專利名稱：一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法。
背景技術(shù)：
流行性出血熱(EHF)又稱腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renalsyndrome, HFRS),是由布尼亞病毒科(Bunyaviridae)漢坦病毒屬(Hantavirus)中某些病毒引起，并以鼠類為主要傳染源的自然疫源性疾病。臨床上以發(fā)熱、休克、充血性出血和急性腎功能衰竭為主要表現(xiàn)，并常伴有腔道出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、肺水腫等多種并發(fā)癥。腎綜合征出血熱分布于全世界30多個國家，疫源地分布于五大洲70多個國家，已成為世界公共衛(wèi)生問題。我國是受腎綜合征出血熱危害最為嚴(yán)重的國家，年報告發(fā)病人數(shù)約為4 6萬，占世界報告病例總數(shù)的90%以上，高發(fā)疫區(qū)發(fā)病率在50/10萬左右，偶有暴發(fā)流行，病死率高達(dá)30%。該病在我國分布范圍廣、疫區(qū)類型復(fù)雜，是我國最嚴(yán)重的蟲媒傳染病之
O 漢坦病毒為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，其基因組由大(L)、中(M)和小(S)三個RNA片段組成，分別編碼依賴RNA的RNA多聚酶、包膜糖蛋白(Gl和G2)和核殼體蛋白。漢坦病毒基因組RNA的5’端和3’端的15 30個堿基互補(bǔ)，這些互補(bǔ)序列可以保持RNA的穩(wěn)定性，并可能在轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的過程中被RNA聚合酶識別，啟動合成新的RNA。11個堿基的最末端序列“TAGTAGTAGAC”為所有漢坦病毒所共有，是漢坦病毒的重要基因特征之一，是區(qū)分漢坦病毒和布尼亞病毒科其它病毒的重要依據(jù)。漢坦屬病毒和布尼亞病毒科其它病毒在血清學(xué)上沒有交叉反應(yīng)。目前流行性出血熱病毒抗體傳統(tǒng)的檢測方法是采用血清學(xué)診斷方法，包括間接酶免吸附試驗檢測EHF IgG抗體、膠體金法、免疫熒光試驗檢測雙份血清IgG抗體等，這些方法均在一定程度上易出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，給流行性出血熱的臨床診斷帶來一定干擾。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法，使之具有以下優(yōu)點(diǎn)一、應(yīng)用IgM捕獲ELISA法檢測EHF IgM抗體，以減少假陽性或假陰性現(xiàn)象對臨床診斷帶來的干擾，并且使該試劑盒能夠?qū)α餍行猿鲅獰徇M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，同時誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設(shè)備要求低；二、提高試劑盒的使用安全性；三、提高反應(yīng)板條的使用期限。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于所述盒體內(nèi)設(shè)有EHF酶標(biāo)板、封板膜、EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶；所述EHF酶標(biāo)板上設(shè)有五個以上包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應(yīng)孔；每IOOOml所述底物A溶液內(nèi)含有檸檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、檸檬酸7. 76g
11.64g、乙酸鈉 7. 13g 10. 70g、冰乙酸1. 52ml 2. 28ml、雙氧水 O. 8ml 1. 2ml ；每IOOOml所述底物B溶液內(nèi)含有無水乙醇520ml 780ml、乙二醇272ml 408ml、二甲基甲酰胺8ml 12ml、3, 3’，5, 5’ -四甲基聯(lián)苯胺O. 8g 1. 2g ;每IOOOml所述EHF陰性對照溶液內(nèi)含有氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12H202. 2g
3.4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g 0. 24g、鹿糖 40g 60g、疊氮化鈉 O. 08g
O.12g；所述EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g 36 μ g羊抗兔抗體配置而成；所述終止液是在900ml純水中加入80ml 120ml硫酸配置而成的。優(yōu)選的，所述EHF酶標(biāo)板上設(shè)有5 95個反應(yīng)孔。優(yōu)選的，所述EHF酶標(biāo)板包括板架和多個可拆卸安裝在所述板架上的反應(yīng)板條，所述反應(yīng)孔設(shè)置在所述反應(yīng)板條上。

優(yōu)選的，所述盒體內(nèi)部設(shè)有隔斷，使所述盒體內(nèi)部具有多個空腔。優(yōu)選的，所述盒體內(nèi)部設(shè)有一個橫向隔斷，使所述盒體分成一個上部用于容納所述EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶的空腔和一個底部用于容納所述EHF酶標(biāo)板的空腔。所述流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法(I) EHF酶標(biāo)板的制備1.1配制EHF包被液用碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液將抗人IgM單克隆抗體溶液稀釋成濃度為O. 8 μ g/ml、ΡΗ=9. 6的溶液；1. 2包被用步驟1.1制得的EHF包被液按100 μ I/孔進(jìn)行包被，并在2 8°C溫度下靜置40 50小時；1. 3洗滌液制備將含有O. 05%吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比I 40混合均勻，制得洗滌液；1. 4洗滌用洗滌液連續(xù)洗滌包被后的酶標(biāo)板2次，拍干；1. 5封閉向洗滌后的透明反應(yīng)孔內(nèi)按130μ I/孔加入封閉液，所述封閉液為每IOOOml純水溶液中含NaHC032 . 93g,Na2CO3L 59g、牛血清白蛋白10g，并在20 25°C條件下，封閉2. 8 3. 2小時；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護(hù)液將反應(yīng)孔密封，所述保護(hù)液組成為9. 5wt% 10. 5wt%小牛血清和89wt% 91wt%甘油，制得EHF酶標(biāo)板；(2) EHF酶結(jié)合物溶液的配制2.1將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液200 μ 1，在室溫18°C 25°C條件下混合均勻制備得到辣根過氧化物酶溶液；2. 2再將辣根過氧化物酶溶液加入PH4. 4的醋酸-冰乙酸緩沖液，在2°C 8°C條件下透析16 20小時；2. 3取EHF抗原加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析16 20小時；2. 4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3 3. 5小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻； 2. 5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫；2. 6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進(jìn)行檢測，收集試管內(nèi)的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內(nèi)產(chǎn)物，制得酶結(jié)合物初溶液；2. 7將6g 8g氯化鈉、140ml 160ml小牛血清和O. 8g 1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得酶結(jié)合物稀釋液；2. 8將酶結(jié)合物初溶液用酶結(jié)合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C 8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結(jié)合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG - HRP溶液，制得EHF酶結(jié)合物溶液；(3)底物A溶液的 配制先將朽1檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、梓檬酸7. 76g 11. 64g和乙酸鈉7. 13g 10. 70g用純水完全溶解，再加入1. 52ml 2. 28ml的冰乙酸和O. 8ml 1. 2ml的雙氧水，最后用純水定容至1000ml，制得底物A溶液；(4)底物B溶液的配制將0.95g 1.05g3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺溶解在IOml 二甲基甲酰胺中，再加入650ml無水乙醇和340ml乙二醇，混勻，制得底物B溶液；(5)終止液的配制向900ml純水中加入IOOml硫酸，混勻，制得終止液；(6) EHF陰性對照溶液的配制將氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12Η202· 2g 3. 4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀
0.16g 0. 24g和蔗糖40g 60g完全溶解在純水中，再加入O. 8g 1. 2g疊氮化鈉，用純水定容至1000ml，制得EHF陰性對照溶液；(7) EHF陽性對照溶液的配制向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g 36 μ g，制得EHF陽性對照溶液。所述流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟(I)樣品收集靜置待測血清30min，對所述待測血清進(jìn)行離心處理10 20分鐘，即可進(jìn)行檢測。(2)加樣檢測a.將在冷藏環(huán)境中貯藏的所述EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶平衡至室溫20°C 25°C ；b.將所述EHF酶標(biāo)板用生理鹽水洗3次；c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例稀釋待檢血清；d.將所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按100 μ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為樣品孔^EHF陽性對照溶液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陽性對照孔；取EHF陰性對照液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少兩個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陰性對照孔；e.將所述EHF酶標(biāo)板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng)29min 31min ；f.取出所述EHF酶標(biāo)板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入50 μ I酶結(jié)合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng)58min 62min ；g.取出所述EHF酶標(biāo)板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應(yīng)孔5次，每次間隔15秒 25秒,拍干；h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入50 μ I底物溶液A和30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置1(Γ30分鐘，揭下封板膜，觀察結(jié)果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結(jié)果；若需讀出準(zhǔn)確的檢測數(shù)值，在步驟g后，向所述空白孔、樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)再分別加入50 μ I終止液，混勻后，使用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。優(yōu)選的，如待測血清不能及時檢測，應(yīng)將待測血清在_20°C _15°C條件凍存。采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是由于本發(fā)明采用ELISA法IgM捕獲法檢測EHF IgM抗體，若待 測血清中含有流行性出血熱病毒，則流行性出血熱病毒IgM抗體即與EHF酶結(jié)合物、抗人-1gM單抗結(jié)合，并結(jié)合在微孔壁表面，通過底物作用顯色，用以特異性的檢測待測血清中的流行性出血熱IgM抗體，檢測出流行性出血熱病毒，與ELISA法間接法等其他方法相比，本發(fā)明靈敏度高、特異性強(qiáng)，實驗操作僅需一步即可出結(jié)果，因此，本發(fā)明不但減少了假陽性或假陰性現(xiàn)象對臨床診斷帶來的干擾，使該試劑盒能夠?qū)α餍行猿鲅獰徇M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，而且誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設(shè)備要求低；還由于本發(fā)明采用了所述酶標(biāo)板和各種溶液的配方，使得本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確程度是目前市場上其它出血熱檢測試劑所達(dá)不到的；本發(fā)明試劑盒陽性對照溶液為非傳染性EHF陽性血清，對實驗操作者安全；另外，本發(fā)明酶標(biāo)板反應(yīng)板條內(nèi)含有甘油，因而無需干燥儲存，也不會因其儲存過程中受潮而失效，大大提高了反應(yīng)板條儲存的有效期。


圖1為本發(fā)明實施例打開后俯視圖；圖2為本發(fā)明實施例內(nèi)部正視示意圖；圖3為本發(fā)明實施例酶標(biāo)板的示意圖；其中，1、盒體；2、EHF酶結(jié)合物溶液瓶；3、底物A溶液瓶；4、底物B溶液瓶；5、EHF陰性對照溶液瓶；6、EHF陽性對照溶液瓶；7、終止液溶液瓶；8、透明反應(yīng)孔；9、板架；10、反應(yīng)板條；11、橫向隔斷；12、縱向隔斷。
具體實施例實施例1一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒如圖1、圖2和圖3所示，本實施例試劑盒包括盒體1，盒體I內(nèi)設(shè)有EHF酶標(biāo)板(如圖3所示)、封板膜、EHF酶結(jié)合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF陰性對照溶液瓶5、EHF陽性對照溶液瓶6和終止液溶液瓶7 ；EHF酶標(biāo)板上設(shè)有多個包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應(yīng)孔8 ；每IOOOml底物A溶液內(nèi)含有檸檬酸三鈉5. 2g、檸檬酸9. 7g、乙酸鈉8. 92g、冰乙酸1.9ml、雙氧水 Iml ；每IOOOml底物B溶液內(nèi)含有無水乙醇650ml、乙二醇340ml、二甲基甲酰胺10ml、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(簡稱TMB) Ig ；每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內(nèi)含有氯化鈉 7g、Na2HP04 · 12H202. 8g、KH2P040. 2g、KCLO. 2g、蔗糖50g,疊氮化鈉O.1g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入30 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸IOOml配制而成的，所用硫酸為質(zhì)量百分比為98%的濃硫酸。EHF酶標(biāo)板上設(shè)有48個反應(yīng)孔。EHF酶標(biāo)板包括板架9和多個可拆卸安裝在板架9上的反應(yīng)板條10，透明反應(yīng)孔8設(shè)置在反應(yīng)板條10上。盒體I內(nèi)部設(shè)有一個橫向隔斷11，使盒體分成一個上部用于容納EHF酶結(jié)合物溶液瓶2、底物A溶液瓶3、底物B溶液瓶4、EHF陰性對照溶液瓶5、EHF陽性對照溶液瓶6和終止液溶液瓶7的空腔和一個底部用于容納板架9的空腔，橫向隔斷11為硬質(zhì)材料，盒體I上部空腔設(shè)有還一個縱向隔斷12，底物A溶液瓶3和底物B溶液瓶4放入其中的一個空腔，其他溶液瓶放置于另一個空腔。實施例2 一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒本實施例中每IOOOml底物A溶液內(nèi)含有檸檬酸三鈉4. 16g、檸檬酸7. 76g、乙酸鈉7. 13g、冰乙酸1. 52ml、雙氧水 O. 8ml ；每IOOOml底物B溶液內(nèi)含有無水乙醇520ml、乙二醇272ml、二甲基甲酰胺8ml、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺O. 8g；每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內(nèi)含有氯化鈉 6g、Na2HPO4 · 12H202. 2g、KH2PO4O. 16g、氯化鉀0. 16g、鹿糖40g,疊氮化鈉O. 08g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸80ml配制而成的，所用硫酸為質(zhì)量百分比為98%的濃硫酸；EHF酶標(biāo)板上設(shè)有5個反應(yīng)孔。其余同實施例1。實施例3一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒本實施例中每IOOOml底物A溶液內(nèi)含有檸檬酸三鈉6. 24g、檸檬酸11. 64g、乙酸鈉10. 70g、冰乙酸2. 28ml、雙氧水1. 2ml ；每1000ml底物B溶液內(nèi)含有無水乙醇780ml、乙二醇408ml、二甲基甲酰胺12ml、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺1. 2g;每IOOOmlEHF 陰性對照溶液內(nèi)含有氯化鈉 8g、Na2HPO4 · 12H203. 4g、KH2PO4O. 24g、氯化鉀0. 24g、蔗糖60g，疊氮化鈉O. 12g ；EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入36 μ g的羊抗兔抗體配制而成的；終止液是在900ml純水中加入硫酸120ml配制而成的，所用硫酸為質(zhì)量百分比為98%的濃硫酸。EHF酶標(biāo)板上設(shè)有95個反應(yīng)孔。其余同實施例1。實施例4流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法本實施例中微孔板中所包被的兔抗人-1gM單抗在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，采用的包被抗原濃度為O. 8 μ g/mL,本實施例中EHF酶標(biāo)板由板架和多個可拆卸安裝在板架上的反應(yīng)板條組成。制備如實施例1所述的流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具體制備步驟如下 (I) EHF反應(yīng)板條的制備1.1EHF包被液的配制用O. 05mol/L碳酸鹽緩沖液(配方0. 159g Na2C03+0 . 29 3gNa2HCO3定容至100ml)將3. 42mg/ml的兔抗人-1gM單抗溶液稀釋成O. 8 μ g/ml, PH=9. 6 ；1. 2包被量EHF反應(yīng)板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置2 8°C靜置、吸附48小時；1. 3洗滌液制備將含有O. 05% (體積含量)吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比1:40混合均勻，制得洗滌液。1. 4洗滌用洗滌液連續(xù)洗滌包被后的反應(yīng)板條2次，拍干。1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應(yīng)板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉3小時；封閉液組成配方為NaHC032. 93g+Na2C03l. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護(hù)液將反應(yīng)孔密封，所述保護(hù)液組成為10wt%小牛血清和90wt%甘油，制得EHF反應(yīng)板條；分別將上述處理后的板條裝入鋁箔袋，封口，2 8°C保存?zhèn)溆谩?2) EHF酶結(jié)合物的制備包括以下步驟2.1稱取辣根過氧化物酶倒入一棕色小玻璃瓶內(nèi)，取Iml雙蒸水溶解，用加樣器取200 μ I高碘酸鈉溶液，滴入盛辣根過氧化物酶的小瓶內(nèi)，將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液200 μ 1，在室溫18°C 25°C振蕩20min制備得到辣根過氧化物酶溶液；2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析18小時；2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析18小時；2. 4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻；2.5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫；2. 6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進(jìn)行檢測，收集試管內(nèi)的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內(nèi)產(chǎn)物，制得酶結(jié)合物初溶液。也可將收集的酶結(jié)合物加入等量甘油混勻(甘油能更好的穩(wěn)定酶結(jié)合物活性)，放置于-20°C冰箱保存。2. 7將7g氯化鈉、150ml小牛血清和1. Og疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結(jié)合物稀釋液；2. 8將酶結(jié)合物初溶液用酶結(jié)合物稀釋液按1:700稀釋，并在6°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結(jié)合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結(jié) 合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量檸檬酸三鈉5. 2g、檸檬酸9. 7g、乙酸鈉8. 92g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準(zhǔn)確量取冰乙酸1. 9ml、雙氧水Iml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(4)底物B的配制用電子天平準(zhǔn)確稱取TMBlg，倒入有色廣口瓶中；用移液器準(zhǔn)確量取二甲基甲酰胺10ml，加入有色廣口瓶中，輕搖使TMB混勻；用量筒準(zhǔn)確量取無水乙醇650ml、乙二醇340ml，倒入廣口瓶中，搖勻，定容至1000ml。(5)終止液的配制用量筒準(zhǔn)確量取所需的純水900ml，倒入廣口瓶中；再用量筒準(zhǔn)確量取濃硫酸(質(zhì)量百分比為98%以上)100ml，邊攪拌邊慢慢倒入廣口瓶中；扣上瓶蓋，輕搖廣口瓶，使液體混勻。(6) EHF陰性對照的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量NaCL7g、Na2HPO4 · 12H202. 8g,KH2PO4O. 2g、KCL0. 2g、蔗糖 50g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準(zhǔn)確稱量疊氮化鈉O. lg，力口入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7) EHF陽性對照的配制向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImLEHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體30 μ g,制得陽性對照溶液。實施例5流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法本實施例同實施例4，不同之處在于(I)EHF反應(yīng)板條的制備1. 2包被量EHF反應(yīng)板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置2 8°C靜置、吸附40小時；1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應(yīng)板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉2. 8小時；封閉液組成配方為NaHC032 . 93g+Na2C03l. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護(hù)液將反應(yīng)孔密封，所述保護(hù)液組成為9. 5wt%小牛血清和91wt%甘油，制得EHF反應(yīng)板條；(2) EHF酶結(jié)合物的制備包括以下步驟2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析16小時；2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析18小時；2. 7將6g氯化鈉、140ml小牛血清和O. 8g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結(jié)合物稀釋液；2. 8將酶結(jié)合物初溶 液用酶結(jié)合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結(jié)合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結(jié)合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量檸檬酸三鈉4. 16g、檸檬酸7. 76g、乙酸鈉7. 13g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準(zhǔn)確量取冰乙酸1. 52ml、雙氧水O. 8ml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(6)陰性對照的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量NaCL6g、Na2HPO4 · 12Η202· 2g、KH2PO4O. 16g、KCLO. 16g、蔗糖40g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準(zhǔn)確稱量疊氮化鈉
O.8g，加入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7)陽性對照的配制向步驟(6)制得的陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g，制得陽性對照溶液。實施例6流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒制備方法本實施例同實施例4，不同之處在于(I)EHF反應(yīng)板條的制備1. 2包被量EHF反應(yīng)板條均按100 μ I/孔包被，待全部包被完畢，置8°C靜置、吸附50小時；1. 5封閉分別將上述洗滌后的反應(yīng)板條加封閉液130 μ I/孔，室溫20 25°C封閉3. 2小時；封閉液組成配方為NaHC032. 93g+Na2C031. 59g+BSA10g，純水定容1000ml ；1. 6甩出孔中的封閉液，加入保護(hù)液將反應(yīng)孔密封，所述保護(hù)液組成為10. 5wt%小牛血清和89. 5wt%甘油，制得EHF反應(yīng)板條；(2) EHF酶結(jié)合物的制備包括以下步驟2. 2振蕩好的辣根過氧化物酶溶液取入透析袋，放入配制好的PH4. 4醋酸緩沖液中，4°C冰箱透析20小時；
2. 3取EHF抗原放入另一透析袋中，加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析20小時；2. 7將8g氯化鈉、160ml小牛血清和1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得
酶結(jié)合物稀釋液；2. 8將酶結(jié)合物初溶液用酶結(jié)合物稀釋液按1:700稀釋，并在8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結(jié)合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結(jié)合物溶液，裝入試劑瓶冷藏備用。(3)底物A的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量檸檬酸三鈉6. 24g、檸檬酸11. 64g、乙酸鈉10. 7g加入容量瓶中；先加適量純水，輕搖使之完全溶解；再用移液器準(zhǔn)確量取冰乙酸2. 28ml、雙氧水1. 2ml加入容量瓶中，輕搖混勻；以純水定容至1000ml。(6)陰性對照的配制用電子天平準(zhǔn)確稱量氯化鈉8g、Na2HP04 · 12H203. 4g、KH2P040. 24g、氯化鉀
0.24g、蔗糖60g，加入容量瓶；先加適量純水，輕搖使之溶解完全；再用電子天平準(zhǔn)確稱量疊氮化鈉1. 2g，加入容量瓶，攪拌使之完全溶解，輕搖混勻；以純水定容，混勻備用。(7)陽性對照的配制向步驟(6)制得的陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體36 μ g，制得陽性對照溶液。

實施例8流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒使用方法實施例1所述的流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法(I)樣品收集靜置待測血清30min，對所述待測血清進(jìn)行離心處理10 20分鐘,進(jìn)行檢測。(2)加樣檢測a.將在冷藏環(huán)境中貯藏的EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶等試劑平衡至室溫20°C 25°C ；b.將所述EHF酶標(biāo)板用生理鹽水洗3次；c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例分別稀釋待檢血清、陰性對照溶液和陽性對照溶液；d.將所述酶標(biāo)板上的一個反應(yīng)孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為樣品孔；取稀釋后的陽性對照溶液按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陽性對照孔；取稀釋后的待檢血清按ΙΟΟμ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的兩個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陰性對照孔；e.將所述EHF酶標(biāo)板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng)30min ；f.取出所述EHF酶標(biāo)板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入50 μ I酶結(jié)合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng)60min ；g.取出所述EHF酶標(biāo)板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應(yīng)孔5次，每次間隔20秒,拍干；
h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入50 μ I底物溶液Α，30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置20分鐘，揭下封板膜，觀察結(jié)果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結(jié)果；若需讀出準(zhǔn)確的檢測數(shù)值，在步驟f后，向樣品孔內(nèi)再加入50μ I終止液，混勻后，使用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果；(3)檢測結(jié)果分析在450nm波長下用空白孔調(diào)零讀取各孔的吸光度值，并按如下計算方法，得出檢測結(jié)果當(dāng)陰性對照孔的平均吸光度值小于O. 10時，臨界值為O. 10 ;當(dāng)陰性對照孔平均吸光度值大于O. 10時，臨界值=3 X陰性對照計算平均吸光度值；a.比色法若樣品孔吸光度值彡臨界值，檢測結(jié)果為陽性；若樣品孔吸光度值〈臨界值，檢測結(jié)果為陰性；b.比值法若樣品孔吸光度值/臨界值彡1，檢測結(jié)果為陽性；若樣品孔吸光度值/臨界值〈1，檢測結(jié)果為陰性；當(dāng)陰性對照孔平均吸光度值/臨界吸光度值〈O. 33，并且陽性對照孔平均吸光度值/臨界吸光度值> 6. O時，則檢測結(jié)果有效，否則應(yīng)當(dāng)重復(fù)試驗。本發(fā)明流行性出血熱酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的性能指標(biāo)測試(I)陰性參考品符合率用10份該試劑陰性參考品檢測，檢測結(jié)果全部成陰性。(2)陽性參考品符合率用10份該試劑陽性參考品檢測(包括強(qiáng)、中、弱)檢測，檢測結(jié)果全部成陽性。(3)精密性用I份精密性參考品做10個測試，CV值不高于10%。(4)臨床實驗結(jié)果用本試劑盒檢測已確診的臨床樣本1000例(其中EHF陽性50例)，檢測結(jié)果顯示，陰性符合率100%，陽性符合率100%，總符合率100%。檢測實例共檢測臨床血清樣本1000例(其中EHF陽性50例)，使用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，其特異性和敏感性均為100%。表I本發(fā)明EHF試劑盒檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果比較
權(quán)利要求
1.一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，包括盒體，其特征在于所述盒體內(nèi)設(shè)有EHF酶標(biāo)板、封板膜、EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶； 所述EHF酶標(biāo)板上設(shè)有五個以上的包被有固相抗人IgM單克隆抗體的透明反應(yīng)孔； 每IOOOml所述底物A溶液內(nèi)含有朽1檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、朽1檬酸7. 76g 11. 64g、乙酸鈉7. 13g 10. 70g、冰乙酸1. 52ml 2. 28ml、雙氧水O. 8ml 1. 2ml ； 每IOOOml所述底物B溶液內(nèi)含有無水乙醇520ml 780ml、乙二醇272ml 408ml、二甲基甲酰胺8ml 12ml、3, 3’，5, 5’ -四甲基聯(lián)苯胺O. 8g 1. 2g ; 每IOOOml所述EHF陰性對照溶液內(nèi)含有氯化鈉6g 8g、Na2HPO4 · 12H202. 2g 3. 4g、KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g 0. 24g、鹿糖 40g 60g、疊氮化鈉 0. 08g 0. 12g ；所述EHF陽性對照溶液是在每Iml所述EHF陰性對照溶液中加入24 μ g 36 μ g的羊抗兔抗體配制而成的； 所述終止液是在900ml純水中加入硫酸80ml 120ml配制而成的。
2.如權(quán)利要求1所述的一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述EHF酶標(biāo)板上設(shè)有5 95個反應(yīng)孔。
3.如權(quán)利要求1所述的一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述EHF酶標(biāo)板包括板架和多個可拆卸安裝在所述板架上的反應(yīng)板條，所述反應(yīng)孔設(shè)置在所述反應(yīng)板條上。
4.如權(quán)利要求1所述的一種流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述盒體內(nèi)部設(shè)有隔斷，使所述盒體內(nèi)部具有多個空腔。
5.如權(quán)利要求4所述的一種流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于所述盒體內(nèi)部設(shè)有一個橫向隔斷，使所述盒體分成一個上部用于容納所述EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶的空腔和一個底部用于容納所述EHF酶標(biāo)板的空腔。
6.權(quán)利要求1所述流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于 (I)EHF酶標(biāo)板的制備1.1配制EHF包被液用碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液將抗人IgM單克隆抗體溶液稀釋成濃度為O. 8 μ g/ml、ΡΗ=9· 5 9· 7的溶液；1.2包被用步驟1.1制得的EHF包被液按100 μ I/孔對所述透明反應(yīng)孔進(jìn)行包被，并在2 8°C溫度下靜置40 50小時；1.3洗滌液制備將含有O. 05%吐溫一 20、pH=7. 5的PBS溶液與蒸餾水按體積比1:40混合均勻，制得洗滌液；1.4洗滌用洗滌液連續(xù)洗滌包被后的酶標(biāo)板2次，拍干；1.5封閉向洗滌后的透明反應(yīng)孔內(nèi)按130μ I/孔加入封閉液，所述封閉液為每IOOOml純水溶液中含NaHC032. 93g、Na2CO3L 59g、牛血清白蛋白10g，并在20 25°C條件下，封閉·2. 8 3. 2小時；1.6甩出孔中的封閉液，加入保護(hù)液將反應(yīng)孔密封，所述保護(hù)液組成為9wt% llwt%小牛血清和89wt% 91wt%甘油，制得EHF酶標(biāo)板；(2)EHF酶結(jié)合物溶液的配制 · 2.1將5mg辣根過氧化物酶溶解在Iml雙蒸水中，再加入21. 4mg/ml的高碘酸鈉溶液·200 μ 1，在室溫18°C 25°C條件下混合均勻制備得到辣根過氧化物酶溶液； ·2. 2再將辣根過氧化物酶溶液加入PH4. 4的醋酸-冰乙酸緩沖液，在2°C 8°C條件下透析16 20小時； · 2.3取EHF抗原加入pH=9. 6、碳酸鈉含量為O. 05mol/L的碳酸鈉一碳酸氫鈉緩沖溶液，在4°C條件下透析16 20小時； · 2.4將透析后的辣根過氧化物酶溶液和EHF抗原溶液混勻，放入pH=9. 6、碳酸鈉含量為·O.05mol/L的碳酸鹽緩沖液中攪拌透析3 3. 5小時，再加入4mg/ml的硼氫化鈉溶液，加入量為50 μ 1/0. 5mg EHF抗原，并充分混勻； ·2.5使步驟2. 4得到的混合溶液通過葡聚糖凝膠G-200柱，同時用PH=7.1的PBS溶液洗脫； ·2.6用小試管依次分段接收流出物，用事先包被好的羊抗鼠板條進(jìn)行檢測，收集試管內(nèi)的羊抗鼠板條顯蘭色的試管內(nèi)產(chǎn)物，制得酶結(jié)合物初溶液； ·2.7將6g 8g氯化鈉、140ml 160ml小牛血清和O. 8g 1. 2g疊氮鈉溶解在IOOOml純水中，混勻制得酶結(jié)合物稀釋液； ·2.8將酶結(jié)合物初溶液用酶結(jié)合物稀釋液按1:700稀釋，并在2°C 8°C靜置24小時，再按兔抗羊IgG - HRP溶液與稀釋后的酶結(jié)合物初溶液體積比為1:5000加入兔抗羊IgG —HRP溶液，制得EHF酶結(jié)合物溶液； (3)底物A溶液的配制 先將檸檬酸三鈉4. 16g 6. 24g、檸檬酸7. 76g 11. 64g和乙酸鈉7. 13g 10. 70g用純水完全溶解，再加入1. 52ml 2. 28ml的冰乙酸和O. 8ml 1. 2ml的雙氧水，最后用純水定容至1000ml，制得底物A溶液； (4)底物B溶液的配制 將O. 95g 1.05g3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺溶解在IOml 二甲基甲酰胺中，再加入·650ml無水乙醇和340ml乙二醇，混勻，制得底物B溶液； (5)終止液的配制 向900ml純水中加入IOOml硫酸，混勻，制得終止液； (6)EHF陰性對照溶液的配制將氯化鈉 6g 8g,Na2HPO4 ·12Η202· 2g 3. 4g,KH2PO4O. 16g 0. 24g、氯化鉀 0. 16g ·0.24g和蔗糖40g 60g完全溶解在純水中，再加入O. 8g 1. 2g疊氮化鈉，用純水定容至·1000ml，制得EHF陰性對照溶液； (7)EHF陽性對照溶液的配制 向步驟(6)制得的EHF陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體，加入量為每ImL陰性對照溶液中加入羊抗兔抗體24 μ g 36 μ g，制得EHF陽性對照溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟 (I)樣品收集 靜置待測血清30min，對所述待測血清進(jìn)行離心處理10 20分鐘，即可進(jìn)行檢測；(2)加樣檢測 a.將在冷藏環(huán)境中貯藏的所述EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶平衡至室溫20°C 25°C ； b.將所述EHF酶標(biāo)板用生理鹽水洗3次； c.采用生理鹽水作為稀釋液，按照1:100的比例稀釋待檢血清； d.將所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔作為空白孔；取稀釋后的待檢血清按 οομI/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為樣品孔；取EHF陽性對照溶液按100 μ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少一個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陽性對照孔；取EHF陰性對照液按100 μ I/孔加入到所述酶標(biāo)板上的至少兩個反應(yīng)孔內(nèi)，作為陰性對照孔； e.將所述EHF酶標(biāo)板貼上封板膜，震蕩混勻，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng).29min 31min ； f.取出所述EHF酶標(biāo)板，揭下封板膜，向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入.50 μ I酶結(jié)合物溶液，混勻，貼上封板膜，置于36°C 38°C恒溫水浴中反應(yīng)58min 62min ； g.取出所述EHF酶標(biāo)板，并揭下封板膜，用生理鹽水洗滌各反應(yīng)孔5次，每次間隔15秒 25秒，拍干； h.依次向樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)各加入50μ I底物溶液A和30 μ I底物溶液B，混勻，貼上封板膜，室溫20°C 25°C避光放置1(Γ30分鐘，揭下封板膜，觀察結(jié)果若只判斷檢測樣的陰陽性，采用目測方法，分別對比樣品孔與陽性對照孔、陰性對照孔的顏色，即可得出檢測結(jié)果；若需讀出準(zhǔn)確的檢測數(shù)值，在步驟g后，向所述空白孔、樣品孔、陽性對照孔和陰性對照孔內(nèi)再分別加入50 μ I終止液，混勻后，使用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的流行性出血熱IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，如待測血清不能及時檢測，應(yīng)將待測血清在_20°C _15°C條件凍存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種流行性出血熱病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備和使用方法，包括盒體，所述盒體內(nèi)設(shè)有EHF酶標(biāo)板、封板膜、EHF酶結(jié)合物溶液瓶、底物A溶液瓶、底物B溶液瓶、EHF陰性對照溶液瓶、EHF陽性對照溶液瓶和終止液溶液瓶。本發(fā)明采用IgM捕獲ELISA法檢測EHF IgM抗體，以減少假陽性或假陰性現(xiàn)像對臨床診斷帶來的干擾，并且使該試劑盒能夠?qū)α餍行猿鲅獰徇M(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，同時誤差小、檢測靈敏度高、對檢測設(shè)備要求低。
文檔編號G01N33/577GK103063841SQ201210572128
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者楊致亭, 楊愛香, 王春光, 沈孝功, 劉發(fā)新, 劉海波, 邱香廷, 宋玉翠 申請人:濰坊市康華生物技術(shù)有限公司