附近使alb溶解度降低，然后加入alb特異性結(jié)合物使alb蛋白發(fā)生沉淀，通過(guò)離心過(guò)濾獲得濾液，然后再將濾液ph值降低至pa等電點(diǎn)附近，加入pa蛋白促凝劑使pa蛋白沉淀，獲得pa蛋白的沉淀，pa蛋白成沉淀復(fù)溶后通過(guò)透析即可獲得高純度的pa蛋白，為了獲得更高的濃度，還可以采取濃縮的方式，進(jìn)而有效獲得高濃度的pa蛋白。
本發(fā)明通過(guò)各個(gè)工藝、試劑和參數(shù)的優(yōu)化，能有效去除pa蛋白中的alb蛋白，并且在去除pa蛋白中的alb蛋白過(guò)程中，操作更加簡(jiǎn)便、快速，且不會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的變性。而且采用本發(fā)明方法制備時(shí)具有成本低廉的效果，并且由于通過(guò)本發(fā)明獲取的天然前白蛋白中白蛋白含量極低，因而非常適用于科研目的，如：用于單克隆抗體或多克隆抗體免疫原的制備，效果十分顯著。
進(jìn)一步，步驟(1)和步驟(2)中均采用稀鹽酸調(diào)節(jié)ph值。所述alb特異性結(jié)合物為正辛酸或辛酸鹽。所述pa蛋白促凝劑采用分子量為2000～6000的peg。所述alb特異性結(jié)合物的加入量為5％～10％。所述pa蛋白促凝劑的加入量為5％～11％。
通過(guò)上述試劑的優(yōu)化選擇，能有效避免pa蛋白的變性，并且與試劑的用量相配合后，能最大化的保證pa蛋白的純度和收率，效果更加顯著。
所述透析時(shí)采用含高分子材料的透析液進(jìn)行處理，該高分子材料的含量為5％～15％。所述高分子材料采用分子量為20000～35000的peg。本發(fā)明以特殊分子量的高分子材料作為透析液，同步實(shí)現(xiàn)pa蛋白純化及濃縮。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中的ph值調(diào)整到4.60～4.80；所述步驟(2)中的ph值降低到4.40～4.60。
為了能最大化的去除alb蛋白，所述步驟(1)的離心過(guò)濾過(guò)程為：首先在4℃、18000r/min高速條件下離心20min，上清液采用0.65μm的pp濾膜進(jìn)行過(guò)濾后獲得濾液。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
1、本發(fā)明在保證pa蛋白不變性的前提下，優(yōu)化了alb蛋白的去除步驟，有效達(dá)到操作快速、成本低廉、無(wú)雜質(zhì)引入的效果；
2、本發(fā)明在高度保留pa蛋白的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)alb蛋白的有效去除。
具體實(shí)施方式
為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
一種從血清中獲取天然前白蛋白的方法，包括：
a.將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，取100ml；
b.稀鹽酸調(diào)節(jié)血清ph值至4.80；
c.加入8ml正辛酸，alb蛋白發(fā)生沉淀；
d.4℃18000r/min20min高速離心，0.65μm的pp濾膜過(guò)濾獲得濾液；
e.調(diào)節(jié)濾液ph值至4.60，加入9％的peg4000，pa蛋白聚集生成淺藍(lán)色沉淀，獲得pa
f.pa蛋白沉淀復(fù)溶，然后透析去除雜質(zhì)并濃縮制成成品，濃縮倍數(shù)為10倍，透析液中含10％peg20000。
對(duì)成品中的pa蛋白、alb蛋白以及tp蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。
表1
通過(guò)表1可知，本發(fā)明能顯著去除pa蛋白中的alb蛋白，得到高濃度的天然前蛋白，并且經(jīng)過(guò)檢測(cè)得知，本實(shí)施例獲得的體積為17.5ml，pa收率為59.18％，alb去除率為99.79％。
實(shí)施例2
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例中參數(shù)不同，本實(shí)施例的具體制備方法如下：
a.將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，取100ml；
b.稀鹽酸調(diào)節(jié)血清ph值至4.30；
c.加入3ml正辛酸，alb蛋白發(fā)生沉淀；
d.4℃18000r/min20min高速離心，0.65μm的pp濾膜過(guò)濾獲得濾液；
e.調(diào)節(jié)濾液ph值至4.30，加入3％的peg4000，pa蛋白聚集生成淺藍(lán)色沉淀，獲得pa蛋白沉淀；
f.pa蛋白沉淀復(fù)溶，然后透析去除雜質(zhì)并濃縮2.5倍，透析液中含3％的peg20000。
實(shí)施例3
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例中參數(shù)不同，本實(shí)施例的具體制備方法如下：
a.將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，取100ml；
b.稀鹽酸調(diào)節(jié)血清ph值至4.60；
c.加入5ml正辛酸，alb蛋白發(fā)生沉淀；
d.4℃18000r/min20min高速離心，0.65μm的pp濾膜過(guò)濾獲得濾液；
e.調(diào)節(jié)濾液ph值至4.40，加入5％的peg4000，pa蛋白聚集生成淺藍(lán)色沉淀，獲得pa蛋白沉淀；
f.pa蛋白沉淀復(fù)溶，然后透析去除雜質(zhì)并濃縮2.5倍，透析液中含5％的peg20000。
實(shí)施例4
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例中參數(shù)不同，本實(shí)施例的具體制備方法如下：
a.將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，取100ml；
b.稀鹽酸調(diào)節(jié)血清ph值至4.80；
c.加入10ml正辛酸，alb蛋白發(fā)生沉淀；
d.4℃18000r/min20min高速離心，0.65μm的pp濾膜過(guò)濾獲得濾液；
e.調(diào)節(jié)濾液ph值至4.60，加入11％的peg6000，pa蛋白聚集生成淺藍(lán)色沉淀，獲得pa蛋白沉淀；
f.pa蛋白沉淀復(fù)溶，然后透析去除雜質(zhì)并濃縮2.5倍，透析液中含15％的peg20000。
實(shí)施例5
本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別在于，本實(shí)施例中參數(shù)不同，本實(shí)施例的具體制備方法如下：
a.將廢棄人血清離心過(guò)濾除脂肪，取100ml；
b.稀鹽酸調(diào)節(jié)血清ph值至5.20；
c.加入13ml正辛酸，alb蛋白發(fā)生沉淀；
d.4℃18000r/min20min高速離心，0.65μm的pp濾膜過(guò)濾獲得濾液；
e.調(diào)節(jié)濾液ph值至4.90，加入15％的peg6000，pa蛋白聚集生成淺藍(lán)色沉淀，獲得pa蛋白沉淀；
f.pa蛋白沉淀復(fù)溶，然后透析去除雜質(zhì)并濃縮2.5倍，透析液中含18％的peg20000。
分別對(duì)上述實(shí)施例2～實(shí)施例5的濃縮前后的成品中的脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體蛋白等的含量進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。
表2
分別對(duì)上述實(shí)施例2～實(shí)施例5的濃縮前后的成品中的pa蛋白、alb蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算pa收率及alb去除率，結(jié)果如表3所示。
表3
通過(guò)上述表2和表3可知，采用本發(fā)明數(shù)值范圍的方法能獲得較佳的pa收率及alb去除率，效果十分顯著。
以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。