本發(fā)明涉及一種elisa檢測試劑盒及其應(yīng)用，特別涉及一種用于豬流行性腹瀉病毒特異性siga檢測的elisa檢測試劑盒及其在評價pedv感染及免疫狀態(tài)中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，pedv)等病原引起的豬的腸道疾病。ped已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。pedv主要引起仔豬腹瀉、脫水和死亡。經(jīng)糞口途徑傳播是其主要的傳播方式。到目前為止，檢測pedv感染和接種疫苗后常用的方法有基于rna的rt-pcr、實時定量pcr、多重pcr和rt-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，以及檢測抗體的igg和iga檢測方法，檢測病原的間接免疫熒光方法和電鏡技術(shù)。

pedv感染豬只后不會出現(xiàn)病毒血癥，血清中的各類抗體不能有效清除病毒，但對igg和iga抗體的檢測能夠有效評估免疫狀況和自然感染狀況。pedv感染的靶器官是仔豬小腸絨毛膜上皮細(xì)胞。黏膜免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道防線，而黏膜免疫系統(tǒng)中病原特異性的分泌型iga(siga)抗體能有效中和病毒、阻斷病原體與機(jī)體接觸，促進(jìn)病原體排出體外。siga主要存在于消化道、呼吸道及生殖道的黏膜表面以及初乳中，由分泌片(sc)、兩個iga分子和聯(lián)接鏈(j)組成，sc片段能夠覆蓋iga分子中的蛋白酶酶切位點(diǎn)，從而保證了siga分子的穩(wěn)定性。因此，機(jī)體內(nèi)pedv特異性siga水平是評價機(jī)體能否有效阻斷pedv感染的重要指標(biāo)。鑒于此，本發(fā)明建立了能夠評價pedv感染及免疫狀態(tài)的siga檢測試劑盒及其檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一株能夠穩(wěn)定分泌抗sigasc片段單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，由該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體及其在檢測siga中的用途。

本發(fā)明的目的之二是提供一種用于pedv特異性siga檢測的elisa檢測試劑盒、檢測方法及其在評價pedv感染及免疫狀態(tài)中的應(yīng)用。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明以初乳中純化出的siga為抗原，免疫balb/c小鼠，獲得一株穩(wěn)定分泌抗sigasc片段單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2f9，分類命名為小鼠抗豬sigasc片段單克隆抗體細(xì)胞株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是：cgmccno.13813，保藏時間是：2017年3月20日。

由所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的單克隆抗體在制備檢測特異性siga試劑中的用途。

本發(fā)明的一種pedv特異性sigaelisa檢測試劑盒，包括抗sigasc片段的單克隆抗體，所述的單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株2f9分泌產(chǎn)生。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述的抗sigasc片段的單克隆抗體是用辣根過氧化物酶標(biāo)記的。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，還包括由純化的pedv粒子包被的酶標(biāo)板、稀釋液、洗滌液、陽性對照、陰性對照、abts顯色液以及終止液。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述的陽性對照為pedvsiga抗體陽性的豬直腸拭子或初乳樣品，所述的陰性對照為pedvsiga抗體陰性的豬直腸拭子或初乳樣品。

在本發(fā)明所述的試劑盒中，優(yōu)選的，所述的酶標(biāo)板上，pedv粒子的包被濃度為5.8ng/孔，優(yōu)選的，所述的pedv粒子為pedv-lnct2病毒粒子。

所述的pedv-lnct2病毒已記載在文獻(xiàn)“豬流行性腹瀉病毒g1與g2基因亞型毒株抗原差異性分析，王瀟博，《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2016年”中，由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存，提供。

使用本發(fā)明所述的試劑盒用于pedv特異性siga抗體檢測時，按照以下步驟進(jìn)行：

(1)從冰箱取出試劑盒，室溫放置30分鐘；

(2)取出酶標(biāo)板，分別設(shè)置陽性對照孔、待測樣品孔、陰性對照孔和空白對照孔，記錄各孔位置，待檢樣品及標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品、標(biāo)準(zhǔn)陰性對照樣品分別用稀釋液做1：100稀釋后，分別加入待測樣品孔、陽性對照孔、陰性對照孔，空白對照孔不加；

(3)置37℃恒溫箱作用1h；

(4)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液，靜置，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板2-3次；

(5)每孔加入按照1:3000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗sigasc片段的單克隆抗體，空白對照孔不加；

(6)37℃恒溫箱作用1h；

(7)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液，靜置，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板2-3次；

(8)每孔中加入abts顯色液，混勻，37℃避光顯色15min；

(9)終止：每孔中加入終止液終止反應(yīng)。

(10)測定：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在405nm波長下測定各孔吸光值；

(11)結(jié)果判定

直腸拭子：od405值>0.261判為陽性，od405值≤0.261判為陰性；

初乳樣品：od405值>0.305判為陽性，od405值≤0.305判為陰性。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的試劑盒在制備檢測pedv特異性siga試劑中的用途。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明中所用的毒株pedv-lnct2毒株(g2亞型)s基因與cv777毒株s基因(g1亞型)的同源性為93.2％，以pedv-lnct2粒子為抗原完全可以結(jié)合cv777毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的siga抗體。

2、本發(fā)明中所用的陰性樣品和陽性樣品都經(jīng)ifa驗證，檢測樣品也同樣用ifa進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果與ifa高度一致。ifa被認(rèn)為是檢測方法的金標(biāo)準(zhǔn)，具有敏感性和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。由于目前沒有pedv特異性siga商品化檢測試劑盒，本研究建立的elisa檢測方法與ifa檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果具有可信性，因此，pedv特異性sigaelisa檢測方法可以用來檢測豬群的pedv感染狀況或其免疫狀況。

3、siga主要存在于消化道、呼吸道及生殖道的黏膜表面以及初乳中，采集方便，不會引起動物應(yīng)激反應(yīng)。

4、本發(fā)明獲得的抗sc片段的單克隆抗體能夠與siga分子中的sc片段特異性結(jié)合，與iga分子無反應(yīng)，能夠有效排除iga分子對siga的影響。

5、檢測豬初乳和直腸拭子中的siga可以為母豬及仔豬何時接種疫苗提供有效幫助。pedv特異性sigaelisa檢測方法為檢測豬體的主動免疫和被動免疫狀態(tài)提供了一個敏感和特異性檢測方法。

附圖說明

圖1為sds-page鑒定凝膠過濾層析純化的各組分的鑒定結(jié)果；

1-7為凝膠過濾層析純化的不同組分；m為marker；

圖2為westernblot鑒定；

圖3為電鏡觀察pedv粒子(負(fù)染法)；

圖4為抗原最佳包被濃度的確定；

圖5為ifa檢測直腸拭子和初乳樣品中的pedv特異性siga；

1和3為pedv-siga陽性直腸拭子分別與感染pedv的vero-e6細(xì)胞和健康vero-e6細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果；2為pedv-siga陰性直腸拭子與感染pedv的vero-e6細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果；4和6為pedv-siga陽性初乳樣品分別與感染pedv的vero-e6細(xì)胞和健康vero-e6細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果；5為pedv-siga陰性初乳樣品與感染pedv的vero-e6細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果；

圖6為間接elisa臨界值的確定；

虛線為測定直腸拭子時的臨界值；實線為檢測初乳樣品時的臨界值；

圖7為pedv不同抗體效價的初乳樣本elisa檢測敏感性實驗。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明實施例所使用的細(xì)胞、試驗動物、抗體和試劑：

sp2/0和vero-e6細(xì)胞系由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬消化道傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊保存；rpmi1640培養(yǎng)液(gibco)；hat和ht培養(yǎng)基、peg(mw4000)、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自sigma公司；balb/c小鼠由本所實驗動物中心代為購買。辣根過氧化物酶(hrp)購自sigma公司；2，2-連氮基雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(abts)為bbi產(chǎn)品；pedv陽性、陰性直腸拭子樣品均來自感染實驗中pedv攻毒豬和陰性對照豬；陰性初乳采自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物基地。凝膠過濾層析柱superdex20010/300gl購自gehealthcare公司。

實施例1穩(wěn)定分泌針對于siga分子分泌片(sc)抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制備

1.母豬初乳的采集和純化

1.1初乳采集及純化

母豬分娩后1-3天內(nèi)采集初乳，對采集到的初乳在4℃，15000g離心15min，收集乳清，棄去沉淀和脂肪層。乳清邊攪拌邊滴加等量的飽和硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達(dá)到50％，4℃攪拌30min，15000g離心30min。將沉淀用生理鹽水稀釋后緩慢滴加飽和硫酸銨，使其飽和度達(dá)到40％，離心棄去上清液。沉淀用ph7.5的pbs溶解，15000g離心30min，上清液即為豬siga初提液，4℃條件下保存，備用。

1.2siga抗體的提純

按常規(guī)方法處理sephadexg-200，裝柱平衡后將siga粗提液加于sephadexg-200柱。用0.01mol/l、ph為7.5的pbs洗脫于多個收集管中。各管洗脫液用10％sds-page電泳鑒定。10％sds-page電泳鑒定后收集并混合siga主峰液，最后經(jīng)proteing柱純化，去除igg。收集的提純液即為豬siga。

2.抗豬siga單克隆抗體的制備

2.1balb/c小鼠的免疫

將純化的豬siga抗體與等量弗氏完全佐劑混合后腹部皮下接種6周齡balb/c小鼠5只，每只接種抗原劑量為100μg。2周后注射同一劑量弗氏不完全佐劑處理的抗原。細(xì)胞融合前3d，用等量不加佐劑的抗原(每只200μg)腹腔注射加強(qiáng)免疫1次，即可進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.2細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立

免疫鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞按照5：1比例混合后加peg融合，于96孔培養(yǎng)板中37℃、co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液開始變黃，或雜交瘤細(xì)胞長滿至孔底面積的1/10時，吸取上清液，經(jīng)間接elisa和wb法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。用有限稀釋法對陽性孔連續(xù)3次亞克隆，至所有單克隆孔均為陽性為止。將最終獲得的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后建株，凍存。

2.3單抗腹水的制備及效價的測定

取8周齡balb/c小鼠腹腔注射滅菌石蠟油(每只0.5ml)，7d后將生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，以每只約5×10⁵個腹腔注射balb/c小鼠。7d左右小鼠腹部開始明顯膨大，反復(fù)抽取腹水，以3000r/min離心10min除去細(xì)胞成分和其他沉淀，收集上清液。純化后加入0.02％疊氮鈉，分裝，-70℃保存。將腹水用pbs遞增稀釋，以elisa測定單抗的效價。

2.4亞型鑒定單抗亞型鑒定

按照亞型鑒定試劑盒操作說明書對以上試驗中得到的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。

2.5陽性雜交瘤細(xì)胞株分泌單抗穩(wěn)定性的測定

將凍存3個月的陽性雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇，24孔細(xì)胞板培養(yǎng)，檢測上清是否呈陽性來判定復(fù)蘇的陽性細(xì)胞是否有分泌抗體的能力。將經(jīng)過3次亞克隆的陽性率達(dá)100％的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行體外連續(xù)傳代培養(yǎng)3個月，每隔2周檢測1次細(xì)胞上清液。

3結(jié)果

3.1sds-page鑒定純化后的siga

純化后的siga的sds-page鑒定結(jié)果如圖1所示，siga有sc片段、重鏈、輕鏈和j鏈組成。1-7為凝膠過濾層析收集到的不同組分鑒定，選取2、3、4號樣品作為抗原。

3.2westernblot鑒定單抗與siga反應(yīng)

經(jīng)elisa篩選和westernblot鑒定，最終獲得一株穩(wěn)定分泌針對于siga分子分泌片(sc)抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2f9，分類命名為小鼠抗豬sigasc片段單克隆抗體細(xì)胞株，將該細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后建株，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是：北京市朝陽區(qū)大屯路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，其微生物保藏號是：cgmccno.13813，保藏時間是：2017年3月20日。

單克隆抗體2f9的westernblot鑒定如圖2所示，從該結(jié)果可以看出2f9抗體能夠與siga分子的sc片段結(jié)合。

3.3單抗腹水的效價的測定

待小鼠腹部膨大后抽取其腹水，3000r/min離心10min取上清。采用elisa方法檢測上清和腹水抗體效價。結(jié)果表明：2f9單抗細(xì)胞上清液抗體效價高于1：1000，腹水抗體效價高于1：100000。

3.4亞型鑒定單抗亞型鑒定

經(jīng)鑒定，單克隆抗體2f9的重鏈為igg1亞型，輕鏈為κ型。

3.5陽性雜交瘤細(xì)胞株分泌單抗穩(wěn)定性的測定

將凍存細(xì)胞株復(fù)蘇后于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，間接elisa檢測細(xì)胞上清液，結(jié)果od405值仍很高。將細(xì)胞傳代3個月，每隔2周檢測1次上清液，結(jié)果顯示od405值穩(wěn)定。

實施例2檢測pedv特異性siga抗體的間接elisa方法的建立

1、方法

1.1.pedv-lnct2毒株的培養(yǎng)

vero-e6細(xì)胞長滿形成單層后，棄去營養(yǎng)液，用pbs(磷酸鹽緩沖溶液，ph7.2)洗滌三遍，接種pedv-lnct2毒株。病毒接種劑量按照5％濃度接種，接種病毒同時添加胰酶，胰酶的終濃度為10μg/ml。觀察細(xì)胞病變，待80％～90％細(xì)胞出現(xiàn)病變時，將病毒凍存至-20冰箱，收毒，備用。

1.2.pedv的純化

pedv-lnct2病毒液經(jīng)5000g離心5min去除細(xì)胞碎片后，用超速離心機(jī)100000g離心2h，棄去上清液，收集沉淀。沉淀用蔗糖梯度密度離心純化，共設(shè)置5個蔗糖濃度，20％、30％、40％、50％和60％。超速離心機(jī)sw32轉(zhuǎn)子100000g離心2h后，收集50％～60％蔗糖層之間的樣品，樣品經(jīng)sw32轉(zhuǎn)子100000g離心2h進(jìn)行脫糖處理，棄去上清液收集沉淀。沉淀即為純化的病毒粒子，并進(jìn)行電鏡鑒定。

1.3.ifa篩選陰性樣品和陽性樣品

veroe6細(xì)胞長滿單層后，接種pedv-lnct2，觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞剛出現(xiàn)病變，即可用4％多聚甲醛固定細(xì)胞，加入待檢直腸拭子浸出液和初乳樣品(30倍稀釋)，37℃反應(yīng)1h，pbs洗滌3次后加入純化的2f9抗體(1：10000)37℃孵育1h，pbs洗滌3次，加入山羊抗小鼠igg/alexafluor488(中杉金橋)反應(yīng)30min，洗滌后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.腹水純化及hrp標(biāo)記

將實施例1制備得到的腹水按照hitrapproteinghp(gehealthcare)抗體純化說明書進(jìn)行純化，純化后的抗體2f9經(jīng)濃度測定后，對抗體2f9進(jìn)行hrp標(biāo)記，按文獻(xiàn)(金伯泉等，2002)介紹的簡易過碘酸鈉法進(jìn)行hrp-單抗標(biāo)記試驗，對標(biāo)記過的抗體2f9進(jìn)行效價測定。

1.5.間接elisa反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1抗原最佳包被濃度的選擇

將純化的pedv-lnct2病毒粒子(濃度為1.584μg/μl)進(jìn)行系列倍比稀釋，每孔包被100μl(每孔分別含742ng、371ng、185ng、92.5ng、46.25ng、23.12ng、11.56ng、5.8ng、2.9ng、1.45ng和0.725ng抗原)。間接elisa測定各孔o(hù)d405值，選定p/n值(陽性樣品od值/陰性樣品od值)最大并且所需抗原包被濃度最小時作為最佳抗原包被濃度。

1.5.2一抗最佳孵育時間的優(yōu)化

將一抗的孵育時間設(shè)置為30min、lh、1.5h、2h和4h5個時間段，分別進(jìn)行elisa試驗，篩選出一抗孵育最佳時間。

1.5.3hpr標(biāo)記的2f9單克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)和反應(yīng)時間確定

hpr標(biāo)記的2f9單克隆抗體按照1：2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000等不同濃度稀釋經(jīng)elisa試驗確定最佳稀釋倍數(shù)。分別設(shè)置為15min、30min、45min、60min、90min，進(jìn)行elisa試驗，篩選出酶標(biāo)抗體最佳作用時間。

1.5.4底物反應(yīng)時間的優(yōu)化

將底物的作用時間分別設(shè)置為5min、10min、15min、20min、25min，進(jìn)行elisa試驗，選出底物最佳作用時間。

1.6.陰性和陽性臨界值判定

經(jīng)ifa檢測篩選出來的30份pedvsiga陰性直腸拭子和27份siga陰性初乳樣品，用于該elisa檢測方法陰性和陽性臨界值的判定。根據(jù)od405值分別計算出份陰性直腸拭子樣品和初乳樣品的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差(sd)，確定樣品的陰、陽性臨界值。取為臨界值。

1.7.間接elisa的特異性試驗

pedv、tgev、pcv2和porv已知陽性血清作為檢測抗體。以pedvsiga陽性直腸拭子和初乳樣品作為陽性對照，以pedvsiga陰性直腸拭子和初乳樣品作為陰性對照，用已建立的elisa方法進(jìn)行特異性試驗，測定其od405值。

1.8.間接elisa的敏感性試驗

選取經(jīng)ifa標(biāo)定的6份初乳樣品，經(jīng)倍比稀釋后用本發(fā)明建立的elisa方法進(jìn)行檢測，測定其敏感性。

2、結(jié)果

2.1電鏡鑒定純化的pedv粒子

如圖3所示，純化的病毒粒子經(jīng)負(fù)染法后觀察，可見病毒純化效果較好，雜質(zhì)少，纖突蛋白完整且明顯。

2.2標(biāo)記后抗體效價的測定

腹水經(jīng)純化后用辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記，標(biāo)記后抗體的效價為1：10000。

2.3間接elisa反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1最佳包被抗原濃度的選擇

純化的pedv病毒粒子經(jīng)倍比稀釋作為包被抗原，進(jìn)行elisa試驗。結(jié)果表明當(dāng)包被2.9ng/孔抗原時，od405值明顯下降；包被5.8ng/孔抗原時p/n值最大(圖4)，因此確定該濃度為最佳包被濃度，并用于后續(xù)的試驗。

2.3.2最佳工作條件的選擇

按照最佳抗原包被濃度進(jìn)行常規(guī)的操作步驟對檢測樣品孵育時間、hrp標(biāo)記的2f9單抗的最佳作用濃度和時間、底物作用時間等分別進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳的工作條件分別是檢測樣品37℃孵育1h、hrp標(biāo)記的2f9單抗的最佳稀釋濃度是1∶3000倍稀釋，37℃孵育1h、底物作用15min。

2.3.3ifa篩選陰性樣品和陽性樣品

通過ifa篩選，本研究共篩選到30份pedv陰性豬直腸拭子和27份pedv陰性的初乳樣品，以及30份pedv陽性豬直腸拭子和30份pedv陽性的初乳樣品。陰性樣品與陽性樣品的ifa檢測結(jié)果如圖5所示。

2.3間接elisa臨界值的確定

采用本發(fā)明所建立的elisa方法分別對30份pedv陰性的直腸拭子和27份陰性初乳樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示，直腸拭子sd＝0.035，因此將od405值>0.261判為陽性，od405值≤0.261判為陰性；初乳樣品sd＝0.029，因此將od405值>0.305判為陽性，od405值≤0.305判為陰性。

2.4間接elisa的特異性試驗

采用所建立的elisa方法進(jìn)行特異性試驗。結(jié)果表明，該elisa方法具有較好的特異性，與常見的病毒血清抗體沒有交叉反應(yīng)(表1)。

表1所建立的elisa方法進(jìn)行特異性試驗結(jié)果

2.5間接elisa的敏感性試驗

如圖7所示，6份經(jīng)ifa標(biāo)定的初乳樣品的elisa檢測值與ifa測定的效價呈正相關(guān)，隨著抗體稀釋倍數(shù)增加od405值呈平緩遞減。當(dāng)ifa檢測標(biāo)定的抗體效價在200-6400之間時，elisa檢測可獲得較好的敏感性。

實施例3試劑盒的組裝、符合性實驗及初步應(yīng)用

1、試劑盒的組裝

(1)酶標(biāo)板：該酶標(biāo)板已包被有純化的pedv-lnct2病毒粒子，包被濃度為5.8ng/孔。制備方法如下：

(a)將純化的pedv-lnct2病毒粒子，然后加入酶標(biāo)板的各孔中，加入的量為5.8ng/每孔，4℃包被過夜；

(b)洗滌：取出拍干后，以pbst緩沖液洗滌3次(5min/次)，拍干液體；

(c)用1％bsa-pbst，100μl/孔，37℃封閉1h，洗滌同步驟(b)；

(2)10×洗滌液：所述10×洗滌液是含有5v/v％tween-20、8w/w％氯化鈉、0.2w/w％氯化鉀、2.9w/w％磷酸氫二鈉和0.2w/w％磷酸二氫鉀的水溶液，ph7.4；

(3)10×樣品稀釋液：所述10×樣品稀釋液是含有5w/w％牛血清白蛋白、5v/v％tween-20、8w/w％氯化鈉、0.2w/w％氯化鉀、2.9w/w％磷酸氫二鈉和0.2w/w％磷酸二氫鉀的水溶液，ph7.4；

(4)酶標(biāo)試劑：hrp標(biāo)記的2f9單抗(實施例2制備)用pbs緩沖液以1∶3000倍稀釋；

(5)abts底物顯色液；

(6)終止液：2mol/l的h2so4溶液；

(7)標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品：pedvsiga陽性的直腸拭子或初乳樣品；

(8)標(biāo)準(zhǔn)陰性對照樣品。pedvsiga陰性的直腸拭子或初乳樣品。

2、符合性實驗及初步應(yīng)用

采集黑龍江省部分豬場豬直腸拭子165份和初乳樣品各30份，利用ifa和本發(fā)明建立的elisa方法檢測樣品中的pedv特異性siga抗體，測定陽性率和符合性。其中，本發(fā)明的建立的elisa方法具體操作步驟如下：

(1)準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫放置30分鐘。用蒸餾水將10×洗滌液、10×稀釋液分別稀釋成1×洗滌液、1×稀釋液；

(2)加樣：取出酶標(biāo)板，固定于框架上，分別設(shè)置陽性對照孔、待測樣品孔、陰性對照孔和空白對照孔，記錄各孔位置。待檢樣品及標(biāo)準(zhǔn)陽性對照樣品、標(biāo)準(zhǔn)陰性對照樣品分別用稀釋液做1：100稀釋后，分別加入待測樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔，100μl/孔?？瞻讓φ湛撞患樱?/p>

(3)溫育：置37℃恒溫箱作用1h。

(4)洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液250μl，靜置5min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次。

(5)加酶標(biāo)試劑：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白對照孔不加。

(6)溫育：37℃恒溫箱作用1h。

(7)洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加洗滌液250μl，靜置5min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3次。

(8)顯色：每孔中加入100μl底物顯色液，平板混勻器混勻30s，37℃避光顯色15min。

(9)終止：每孔中加入50μl終止液終止反應(yīng)。

(10)測定：以空白孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔吸光值(od)。

(11)結(jié)果判定

直腸拭子：od405值>0.261判為陽性，od405值≤0.261判為陰性；

初乳樣品：od405值>0.305判為陽性，od405值≤0.305判為陰性。

結(jié)果如表2所示，從該結(jié)果可以看出臨床檢測樣品中pedv特異性siga抗體陽性率達(dá)49.7％，ifa檢測的陽性率為50.9％，二者符合率為97.6％；對30份臨床中采集的初乳樣品進(jìn)行檢測，二者的陽性率均為100％。初步應(yīng)用表明所檢測豬群中普遍存在pedv特異性siga抗體。

表2間接elisa和ifa檢測臨床豬直腸拭子中siga及結(jié)果比較