專利名稱：抗原檢測試劑盒和方法
技術領域：
本發(fā)明提供了一種用于檢測抗原的試劑盒，包含捕獲抗體、結合單鏈DNA寡核苷 酸的檢測抗體、互補于該DNA寡核苷酸的單鏈RNA寡核苷酸以及RNA酶；和用上述試劑盒檢 測抗原的方法。本發(fā)明采用單一分析手段和單一 RNA酶，實現(xiàn)了多種生物材料的免疫測定。
背景技術：
ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)是一種免疫測定，其利用材料與其相應抗體的反應來 檢測所要分析的特定材料。在ELISA開發(fā)之前，進行免疫測定的唯一選擇是放射免疫測定， 使用放射性標記的抗原或抗體的一種技術。由于放射性造成潛在的健康威脅，所以需要一 種替代的免疫測定，其使用非放射性信號來取代放射性信號。響應這種需求，已經(jīng)開發(fā)出 ELISA，且其已經(jīng)成為最常用的免疫測定之一，高靈敏度地檢測各種靶物質(zhì)的存在。通常，ELISA包括用酶標記的抗體和與該酶反應以產(chǎn)生信號的底物來檢測靶物質(zhì) 的步驟。酶促反應導致顏色或熒光中的改變。由于ELISA對每種物質(zhì)應單獨進行，所以當 用于分析樣品中的超過一種物質(zhì)時，難于直接對比該樣品中共存的各種物質(zhì)的相對量。ELISA和其他免疫測定的一個區(qū)別在于存在/不存在信號放大過程。 大部分免疫 測定不包括由酶引起的信號放大過程，且通?；跓晒庑盘?。使用標記于抗體上的熒光團 信號的免疫測定可簡便地用于進行多重免疫測定，因為每個不同的熒光團在不同的波長的 發(fā)射，可分別用于多種物質(zhì)的分析。相比之下，基于酶的免疫測定，例如ELISA，利用由酶促 反應導致的吸光度或熒光的改變，需要不同的酶_抗體綴合物來進行多重測定，并需要鑒 定和使用多對酶-底物。因此，隨著樣品中分析物數(shù)量的增加，在技術上多重ELISA的完成 變得比其他免疫測定更為困難。最廣為人知的沒有酶促信號放大的多重免疫測定使用分別能夠特異結合相應靶 分子的不同種類的抗體，其固定于含有分別對應于靶分子的不同熒光物質(zhì)的小球體相上。 然后測量小球體的熒光信號，小球體中抗體結合至靶分子。但是，這種方法要求使用稱為流 式細胞儀的昂貴儀器，且因此不如ELISA劃算，ELISA在許多實驗室都可以方便地進行。近 來，一些在單個微量培養(yǎng)板上進行的多重免疫測定被引入。例如在一種方法中，將抗-IgG 固定在大約6微米的聚苯乙烯珠上并允許其結合捕獲抗體。為進行多重測定，將不同種類 分析物的檢測抗體與不同的熒光物質(zhì)一起加入。在另外一種叫做多重-FLISA(熒光聯(lián)接免 疫吸附測定)的方法中，針對多種分析物的抗體連接在不同的QDots上，其分別在不同的波 長發(fā)射。相同樣品中多種分析物的免疫測定可以通過熒光強度的分析同時進行。這些方法的缺陷在于，其檢出限與ELISA相比不夠靈敏，因為它們沒有包含酶介導的信號放大過程。 GenTel提供了一種多重免疫測定，其中多種抗體的每一種都直接結合在不同的熒光物質(zhì) 上，并就熒光強度進行測量。采用酶促反應的基于ELISA的多重免疫測定，包括一種QuansysBiosciences， Inc.提供的方法。在這種方法中，20nl的小點沉積在96孔板的孔底，每個點代表單個靶物 質(zhì)的分析結果。由過氧化物酶-底物反應所增加的發(fā)光量通過讀取發(fā)光圖來定量，從而提 供了多重-ELISA形式。這種方法有其缺陷，它需要在板上預設點，且需要采集和分析圖象 的昂貴儀器。另外一種基于ELISA多重免疫測定采用兩種分別連接堿性磷酸酶和過氧化物 酶的抗體以測量相同樣品中兩種類型的分析物。酶提供了信號放大作用。盡管原則上這種 方法被認為是多重ELISA，但實際上當樣品中所要分析的分析物數(shù)量增加到大于2時則變 得更難進行操作。此外，由于使用不同種類的酶，該方法并不劃算。因此，需要開發(fā)一種可 以更方便進行的新的多重免疫測定。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人設計了一種可應用于多重分析的免疫測定，其僅使用一種酶、抗體包被的 支持物和常規(guī)ELISA中已經(jīng)使用的吸收或熒光測量儀器。因此，一個實施方案提供了 一種檢測抗原的試劑盒，其包括捕獲抗體、與單鏈DNA 寡核苷酸綴合的檢測抗體、互補于該DNA寡核苷酸并用熒光物質(zhì)標記的單鏈RNA寡核苷酸 以及RNA酶。另外一個實施方案提供了一種檢測抗原的方法，其使用捕獲抗體、與單鏈DNA寡 核苷酸綴合的檢測抗體、互補于該DNA寡核苷酸并用熒光物質(zhì)標記的單鏈RNA寡核苷酸以 及RNA酶。


圖1顯示多重OLISA(寡核苷酸聯(lián)接免疫吸附測定)的示意圖。圖2為用OLISA獲得的檢測AFP( α -胎蛋白)——種肝癌標記——的圖。圖3為用多重OLISA獲得的同時檢測AFP(a -胎蛋白)——種肝癌標記——和 PSA(前列腺特異抗原)——種前列腺癌標記——的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種技術，其基于現(xiàn)有ELISA形式的改進、利用抗體使得能夠進行新 的多重免疫測定。據(jù)本發(fā)明的技術采用DNA寡核苷酸綴合的抗體來取代過氧化物酶融合的抗體，用 于由酶實現(xiàn)的信號放大的目的。此外，本技術采用互補于該DNA寡核苷酸并在一個末端用 熒光物質(zhì)、且在另一個末端用熒光猝滅物質(zhì)標記的RNA寡核苷酸和RNA酶(也就是RNA酶 H)，這樣當靶分子存在時，熒光信號通過由RNA酶H進行RNA降解來放大。由于本發(fā)明所述 技術中寡核苷酸而不是酶綴合在抗體上，所以在本文中將該技術稱為“0LISA”(寡核苷酸 聯(lián)接免疫吸附測定)。使用OLISA技術，相同樣品中存在的一種或多種類型的靶分子(抗原)可以被同時檢測。通過使用分別特異于兩種或更多種靶分子抗原并分別綴合不同序列的DNA寡核苷 酸的抗體，以及使用分別互補于每種DNA寡核苷酸并在一個末端用熒光物質(zhì)、另一個末端 用熒光猝滅物質(zhì)標記的RNA寡核苷酸，檢測多種靶分子成為可能。通過RNA酶H進行信號 放大，靶分子可以被同時分析。換句話說，本發(fā)明的技術使由單一種類的酶完成信號放大 過程、以及在相同樣品中不同種類的抗原(靶分子)同時進行分析成為可能(多重免疫測 定)。一個實施方案提供了一種使用寡核苷酸的新的免疫測定。換句話說，實施方案提 供了一種基于OLISA(寡核苷酸聯(lián)接免疫吸附測定)的免疫測定。根據(jù)實施方案的測定包 含通過放大檢測信號來免疫測定的步驟，其中采用綴合至DNA寡核苷酸的檢測抗體(下文 中，d-Ab-DNA)、互補于DNA寡核苷酸并在一個末端用熒光物質(zhì)(熒光團，F(xiàn))且另一個末端 用熒光猝滅物質(zhì)(猝滅劑，Q)標記的RNA寡核苷酸(下文中，F(xiàn)-RNA-Q)和RNA酶。提供了 OLISA免疫測定基于的原理和實施其的方法，以及多重OLISA方法和多重OLISA試劑盒。
下文提供本發(fā)明詳述。一個實施方案提供一種基于免疫測定的靶材料(抗原)檢測試劑盒，用來檢測樣 品中的一種或多種類型的靶材料。更具體地，檢測試劑盒基本上含有支持物和固定在該支持物上且能夠特異地結合 樣品中的靶材料(抗原)的捕獲抗體(c-Ab)。該支持物可以是在基于固體的免疫測定中常 規(guī)使用的任何種類的固體支持物，或ELISA中常用的微量滴定板孔。支持物的例子可包括 但不限于根據(jù)其形狀而定的平底板、U形底板等等；根據(jù)配體或蛋白包被的存在而定的抗 生物素蛋白包被的板、鏈霉抗生物素蛋白包被的板、谷胱甘肽包被的板、抗-GST包被的板 等等；根據(jù)支持物所用的材料而定的聚苯乙烯板、聚丙烯板等等。捕獲抗體可以以用于免疫 測定目的的任意方式固定在支持物上，不限于特定的方法。例如，在一個實施方案中，捕獲 抗體可以被包被在支持物上。與在液相中混合物上進行檢測的情形相比，固定抗原_抗體對的一部分到固相上 的方法對于使用液體樣品例如體液的檢測可以是有效的。這是因為，檢測在液相中進行時， 可能出現(xiàn)F-RNA-Qs被體液中存在的RNA酶降解，而不管它們是否與DNAs結合，且結果會產(chǎn) 生假陽性信號。但是，如在ELISA和OLISA中一樣，用固體支持物上固定的抗體進行抗原檢 測時，假陽性信號的發(fā)生可以被顯著降低，因為加入了 RNA酶H和F-RNA-Qs以在只要允許 抗原_抗體相互作用后就產(chǎn)生信號，且未反應的流體和其他可能抑制基于RNA酶的測定的 物質(zhì)被通過洗滌去除。當將試劑盒暴露于樣品并允許足夠時間的相互反應后，特異于樣品中抗體的抗原 結合至捕獲抗體。隨后，將d-Ab-DNA綴合物(其中能夠特異結合抗原的檢測抗體與單鏈DNA 寡核苷酸綴合)應用于試劑盒。然后檢測抗體結合至不同于捕獲抗體所結合的抗原位點的 抗原位點，從而導致產(chǎn)生捕獲抗體_抗原_檢測抗體-DNA寡核苷酸綴合物的復合體。接下 來在試劑盒上應用F-RNA-Q綴合物，其含有互補于d-Ab-DNA的DNA寡核苷酸并在一個末端 用熒光物質(zhì)、且在另一個末端用熒光猝滅物質(zhì)標記的單鏈RNA寡核苷酸。當DNA寡核苷酸 和RNA寡核苷酸形成雙鏈DNA/RNA互補復合體時，產(chǎn)生捕獲抗體_抗原_檢測抗體-DNA/ F-RNA-Q復合體。這就是說，與檢測抗體綴合的DNA寡核苷酸取代了 ELISA中檢測抗體的作 用。
當用RNA酶(例如RNA酶H)處理雙鏈DNA/RNA復合體時，復合體中的RNA被降解， 以釋放熒光物質(zhì)，從而產(chǎn)生熒光。通過測量熒光的強度，可以實現(xiàn)對抗原是否存在的測定和 定量分析。如本文所用的，術語“抗原檢測”可指靶抗原的存在和/或量的確定。因此，試劑盒除支持物和捕獲抗體外，還可以進一步包含檢測抗體-DNA寡核苷酸 綴合物、熒光物質(zhì)-RNA-熒光猝滅物質(zhì)和RNA酶。它們?nèi)烤膳c支持物和捕獲抗體一起 包含在單獨的單元中。可選擇地，僅有它們中一些可與支持物和捕獲抗體一起包含在單獨 的單元中，其余的在分開的單元中提供。另外可選擇地，它們中的所有或每個都可以在與支 持物和捕獲抗體分開的單元中提供。另一個實施方案提供樣品中特定抗原(靶材料)的抗原檢測方法。特別地，方法 可包括以下步驟使樣品接觸能夠特異結合待檢測抗原的捕獲抗體(C-Ab)，從而允許抗原_抗體相 互作用，以便樣品中抗原與c-Ab結合(步驟(1))；使檢測抗體(d-Ab)-DNA寡核苷酸綴合物接觸結合至捕獲抗體的抗原，其中能夠 特異結合抗原的檢測抗體和單鏈DNA寡核苷酸綴合，其中捕獲抗體和檢測抗體結合的抗原 位點彼此不同，從而抗原結合至d-Ab-DNA寡核苷酸綴合物以形成c-Ab/抗原/d-Ab-DNA寡 核苷酸綴合物(步驟(2))；使F-RNA-Q與c_Ab/抗原/d-Ab-DNA寡核苷酸綴合物接觸，其中F-RNA-Q由互補 于DNA寡核苷酸的RNA寡核苷酸、在RNA寡核苷酸的一個末端的熒光物質(zhì)(熒光團，F(xiàn))和 在RNA寡核苷酸的另一個末端的熒光猝滅物質(zhì)(猝滅劑，Q)構建而成，從而通過DNA和RNA 的雜交形成DNA-RNA雙鏈(步驟(3))； 用特異降解DNA-RNA雙鏈中RNA的RNA酶處理DNA-RNA雙鏈，從而熒光物質(zhì)從RNA 釋放，且產(chǎn)生熒光(步驟(4))；和測量產(chǎn)生的熒光強度(步驟(5))。通過檢測方法，不僅當樣品中只有一種類型的靶抗原時，而且當樣品中有兩種或 更多種類型的靶抗原時，都可能通過一次執(zhí)行來測定一種或多種靶抗原的存在和/或量 (即多重免疫測定)。此外，方法可以進一步在步驟(1)和步驟(2)之間包括下列步驟洗滌未反應樣 品，以消除妨礙測定的物質(zhì)，例如RNA酶，以防止假陽性信號，從而提高檢測效率。如果待檢測的抗原種類為兩種或更多，那么可以設計試劑盒，以便與檢測抗體綴 合的單鏈DNA寡核苷酸的核苷酸序列間彼此不同，并且DNA寡核苷酸之間沒有互補性以避 免DNA-DNA相互作用，其中檢測抗體可特異結合相應抗原。由于互補于DNA寡核苷酸的RNA序列和分別標記于RNA核苷酸末端的不同熒光物 質(zhì)的使用， 取決于特定抗原的存在或其濃度，熒光的強度相應地變化。因此，兩種或更多種 類型的抗原的多重免疫測定可以通過一次執(zhí)行來完成。對于檢測試劑盒或檢測方法，待檢測抗原包括任何用免疫測定可檢測的生物活性 材料。例如，抗原可以為選自以下的一種或多種自身抗體、配體、天然提取物、肽、蛋白、金 屬離子、合成藥物、天然藥物、代謝物、基因組、病毒和病毒產(chǎn)物以及細菌和細菌產(chǎn)物，但不 限于此。用于上述抗原檢測的樣品——不管是檢測它們的存在還是濃度——可未經(jīng)處理使用或在合適的緩沖液中稀釋。在所需時間的溫育后，在進入下一步之前可加入另外的洗 去步驟。洗去過程去除了樣品中未能結合捕獲抗體的靶材料和其他仍未結合的材料。對于檢測試劑盒或檢測方法，捕獲抗體和檢測抗體可為單克隆或多克隆抗體。構 建捕獲抗體和檢測抗體以結合相同抗原，不過是在抗原上的不同位點，從而捕獲抗體和檢 測抗體是以非競爭方式結合抗原的，且從而形成捕獲抗體-抗原-檢測抗體復合體。為了 使捕獲抗體和檢測抗體結合在抗原上的不同位點，相關領域中通常使用的任何技術均可應 用，即，用分別衍生自抗原不同區(qū)域的表位來制備抗體。近來，結合在相同抗原上的不同位 點的成對抗體已商業(yè)可獲得，其可根據(jù)所需靶抗原購買。具體確定與檢測抗體綴合的DNA寡核苷酸序列并沒有什么必要，因為單鏈DNA寡 核苷酸是作為RNA酶特異降解DNA/RNA雙鏈中的RNA這一活動的中間媒介發(fā)揮作用的。這 就是說，DNA寡核苷酸附著結合至靶材料(抗原)的檢測抗體，且互補結合熒光標記的RNA 寡核苷酸以形成DNA/RNA雙鏈，從而RNA酶特異識別DNA/RNA雙鏈，且然后特異降解DNA/ RNA雙鏈中的RNA，由此釋放RNA —個末端的熒光。因此，只要求DNA和RNA的序列互補，但 具體限定其序列就不必要了。此外，DNA寡核苷酸的長度沒有限制，但為了與RNA的有效雜交和檢測效率可包括 2-10000，優(yōu)選5-500個核苷酸。每個抗體連接的DNA寡核苷酸的平均數(shù)可以是一條或更 多。例如，2-10條DNA寡核苷酸可以重復連接。此外，如果DNA寡核苷酸上RNA酶H的反 應位點與抗體太近，那么RNA酶H的活性會受到負面影響，且因此，DNA寡核苷酸可在除RNA 寡核苷酸雜交的區(qū)域之外進一步包括5’端的堿基序列重復，其中重復5-50，優(yōu)選10-30的 A、T、C、或G。如果重復序列中的堿基為G，那么可能會導致不需要的二級結構，如G-四鏈體 (G-qudruplex)，且阻止酶的反應。因此，堿基重復序列更優(yōu)選但不限于為A、T或C。之前已經(jīng)提及，對于多種抗原的免疫測定，與能夠特異結合相應抗原的檢測抗體 綴合的DNA寡核苷酸的序列并不需要規(guī)定。但是，為了檢測效率，有利的是設計這樣的寡核 苷酸，其根據(jù)相應的抗原具有不同序列，且寡核苷酸之間沒有互補性，從而不發(fā)生DNA-DNA 相互作用。另外，試劑盒可這樣設計，從而即使在具有與抗原相應的不同序列的DNA寡核苷 酸之間發(fā)生互補相互作用，DNA-DNA結合也不如DNA寡核苷酸與RNA寡核苷酸之間的互補 結合穩(wěn)定，且后者的結合(DNA-RNA)強于前者(DNA-DNA)。在實施方案中，可以使用化學鍵(共價鍵)，例如酰胺鍵、二硫鍵、酯鍵、醚鍵、硫醚 鍵，以將DNA寡核苷酸附著在檢測抗體上。交聯(lián)劑可應用于化學鍵的應用。交聯(lián)劑的一端 可通過化學鍵(如酰胺鍵、二硫鍵、酯鍵、醚鍵和硫醚鍵)連接檢測抗體，而交聯(lián)劑的另一端 通過化學鍵(如酰胺鍵、二硫鍵、酯鍵、醚鍵和硫醚鍵)連接DNA寡核苷酸。任何常用于連接兩個生物分子的交聯(lián) 劑均可使用。例如，交聯(lián)劑可以是選自下列 的一種或多種琥珀酰亞胺基-6-[ β-馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸酯(SMPH)，琥珀酰亞 胺基-4-[ρ-馬來酰亞胺基苯基]丁酸酯(SMPB)，磺基琥珀酰亞胺基6-(3’ -[2-吡啶基二 硫代]“丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP)，N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲 酸酯(SIAB)，但不限于此，等等。由于DNA寡核苷酸可通過化學鍵或交聯(lián)劑連接至抗體，所以當識別抗原時，由共 價鍵或交聯(lián)劑連接至抗原_抗體復合體的DNA寡核苷酸可以發(fā)揮作用以起始酶反應。本發(fā)明中用d-Ab-DNA寡核苷酸綴合物來取代ELISA中的檢測抗體。如上文所述，綴合物中的DNA寡核苷酸結合隨后加入的F-RNA-Q，并作為模板鏈，其使F-RNA-Q能夠作為 RNA酶H的底物。在將d-Ab-DNA寡核苷酸與d-Ab_DNA寡核苷酸所特異結合的捕獲抗體-抗原復合 體接觸，且溫育所需時間后，可進行進一步去除未結合的d-Ab-DNA的過程。 在檢測試劑盒或檢測方法中，一端用熒光物質(zhì)、且另一端用熒光猝滅物質(zhì)標記的 單鏈RNA寡核苷酸可被設計為與DNA序列具有序列互補性，這樣RNA序列特異結合DNA寡 核苷酸以形成DNA/RNA雙鏈。RNA寡核苷酸末端附著的熒光物質(zhì)可為免疫測定中可使用的任何種類。熒光物質(zhì) 的例子包括但不限于選自以下的一種或多種香豆素類化合物，例如7-羥基香豆素、4-甲 基-7-羥基香豆素等等；咕噸類化合物，例如R0X、ΤΕΤ、德克薩斯紅、熒光素、四甲基羅丹明 等等；花菁類化合物，例如Cy3、Cy5等等；氟硼熒(Bodipy)類化合物，例如氟硼熒FL、氟 硼熒530、氟硼熒R6G、氟硼熒TMR等等；Alexa Fluor類化合物，例如Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 350,Alexa Fluor555、Alexa Fluor 532等等；以及DyLight Fluor類化合物，例如DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、 DyLight 750、DyLight 800 等等。附著至RNA寡核苷酸另一個末端的熒光猝滅物質(zhì)可以是任何種類，沒有特定限 制。熒光物質(zhì)的例子包括但不限于選自以下的一種或多種DABCYL、QSY類化合物(例如 QSY-35、QSY-7、QSY-9、QSY-21 等等)和 BHQ 類化合物(例如 BHQ-I、BHQ-2、BHQ-3 等等)。 此外，它可以是進行FRET(熒光共振能量轉移)的熒光物質(zhì)，例如，藍綠色熒光蛋白(CFP)、 黃色熒光蛋白(YFP)、綠色熒光蛋白(GFP)等等。使用的熒光猝滅物質(zhì)可根據(jù)結合在另一個 末端的熒光物質(zhì)的種類決定。熒光物質(zhì)和熒光猝滅物質(zhì)可分別在5’端和3’端，或3’端和5’端標記。在上面形成的c-Ab-抗原-(d-Ab-DNA/F-RNA-Q)復合體中，在單RNA鏈一端標記 的熒光物質(zhì)(F)的熒光由于另一端標記的位置與熒光物質(zhì)接近的熒光猝滅物質(zhì)的存在而 猝滅。當使用RNA降解酶例如RNA酶H時，RNA酶H對結合至d-Ab-DNA的F-RNA-Q的降解 活性可被啟動，因而熒光物質(zhì)和熒光猝滅物質(zhì)之間的距離可以是遠的。因此，對于RNA酶H 允許足夠量的反應時間后，可獲得熒光的放大信號。結合捕獲抗體的抗原量與d-Ab-DNA的 量成比例，且d-Ab-DNAs中DNA的量與由RNA酶H進行的F-RNA-Q降解導致的熒光信號的 放大程度成比例。從而，在抗原量和放大的熒光信號量之間存在正比例關系，從而使得能夠 通過熒光信號對抗原定量。RNA降解酶可與合適的緩沖液一起使用。可使用的緩沖液包括 本發(fā)明所屬相關領域中已知的緩沖液。在檢測試劑盒或檢測方法中，RNA酶可為具有對DNA/RNA雙鏈特異的RNA降解活性 的任何種類，即，RNA酶H。特別地，RNA酶H對于使用各種RNA序列的多重測定非常有用， 因為RNA酶H并不是序列特異的。RNA酶H可是從細胞中分離或純化的，或是以重組蛋白的 形式表達并純化的。RNA酶H的例子包括但不限于源自大腸桿菌(E. coli)的RNA酶H(基 因登錄號V00337，編碼區(qū)域243-707，蛋白登錄號CAA23620)。同時檢測至少兩種抗原的根據(jù)本發(fā)明的多重測定(多重0LISA)進一步詳細解釋 如下。
捕獲抗體可以以抗體混合物的形式使用，其中每種在包括各種抗原的樣品 中特異性捕獲其相應的抗原。為進行多重0LISA，可制備附著檢測抗體的DNA寡核苷 酸，以便附著至與特定種類抗原相應的檢測抗體的每個DNA寡核苷酸具有與其他種 類抗原的不同的堿基序列。例如，d-Ab-DNA綴合物可提供為Cl-Ab1-DNA1、d_Ab2-DNA2、 Cl-Ab3-DNA3.......d-Abn-DNAn(n為待檢測的抗原數(shù))。F-RNA-Qs中的RNAs如下進行制備，
從而使得每種RNA的堿基序列互補于d-Ab-DNAs中的每種DNA，所述d-Ab-DNA中的每種 DNA分別特異結合在相應的抗原上。選擇標記在RNAs上的熒光物質(zhì)，從而使其可易于彼此 區(qū)別，例如，根據(jù)相應的抗原不同波長的熒光。合適種類的熒光猝滅物質(zhì)與每種熒光物質(zhì)匹
配。F-RNA-Qs 可提供為 FfRNA1-Q1J2-RNA2-Q2J3-RNA3-Q3,......Fn-RNAn-Qn(η 為待檢測的
抗原數(shù))。只用一種熒光猝滅物質(zhì)來猝滅來自超過一種熒光物質(zhì)的熒光也是可能的。對于多重0LISA，由Fn-RNAn-QnS通過RNA酶H進行RNA降解而產(chǎn)生并放大的η種 熒光信號具有彼此不同的波長，且因此，它們的每一種均可在其合適的波長上被檢測。每 種捕獲抗體結合其相應的抗原；d-Ab-DNA結合于其上，其中檢測抗體特異于抗原；且隨后， F-RNA-Q結合其d-Ab-DNA，其中RNA序列互補于DNA，從而導致分別相應于待檢測的抗原的 復合體形成。隨后，RNA酶H反應獲取的熒光強度分別與相應抗原的量成比例。因此，通過 使用上面提供的方法，通過多重-OLISA可以檢測并定量相同樣品中的多種抗原，其中熒光 信號由RNA酶H產(chǎn)生并放大。常規(guī)ELISA方法對于每種待檢測抗原需要不同的酶以進行多重測定。此外，除非 使用的酶專門特異于靶抗原，否則其他抗原有充當競爭底物的趨勢，從而使得難于獲得檢 測的特異性和精確性。但是，本發(fā)明提供的DNA寡核苷酸的每一種根據(jù)抗原的種類具有不 同的序列，RNA寡核苷酸分別互補于DNA寡核苷酸，且RNA酶H不具序列特異性地降解DNA/ RNA雙鏈，這樣不管靶抗原的數(shù)有多少，多種抗原都可以在單個測定操作中同時檢測。盡管ELISA免疫測定是抗原檢測和醫(yī)學診斷領域最常用的免疫測定之一，但由于 基于ELISA的多重測定要求對于個別物質(zhì)的分析過程分別進行，所以觀察者難于比較相同 樣品中多種物質(zhì)的相對量。此外，最近已知，診斷上困難的疾病，如癌癥和阿爾茨海默病不 能用單個標記進行診斷。更精確的診斷只可能通過由各種相關蛋白和生理學材料中增加/ 降低得出的相對關系分析來獲得。為對相同樣品中這樣的多種標記進行概況分析，必須使 用多重ELISA，通過這種方式多種標記可在單個微量培養(yǎng)板孔中同時分析。盡管常規(guī)多重 ELISA利用超過一對的酶-底物，但根據(jù)本發(fā)明的多重-OLISA方法及其試劑盒可僅用一種 類型的酶進行多重測定，其使用相同的抗體包被的微孔板和相同的微孔板分析工具，其中 使用在常規(guī)ELISA中使用的熒光或吸收。因此，本發(fā)明提供了一種更簡單且更劃算的方法。 在這點上，根據(jù)本發(fā)明的多重OLISA可有助于解決多種抗原必須同時檢測的情況，且特別 是在多種診斷標記必須同時分析的疾病診斷領域。實施例本發(fā)明參考如下實施例進一步更詳細解釋。但不應將這些實施例解釋為以任何形 式限制本發(fā)明的范圍。 實施例1 對于單個抗原使用RNA酶H的OLISA分析α -胎蛋白(AFP，來自人胎兒臍帶血清，F(xiàn)itzgerald, Inc.)的檢測如下進行。1. 1 制備檢測探針(d-Ab-DNA)
將由Fitzgerald，Inc.以成對形式提供、用于夾心式ELISA的50 μ 1 3. 4mg/mL 的針對AFP的單克隆抗體(1) (Cat#10C-CR1007M5,識別來自臍帶血的AFP)，與50 μ 1 PBS 緩沖液和Ιμ IOOmM SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[β-馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸酯) 混合，并在室溫溫育30分鐘。將所獲得的溶液稀釋于15mL PBS緩沖液中，并用Amicon Ultra-15(Ultracel-30K) (Millipore)在 4°C下于 4，OOOrpm 離心 40 分中。重復所述過程 3次，且獲得上清液①。同時，將 100 μ 1 100 μ M 的 DNA 溶液(DNA 核苷酸的序列為 5，-ΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤΤ TTTTAACCACAGTG-3，，SEQ ID NO :1，其中20個胸苷加在DNA寡核苷酸的5，端，以避免DNA 寡核苷酸附著至抗體對RNA酶反應的抑制作用)和15 μ 1 IM 二硫蘇糖醇(DTT)混合，并在 室溫溫育15分鐘。隨后重復加入并取出100 μ 1乙酸乙酯5次。殘留的DDT和硫醇片段用 MicroSpinG-25柱取出。將剩余的DNA溶液和上面獲得的上清液①混合，并在室溫溫育30 分鐘。所獲得的溶液稀釋在15ml PBS緩沖液中，并用Amicon Ultra-15 (Ultracel-30K)在 4°C下于4，OOOrpm離心40分鐘，進行四次。所得上清液為d-Ab_DNA綴合物(I)，其中單克 隆抗體⑴和DNA片段綴合。將d-Ab-DNA綴合物⑴用作OLISA分析的檢測探針。1. 2捕獲抗體和RNA探針的制備，以及OLISA分析將由Fitzgerald，Inc.以成對形式提供、用于夾心式ELISA的針對AFP的單克隆 抗體(2) (Cat# 10C-CR1007M4，識別來自臍帶血的AFP)在PBS緩沖液中稀釋至10 μ g/mL的 濃度。制備的溶液加入96孔微量培養(yǎng)板(每孔100 μ 1)，且于4°C放置15小時。用200 μ 1 PBS緩沖液洗滌3次后，加入200 μ 1 3% (w/v)牛血清清蛋白(BSA)/PBS溶液。之后將微 量培養(yǎng)板在室溫溫育2小時。用200μ lPBST(PBS+0. 05% (w/v)Tween-20)洗滌3次后，將 抗原(AFP)在3% (w/v)BSA/PBS溶液中以各種濃度稀釋，然后在96孔微量培養(yǎng)板中溫育2 小時(每孔100 μ 1)。隨后，將孔用200 μ 1 PBST洗滌3次。將實施例1. 1中制備的d-Ab-DNA綴合物 (I)溶液在3% (w/v)BSA/PBS中以1 30的比率稀釋，以每孔100 μ 1的量加入孔中，且在
室溫溫育2小時。將孔用200μ1 PBST 溶液洗滌 3 次。然后將 100μ 1 含有 40mM Tris-HCl、4mMMgCl2、 ImM DTT、0. 003 % BSA、400nM 熒光素(FAM)-RNAl_dabcyl、0. IUProtector RNA 酶抑制劑 (Roche Inc.，Cat. #03335402001)和 6U RNA 酶 H(Takarabio Inc.，編號 No. 2150A)的 反應溶液加入孔中，且在室溫溫育2小時。熒光素(FAM)-RNAl-dabcyl的寡核苷酸序列 為FAM-5，-CACUGUGGUU (SEQ IDNO :2) -3，-dabcyl。完成反應后，用微量培養(yǎng)板讀取儀 (Varioskan flash, Thermoscientific Inc.)以分別為 485士 IOnm 和 535士 IOnm 的激發(fā)和 吸收波長測量熒光強度。結果示于圖2。如圖2所示，熒光強度與靶材料AFP的濃度成比例地 增加。也就是 說，AFP用本實施例中的方法進行了有效的檢測。實施例2 對于同時分析相同樣品中共存的兩種類型的抗原的使用RNA酶H的多 重-OLISA分析進行對于α -胎蛋白(AFP)和前列腺特異抗原(PSA，F(xiàn)itzgerald, Cat#30C-CP1017U)的同時檢測的下面實驗。2. 1 制備檢測探針(d-Ab-DNA)
AFP檢測探針用實施例1. 1所述的相同方式制備。PSA檢測探針用如下方式制備。將50 μ 1濃度為2. 25mg/mL的抗體溶液與50 μ 1 PBS緩沖液和1 μ 1 100mM SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[ β -馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸酯) 混合。該抗體溶液含有由Fitzgerald Inc.以成對形式提供、用于夾心式ELISA中的總體 PSA分析的針對PSA的單克隆抗體(3)，Cat#10-P20D。允許混合物在室溫溫育30分鐘以發(fā) 生反應。將所得溶液稀釋于15mL PBS緩沖液中，且用Amicon Ultra-15 (Ultracel-30K)在 4°C下于4，OOOrpm離心40分鐘。重復所述過程3次，且獲得上清液(②)。同時，將 100 μ 1 100 μ M 的 DNA 溶液(DNA 核苷酸的序列為 5，_χχχχχχχχχχχχχχχ TTTTTACTCTATGGG-3，，SEQ ID NO ；3)和 15 μ 1 IM 二硫蘇糖醇(DTT)混合在一起，且允許 在室溫下反應15分鐘。隨后重復加入并取出100μ 1乙酸乙酯5次。然后用MicroSpin G-25柱取出殘留的DDT和硫醇片段。將剩余的DNA溶液和上面獲得的上清液②混合在一 起，且允許在室溫下反應30分鐘。將所獲得的溶液在15ml PBS緩沖液中稀釋，并用Amicon Ultra-15 (Ultracel-30K)在4°C下于4，OOOrpm離心40分鐘，進行四次。所得上清液為 d-Ab-DNA綴合物(II )，其中單克隆抗體(3)和DNA片段綴合。將d-Ab-DNA綴合物(II ) 用作OLISA分析中PSA的檢測探針。2. 2捕獲抗體和RNA綴合物的制備，以及OLISA分析將針對AFP的單克隆抗體(2)(實施例1.2)和針對PSA的單克隆抗體(4) (Fitzgerald Inc.，Cat#10-P20E)在PBS緩沖液中分別在10 μ g/mL的濃度溶解。制備的 溶液加入96孔微量培養(yǎng)板(每孔100 μ 1)，且于4°C放置15小時。用200 μ IPBS緩沖液 洗滌3次后，加入200 μ 1 3% (w/v)牛血清清蛋白(BSA)/PBS溶液。之后將微量培養(yǎng)板 于室溫溫育2小時。用2001 PBST(PBS+0. 05% (w/v)Tween-20)洗滌3次后，將每種抗原 (AFP (Fitzgerald))、PSA (Fitzgerald))在 3% (w/v) BSA/PBS 溶液中以各種濃度稀釋，并在 室溫下置于96孔微量培養(yǎng)板中2小時(每孔100 μ 1)。隨后，將孔用200 μ 1 PBST洗滌3次。實施例2. 1中制備的相應于抗原的d-Ab-DNA 綴合物在3% (w/v)BSA/PBS中以1 30的比率稀釋并置于孔中(每孔100 μ 1)，于室溫進 行2小時。微量培養(yǎng)板用200 μ 1 PBST溶液洗滌3次。然后，將100 μ 1含有40mMTris-HCl、 4mM MgCl2UmM DTF.O. 003% BSA、400nM 熒光素(FAM)-RNAl_dabcyl、400nM R0X-RNA2-BH Q2(R0X-5，-CCCAUAGA⑶(SEQ ID NO :4)_3，-BHQ2), 0. IU Protector RNA 酶抑制劑(Roche Inc. , Cat. #03335402001)和 6U RNA 酶 H(Takara bio Inc.，編號 No. 2150A)的反應溶 液加入孔中，室溫反應1小時。完成反應后，用微量培養(yǎng)板讀取儀(Varioskan flash, Thermoscientific Inc.)對于熒光素和ROX以分別為535± IOnm和589士5nm的發(fā)射波長 測量熒光強度。所得結果示于圖3。如圖3所示，熒光強度與靶物質(zhì)AFP和PSA的濃度成比例地增 力口。也就是說，AFP和PSA用本實施例中的方法進行了有效的檢測，彼此互不干擾。序列表<110>Korea Institute of Science and Technology<120>抗原檢測試劑盒和方法<130>0PP20091490US<160>4
<170>KopatentIn 1. 71<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>對于癌胚抗原與檢測抗體綴合的DNA寡核苷酸<400>1
tttttttt tttttttttttt aaccacagt g 30<210>2<211>10<212>RNA<213>人工序列<220><223>對于癌胚抗原的RNA寡核苷酸<400>2cacugugguu10<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>對于前列腺特異抗原與檢測抗體綴合的DNA寡核苷酸<400>3tttttttttt tttttttttt actctatggg30<210>4<211>10<212>RNA<213>人工序列<220><223>對于前列腺特異抗原的RNA寡核苷酸<400>4cccauagagu10
權利要求
一種抗原檢測試劑盒，其包括支持物；固定在所述支持物上的捕獲抗體，其中該捕獲抗體能夠特異結合抗原；檢測抗體 DNA綴合物(d Ab DNA綴合物)，其包括能夠在不同于捕獲抗體結合位點的抗原位點特異結合抗原的檢測抗體(d Ab)，和單鏈DNA寡核苷酸；熒光物質(zhì) RNA 熒光猝滅物質(zhì)綴合物，其包括互補于所述DNA寡核苷酸的單鏈RNA寡核苷酸，與該單鏈RNA寡核苷酸的一個末端結合的熒光物質(zhì)，和與該單鏈RNA寡核苷酸的另一個末端結合的熒光猝滅物質(zhì)；和RNA酶H。
2.權利要求1所述的抗原檢測試劑盒，其中所述抗原為選自以下的一種或多種自身 抗體、配體、天然提取物、肽、蛋白、金屬離子、合成藥物、天然藥物、代謝物、基因組、病毒和 病毒產(chǎn)物以及細菌和細菌產(chǎn)物。
3.權利要求2所述的抗原檢測試劑盒，其中所述抗原為選自以下的兩種或更多種自 身抗體、配體、天然提取物、肽、蛋白、金屬離子、合成藥物、天然藥物、代謝物、基因組、病毒 和病毒產(chǎn)物以及細菌和細菌產(chǎn)物，且試劑盒能夠同時檢測兩種或更多種類型的抗原。
4.權利要求3所述的抗原檢測試劑盒，其中檢測抗體-DNA綴合物具有與所檢測的抗原 種類對應的彼此不同的DNA寡核苷酸，且DNA寡核苷酸彼此之間不互補。
5.權利要求1至4中任一項所述的抗原檢測試劑盒，其中檢測抗體和DNA寡核苷酸通 過一種或多種選自酰胺鍵、二硫鍵、酯鍵、醚鍵和硫醚鍵的化學鍵結合。
6.權利要求5所述的抗原檢測試劑盒，其中檢測抗體和DNA寡核苷酸通過一種或多種 選自SMPH(琥珀酰亞胺基-6-[β-馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸酯)、SMPB(琥珀酰亞胺 基-4- [ρ-馬來酰亞胺基苯基]丁酸酯)、磺基-LC-SPDP (磺基琥珀酰亞胺基-6- (3 ’ - [2-吡 啶基二硫代]-丙酰胺基)己酸酯)和SIAB(N-琥珀酰亞胺基(4-碘乙?；?-氨基苯甲酸 酯)的交聯(lián)劑結合。
7.權利要求1至4中任意一項所述的抗原檢測試劑盒，其中熒光物質(zhì)為選自以下的一 種或多種香豆素類，咕噸類，花菁類，氟硼熒類，Alexa Fluor類以及DyLight Fluor類熒 光物質(zhì)。
8.權利要求1至4中任意一項所述的抗原檢測試劑盒，其中熒光猝滅物質(zhì)為選自以下 的一種或多種dabcyl類物質(zhì)，QSY類物質(zhì)，BHQ類物質(zhì)以及FRET (熒光共振能量轉移)。
9.一種抗原檢測方法，包括如下步驟使樣品接觸能夠特異結合待檢測抗原的捕獲抗體，以形成抗原-抗體結合；使檢測抗體-DNA寡核苷酸(d-Ab-DNA)綴合物接觸結合至捕獲抗體的抗原，其中檢測 抗體-DNA寡核苷酸綴合物包括能夠在不同于捕獲抗體結合位點的抗原位點特異結合抗原 的檢測抗體(d-Ab)，和結合至檢測抗體的單鏈DNA寡核苷酸，以在抗原與d-Ab-DNA綴合物 之間形成結合；使熒光物質(zhì)-RNA-熒光猝滅物質(zhì)(F-RNA-Q)綴合物與既結合捕獲抗體又結合d-Ab-DNA 綴合物的抗原接觸，其中F-RNA-Q綴合物包含互補于DNA寡核苷酸的單鏈RNA寡核苷酸、在 RNA寡核苷酸的一個末端的熒光物質(zhì)和在RNA寡核苷酸的另一個末端的熒光猝滅物質(zhì)，以 通過DNA-RNA的雜交形成DNA-RNA雙鏈；用降解DNA-RNA雙鏈中RNA的RNA酶處理獲得的DNA-RNA雙鏈，以從RNA釋放熒光物 質(zhì)，且產(chǎn)生熒光；以及測量產(chǎn)生的熒光強度。
10.權利要求9所述的抗原檢測方法，其中所述抗原為選自以下的一種或多種自身抗 體、配體、天然提取物、肽、蛋白、金屬離子、合成藥物、天然藥物、代謝物、基因組、病毒和病 毒產(chǎn)物以及細菌和細菌產(chǎn)物。
11.權利要求9所述的抗原檢測方法，其中所述抗原為選自以下的兩種或更多種自 身抗體、配體、天然提取物、肽、蛋白、金屬離子、合成藥物、天然藥物、代謝物、基因組、病毒 和病毒產(chǎn)物以及細菌和細菌產(chǎn)物，且所述方法能夠用兩種或更多種RNA寡核苷酸同時檢測 兩種或更多種類型的抗原，其中每種RNA寡核苷酸相應于抗原的種類結合至不同的熒光物 質(zhì)。
12.權利要求11所述的抗原檢測方法，其中檢測抗體-DNA綴合物具有與所檢測的抗原 種類對應的彼此不同的DNA寡核苷酸，且DNA寡核苷酸彼此之間不互補。
13.權利要求9至12中任意一項所述的抗原檢測方法，其中熒光物質(zhì)為選自以下的一 種或多種香豆素類，咕噸類，花菁類，氟硼熒類，Alexa Fluor類以及DyLight Fluor類熒 光物質(zhì)。
14.權利要求9至12中任意一項所述的抗原檢測方法，其中熒光猝滅物質(zhì)為選自以下 的一種或多種dabcyl類物質(zhì)，QSY類物質(zhì)，BHQ類物質(zhì)以及FRET (熒光共振能量轉移)。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗原檢測試劑盒和方法。提供了一種抗原檢測試劑盒和使用該試劑盒的抗原檢測方法。該抗原檢測試劑盒包括捕獲抗體、結合至單鏈DNA寡核苷酸的檢測抗體、互補于該DNA寡核苷酸的單鏈RNA寡核苷酸和RNA酶。
文檔編號G01N33/52GK101988920SQ200910253018
公開日2011年3月23日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權日2009年7月30日
發(fā)明者安大魯, 楊恩卿, 韓基喆 申請人:韓國科學技術研究院