本發(fā)明屬于體外診斷試劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種前白蛋白多抗血清的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血清前白蛋白(pa)又稱轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，是由4個(gè)相同亞基組成的四聚體，分子量為55.0kd。由肝細(xì)胞合成，除作為組織修補(bǔ)的材料外，還可視作一種轉(zhuǎn)載蛋白，pa與視黃醇結(jié)合蛋白形成復(fù)合物，具有運(yùn)載維生素a的作用。pa與甲狀腺素結(jié)合球蛋白(tbg)和白蛋白(alb)一起，協(xié)同參與甲狀腺素的轉(zhuǎn)運(yùn)。pa在甲狀腺激素運(yùn)輸中的作用僅次于tbg。tbg負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)甲狀腺素總量的70％～75％，pa則轉(zhuǎn)運(yùn)15％～20％，而alb轉(zhuǎn)運(yùn)的甲狀腺素更少些(10％)。在正常生理?xiàng)l件下，血漿甲狀腺素幾乎全部(99.98％)通過與這三種蛋白質(zhì)結(jié)合運(yùn)轉(zhuǎn)，到達(dá)靶細(xì)胞。pa的另一重要功能是協(xié)助視黃醇結(jié)合蛋白(rbp)轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇。當(dāng)機(jī)體需要維生素a時(shí)，貯存在肝臟內(nèi)的視黃醇酯被水解，游離的視黃醇與rbp結(jié)合，被分泌到血循環(huán)中，再與pa結(jié)合，所形成的視黃醇rbp-pa大分子結(jié)合物，通過循環(huán)轉(zhuǎn)運(yùn)到有特異性rbp受體結(jié)合部位的靶組織中，一進(jìn)入靶細(xì)胞，視黃醇-rbp-pa結(jié)合物即分離。血清中pa的測定結(jié)果在臨床上是反應(yīng)肝功能和機(jī)體營養(yǎng)狀態(tài)的重要指標(biāo)，常見于營養(yǎng)不良者。由于pa半衰期很短，可以反應(yīng)肝臟合成和分解代謝的輕微改變，其血清濃度降低的幅度與肝實(shí)質(zhì)損害的程度密切相關(guān)，因此在臨床上也常見于肝功能損傷、肝硬化、外傷及感染患者。急性、亞急性重癥肝炎起病后一周內(nèi)，pa的下降變化遠(yuǎn)較alb敏感。各型肝炎患者血清pa水平均有不同程度的降低，以肝硬化和重癥肝炎降低最顯著。因此，血清中的pa可作為中毒肝病的早期診斷指標(biāo)和觀察肝臟功能恢復(fù)的靈敏指標(biāo)。鑒于前白蛋白在疾病診斷中的應(yīng)用，作為前白蛋白檢測試劑核心原料的前白蛋白多抗血清的制備具有顯著的應(yīng)用價(jià)值。常規(guī)的硫酸銨和氯化鈣沉淀法存在雜蛋白去除不完全、血清損耗率高等問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種前白蛋白多抗血清的制備方法及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種前白蛋白多抗血清的制備方法，其中，包括以下步驟：1)采血：使用無菌采血法采集羊全血至血袋內(nèi)備用；2)分離：將步驟1)采集的羊全血置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用3000～5000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，待離心結(jié)束后取上清液備用；3)沉淀：在步驟2)處理好的上清液中按照體積比為上清液：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)，制得混合溶液；4)離心：將步驟3)制得的混合溶液置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000～1000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物備用；5)復(fù)溶：將步驟4)制得的沉淀物中再按照體積比為沉淀物：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2～3小時(shí)，制得混合溶液；6)重離心：將步驟5)制得的混合溶液再置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000～1000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物備用；7)再在步驟6)制得的沉淀物中加入體積比為沉淀物：生理鹽水＝3:2的生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌10～15分鐘，將混合液裝入透析袋，在生理鹽水環(huán)境中透析72h～96h，每24h更換一次生理鹽水，透析結(jié)束后得透析液；8)將步驟7)制得的透析液倒出，置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000～1000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄沉淀，在上清中加體積分?jǐn)?shù)為4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本發(fā)明一種前白蛋白多抗血清，應(yīng)用于制備前白蛋白檢測試劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的從免疫的羊血漿中制備前白蛋白多抗血清的制備方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果：1.在飽和硫酸銨溶液中添加氨水，使得溶液處于穩(wěn)定的飽和狀態(tài)，保證鹽析的進(jìn)行；2.利用蛋白質(zhì)的鹽析特性，兩次沉淀純化，減少了血漿中的雜蛋白；3.根據(jù)聚乙二醇可作為分散劑和促溶劑的性質(zhì)，保證了血清的穩(wěn)定狀態(tài)。采用簡便操作方法，實(shí)現(xiàn)了血清除雜，該方法不但操作簡單，而且血清損耗少，獲得的血清可以直接用于診斷試劑生產(chǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種前白蛋白多抗血清的制備方法，其中，包括以下步驟：1)采血：使用無菌采血法采集羊全血至血袋內(nèi)備用；2)分離：將步驟1)采集的羊全血置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用3000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，待離心結(jié)束后取上清液a1備用；3)沉淀：在步驟2)處理好的上清液a1中按照體積比為上清液：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2小時(shí)，制得混合溶液b1；4)離心：將步驟3)制得的混合溶液b1置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c1備用；5)復(fù)溶：將步驟4)制得的沉淀物c1中再按照體積比為沉淀物：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2小時(shí)，制得混合溶液b2；6)重離心：將步驟5)制得的混合溶液b2再置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c2備用；7)再在步驟6)制得的沉淀物c2中加入體積比為沉淀物：生理鹽水＝3:2的生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌10分鐘，將混合液裝入透析袋，在生理鹽水環(huán)境中透析72h，每24h更換一次生理鹽水，透析結(jié)束后得透析液d；8)將步驟7)制得的透析液d倒出，置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用8000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄沉淀，得上清a2，在上清a2中加體積分?jǐn)?shù)為4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本發(fā)明一種前白蛋白多抗血清，應(yīng)用于制備前白蛋白檢測試劑。實(shí)施例2一種前白蛋白多抗血清的制備方法，其中，包括以下步驟：1)采血：使用無菌采血法采集羊全血至血袋內(nèi)備用；2)分離：將步驟1)采集的羊全血置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用5000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，待離心結(jié)束后取上清液a1備用；3)沉淀：在步驟2)處理好的上清液a1中按照體積比為上清液：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌3小時(shí)，制得混合溶液b1；4)離心：將步驟3)制得的混合溶液b1置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用10000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c1備用；5)復(fù)溶：將步驟4)制得的沉淀物c1中再按照體積比為沉淀物：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌3小時(shí)，制得混合溶液b2；6)重離心：將步驟5)制得的混合溶液b2再置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用10000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c2備用；7)再在步驟6)制得的沉淀物c2中加入體積比為沉淀物：生理鹽水＝3:2的生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌15分鐘，將混合液裝入透析袋，在生理鹽水環(huán)境中透析96h，每24h更換一次生理鹽水，透析結(jié)束后得透析液d；8)將步驟7)制得的透析液d倒出，置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用10000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄沉淀，得上清a2，在上清a2中加體積分?jǐn)?shù)為4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本發(fā)明一種前白蛋白多抗血清，應(yīng)用于制備前白蛋白檢測試劑。實(shí)施例3一種前白蛋白多抗血清的制備方法，其中，包括以下步驟：1)采血：使用無菌采血法采集羊全血至血袋內(nèi)備用；2)分離：將步驟1)采集的羊全血置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用4000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，待離心結(jié)束后取上清液a1備用；3)沉淀：在步驟2)處理好的上清液a1中按照體積比為上清液：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2.5h，制得混合溶液b1；4)離心：將步驟3)制得的混合溶液b1置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用9000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c1備用；5)復(fù)溶：將步驟4)制得的沉淀物c1中再按照體積比為沉淀物：1％氨水的飽和硫酸銨溶液：生理鹽水＝3:5:2的比例加入含1％氨水的飽和硫酸銨溶液和生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌2.5h，制得混合溶液b2；6)重離心：將步驟5)制得的混合溶液b2再置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用9000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄上清，沉淀物c2備用；7)再在步驟6)制得的沉淀物c2中加入體積比為沉淀物：生理鹽水＝3:2的生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌10分鐘，將混合液裝入透析袋，在生理鹽水環(huán)境中透析84h，每24h更換一次生理鹽水，透析結(jié)束后得透析液d；8)將步驟7)制得的透析液d倒出，置于高速冷凍離心機(jī)中，在溫度為4℃的條件下，采用9000rpm的轉(zhuǎn)速，離心10min，棄沉淀，得上清a2，在上清a2中加體積分?jǐn)?shù)為4％的peg-6000，制得前白蛋白多抗血清。本發(fā)明一種前白蛋白多抗血清，應(yīng)用于制備前白蛋白檢測試劑。將上述實(shí)施例中制備的實(shí)施例1血清、實(shí)施例2血清和實(shí)施例3血清分別檢測試劑空白值、分析靈敏度、精密度，檢測結(jié)果如下：1.試劑空白表1為由實(shí)施例1血清、實(shí)施例2血清和實(shí)施例3血清配制的前白蛋白試劑分別在相同條件下連續(xù)檢測三次空白吸光度。表12.分析靈敏度表2為由實(shí)施例1血清、實(shí)施例2血清配制的前白蛋白試劑分別在相同條件下連續(xù)檢測三次質(zhì)控品，計(jì)算吸光度變化值δa表23.精密度表3-5為由實(shí)施例1血清、實(shí)施例2配制的前白蛋白試劑分別在相同條件下連續(xù)檢測10次質(zhì)控品1(前白蛋白含量為9.8mg/dl)、質(zhì)控品2(前白蛋白含量為20.3mg/dl)、質(zhì)控品3(前白蛋白含量為30.2mg/dl)表3質(zhì)控品112345678910cv偏差實(shí)施例110.210.810.710.710.810.910.810.410.710.82.01％8.97％實(shí)施例210.010.110.19.910.59.79.89.910.010.22.25％2.24％實(shí)施例310.110.39.99.8109.710.210.210.49.92.26％2.55％表4質(zhì)控品2表5質(zhì)控品312345678910cv偏差實(shí)施例131.531.231.231.131.431.430.531.230.931.40.95％3.31％實(shí)施例229.129.028.828.329.528.530.129.429.129.01.76％-3.64％實(shí)施例329.530.330.630.930.429.829.629.430.329.71.71％-0.50％表3-5表明，由本發(fā)明所制前白蛋白多抗血清配制的前白蛋白檢測試劑對質(zhì)控品1、2、3的檢測結(jié)果不準(zhǔn)確度相對偏差不超過±5％，靶值偏差不超過±10％，說明符合診斷試劑的技術(shù)指標(biāo)。本發(fā)明的血清可直接應(yīng)用于診斷試劑的生產(chǎn)。當(dāng)前第1頁12