本發(fā)明涉及生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)是一種具有抗腫瘤活性的甲魚血糖肽的分離提取方法。
背景技術(shù)：
：中華鱉（俗稱甲魚）是我國(guó)的一種傳統(tǒng)動(dòng)物中藥，也是我國(guó)近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種重要的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和較高的藥用價(jià)值倍受人們的青睞,其生化成分含膠原蛋白、維生素d、脂肪及碘等，具有滋陰清熱、平肝益腎、破結(jié)軟堅(jiān)及消淤功能。鱉甲、頭、肉、血、膽等都可入藥。國(guó)內(nèi)外對(duì)龜鱉類動(dòng)物的有效成分所開(kāi)展的研究報(bào)道很少，有文獻(xiàn)報(bào)道從鱉甲或者甲魚肉中分離到粗多糖，具有促抗體生成、抗疲勞作用[金妙仁,王水,朱海良等.氨基酸和生物資源.2005,27(2):31-32]。還具有抗腫瘤作用，對(duì)腫瘤細(xì)胞s-180有抑制作用[張婭婕,凌笑梅,甘振威等.長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2004,20(2):38-39]。此外，鱉血提取物在治療免疫性疾病(如aids和肝炎等)中，具有一定的輔助療效，表明鱉血中的某些成分具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用(王志鏞.甲魚血的用途:cn,cn1282586a[p].2001.)?，F(xiàn)有技術(shù)只是從鱉甲或甲魚肉中分離得到具有抗腫瘤作用的粗多糖，通常將甲魚血作為廢棄物處理，針對(duì)此現(xiàn)狀，申請(qǐng)人對(duì)甲魚血進(jìn)行系統(tǒng)化研究開(kāi)發(fā)，發(fā)現(xiàn)其中活性糖肽是很有應(yīng)用前景的藥物或保健品候選物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種甲魚血糖肽的分離提取方法，采用膜分離及生化技術(shù)對(duì)甲魚血進(jìn)行透析、離心、沉淀以及色譜分離提取活性糖肽，對(duì)其進(jìn)行成分鑒定和生物活性測(cè)試，所得甲魚血糖肽具有良好的抗腫瘤活性，原材料價(jià)廉易得，提取工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)出價(jià)值高，是一種很有應(yīng)用前景的藥物或保健品。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)方案是：一種甲魚血糖肽的分離提取方法，其特點(diǎn)是采集的甲魚血經(jīng)透析、離心、沉淀以及色譜分離，提取得到兩種單一組分的活性多糖肽，對(duì)其進(jìn)行成分鑒定和生物活性測(cè)試具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，多糖肽的具體提取和純化按下述步驟進(jìn)行：a、粗多糖綴合物的提取將采集的甲魚血在0~4℃溫度下透析1~3天，在4000rpm離心速度下得到的上清液與乙醇、丙酮或三氯乙醇按1:1~10體積比進(jìn)行沉淀分離，分離的沉淀物按1:2~10體積比溶于蒸餾水，在0~4℃溫度下透析1~5天，然后經(jīng)冷凍干燥得絮狀的粗多糖綴合物為s-1。b、精多糖的制取將上述粗多糖綴合物s-1按1g:1~5ml重量體積比溶于蒸餾水，在12000rpm離心速度下得到的上清液采用陰離子交換色譜柱分離，分離依次用蒸餾水和0.1～0.5mol/l碳酸氫鈉溶液或0.1～1.0mol/l氯化鈉溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，分離后的組分經(jīng)冷凍干燥得產(chǎn)物為甲魚血精多糖s-2，所述陰離子交換色譜柱的填料為deae-cellulose、deae-sephadex或deae-saphrose。c、粗糖肽的制取將上述甲魚血精多糖s-2按1g:1~5ml重量體積比溶于蒸餾水，在12000rpm離心速度下得到的上清液采用陽(yáng)離子交換色譜柱分離，分離依次用蒸餾水和0.1～0.5mol/lna2hpo4-nah2po4溶液或0.1～1.0mol/l氯化鈉溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，分離后的組分經(jīng)冷凍干燥得到兩種單一組分的產(chǎn)物為粗糖肽s-3和s-4，所述陽(yáng)離子交換色譜柱的填料為cm-sephadex或cm-sepharose。d、糖肽的純化將上述粗糖肽s-3和s-4按1g:1~5ml重量體積比分別溶于蒸餾水，在12000rpm離心速度下得到的上清液采用分子排阻色譜柱分離，分離使用0.1～0.5mol/l的碳酸氫鈉、氯化鈉或na2hpo4-nah2po4溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，分離后的組分經(jīng)冷凍干燥分別得產(chǎn)物為多糖肽s-5和s-6，所述分子排阻色譜柱的填料為sephadexg-25、g-50、g-75、lh-60或lh-20。所述透析的分離膜采用截留分子量為500～1500納濾膜。所述na2hpo4-nah2po4溶液的ph=7～9。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有提取工藝簡(jiǎn)單，操作方便，原料豐富，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)出價(jià)值高，產(chǎn)物具有抗腫瘤的活性，是一種很有應(yīng)用前景的藥物或保健品。附圖說(shuō)明圖1為糖肽s-5的ce圖；圖2為糖肽s-6的ce圖。具體實(shí)施方式以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述：實(shí)施例1a、粗多糖綴合物的提取取新鮮甲魚血500ml于4℃溫度下透析2天，透析后的甲魚血在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離，得深棕色的上清液用5倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀分離，分離的沉淀物溶于4倍體積蒸餾水，并在4℃溫度下透析2天，然后冷凍干燥得4.6克淡黃色絮狀產(chǎn)物為粗多糖綴合物s-1。上述產(chǎn)物易溶于水，通過(guò)紫外吸光度檢測(cè)，既有糖吸收又有蛋白吸收，說(shuō)明該產(chǎn)物是粗糖蛋白綴合物，粗多糖綴合物s-1經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，其總糖含量為38.3%，總蛋白含量為53.1%。b、精多糖的制取將上述提取的粗多糖綴合物s-1溶于2倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)deae-cellulosede-52柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l碳酸氫鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得產(chǎn)物為甲魚血精多糖s-2。上述甲魚血精多糖s-2經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，其含糖量為12%，蛋白質(zhì)含量為85%。c、粗糖肽的制取將上述甲魚血精多糖s-2溶于2倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)cm-sephadexc-50柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l氯化鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得兩種單一組分的產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，為粗糖肽s-3和s-4。d、糖肽的純化將上述粗糖肽s-3和s-4分別溶于4倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)sephadexg-75柱色譜分離，分離依次用蒸餾水和濃度為0.3mol/l碳酸氫鈉溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥分別得兩種單一組分的產(chǎn)物為多糖肽s-5和s-6。實(shí)施例2a、粗多糖綴合物的提取取新鮮甲魚血500ml于4℃溫度下透析2天，透析后的甲魚血在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離，得深棕色的上清液用3倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀分離，分離的沉淀物溶于5倍體積的蒸餾水后在4℃溫度下透析3天，然后冷凍干燥得6.1克淡黃色絮狀產(chǎn)物為粗多糖綴合物s-1。b、精多糖的制取將上述提取的粗多糖綴合物s-1溶于3倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)deae-sephadexa-50柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l碳酸氫鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得產(chǎn)物為甲魚血精多糖s-2。c、粗糖肽的制取將上述甲魚血精多糖s-2溶于3倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)cm-sepharosecl-6b柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/lna2hpo4-nah2po4溶液（ph=8）作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得兩種單一組分的產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，為粗糖肽s-3和s-4。d、糖肽的純化將上述粗糖肽s-3和s-4分別溶于4倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)sephadexg-50柱色譜分離，分離使用濃度為0.10mol/l氯化鈉溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥分別得兩種單一組分的產(chǎn)物為多糖肽s-5和s-6。實(shí)施例3a、粗多糖綴合物的提取取新鮮甲魚血500ml于0℃溫度下透析2天，透析后的甲魚血在4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心分離，得深棕色的上清液用1.5倍體積的三氯乙醇進(jìn)行沉淀分離，分離的沉淀物溶于2倍體積的蒸餾水后在4℃溫度下透析4天，然后冷凍干燥得5.0克淡黃色絮狀產(chǎn)物為粗多糖綴合物s-1。b、精多糖的制取將上述提取的粗多糖綴合物s-1溶于3倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)deae-sepharosecl-6b柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l碳酸氫鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得產(chǎn)物為甲魚血精多糖s-2。c、粗糖肽的制取將上述甲魚血精多糖s-2溶于3倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)cm-sepharosecl-6b柱色譜分離，分離依次用水以及濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l和0.5mol/l氯化鈉溶液作為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥得兩種單一組分的產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)，為粗糖肽s-3和s-4。d、糖肽的純化將上述粗糖肽s-3和s-4分別溶于2倍重量的蒸餾水后以12000rpm轉(zhuǎn)速離心，將上清液經(jīng)sephadexlh-60柱色譜分離，分離使用0.15mol/l氯化鈉溶液為洗脫劑進(jìn)行淋洗，色譜分離得到的組分經(jīng)冷凍干燥分別得兩種單一組分的產(chǎn)物為多糖肽s-5和s-6。對(duì)上述各實(shí)施例的s-1～s-6產(chǎn)物分別進(jìn)行抗腫瘤活性測(cè)試，考察其對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞(cne-2)生長(zhǎng)抑制作用。測(cè)試采用mtt比色法，其檢測(cè)采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的cne-2細(xì)胞,經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化，用含小牛血清的dmem培養(yǎng)液制成細(xì)胞105/ml的懸液，以每孔100ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃和5%co2條件下培養(yǎng)24h。棄培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，加100ml濃度為1mg/ml的各類樣品溶液并混勻，每一濃度各4個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照加人等體積的含0.1%吐溫-80dmem培養(yǎng)液。培養(yǎng)條件同上，作用24h后,每孔加入20ml用生理bps新鮮配制的mtt(0.5mg/ml)原條件培養(yǎng)4h后，棄mtt溶液，每孔加150mldmso，振蕩10min，在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(a值)，波長(zhǎng)57onm，取4孔平均值，其生長(zhǎng)抑制率按以下式（1）計(jì)算，并將測(cè)試結(jié)果匯總?cè)缦卤?所示：(1一實(shí)驗(yàn)組a值/對(duì)照組a值)x100%（1）表1抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果編號(hào)劑量(mg/ml)抑制率%normal00ddp149.5±0.9s-11015.9±0.4s-21026.0±0.7s-31027.3±1.0s-41036.2±1.3s-51031.9±2.1s-61042.1±1.0從上述表1的抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果表明：在較低的濃度下，不同分離提取階段的s-1～s-6產(chǎn)物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞都具有良好的抑制率，而且純度越高的多糖肽，其抑制率相應(yīng)就越高，這就充分說(shuō)明了對(duì)甲魚血中糖肽的分離純化具有顯著的作用和巨大的開(kāi)發(fā)前景。采用高效毛細(xì)管點(diǎn)泳(hpce)對(duì)多糖肽s-5和s-6進(jìn)行純度的檢測(cè)，其電泳條件：電壓為20kv；檢測(cè)：紫外280nm；溫度：室溫；緩沖液：25mmol/l硼砂，ph=9；樣品濃度：0.1%(w/v)；進(jìn)樣體積：5μl。參閱附圖1，上述各實(shí)施例制取的多糖肽s-5經(jīng)ce檢測(cè)均得到單一峰，說(shuō)明該組分均一性好，純度高。參閱附圖2，上述各實(shí)施例制取的多糖肽s-6經(jīng)ce檢測(cè)均得到單一峰，說(shuō)明該組分均一性好，純度高。以上只是對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，并非用以限制本專利，凡為本發(fā)明等效實(shí)施，均應(yīng)包含于本專利的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12