本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗ibrv的單鏈抗體、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牛傳染性鼻氣管炎(infectiousbovinerhinotracheitis，ibr)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectiousbovinerhinotracheitisvirus，ibrv)的危害養(yǎng)牛業(yè)的重大傳染病，在國(guó)內(nèi)外的養(yǎng)牛場(chǎng)廣泛流行。ibrv為α皰疹病毒成員，能在牛的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞潛伏并導(dǎo)致持續(xù)性感染，以至于即使高效的疫苗也無(wú)法根除潛伏在牛體內(nèi)的病毒，因此只能利用抗病毒制劑來(lái)殺滅和清除細(xì)胞內(nèi)的病毒。目前普遍使用的抗皰疹病毒制劑包括化學(xué)藥物和生物制劑。化學(xué)藥物的毒副作用和藥物殘留不僅對(duì)動(dòng)物本身，而且對(duì)畜產(chǎn)品的安全有很大的危害。

在諸多治療性生物制劑里，抗體是最直接和有效的動(dòng)物疫病治療工具，然而傳統(tǒng)方法制備的抗體如康復(fù)動(dòng)物的血清、卵黃抗體以及單克隆抗體，由于其成分復(fù)雜以及異源動(dòng)物間的免疫排斥現(xiàn)象，已經(jīng)越來(lái)越不適合臨床實(shí)踐了。且其傳統(tǒng)方法制備的抗體用于檢測(cè)試劑的使用時(shí)，制備的檢測(cè)試劑靈敏度低，交叉反應(yīng)嚴(yán)重，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抗ibrv的單鏈抗體，其能特異性識(shí)別ibrv的gd蛋白單鏈抗體，具體在elisa中能特異性地結(jié)合ibrv，也能在western-blot中特異性結(jié)合大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物中的ibvgd蛋白，而且，在間接免疫熒光試驗(yàn)(ifa)中能夠識(shí)別感染在牛腎細(xì)胞mdbk中的ibrv；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備抗ibrv的單鏈抗體的制備方法，本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供抗ibrv的單鏈抗體的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案為：

一種抗ibrv的單鏈抗體，其為由seqidno.1所示重鏈可變區(qū)、seqidno.2所示輕鏈可變區(qū)及連接二者的連接肽組成的蛋白質(zhì)。

所述的連接肽是一段柔性氨基酸序列，合適的連接肽有助于重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)的形成，對(duì)單鏈抗體的表達(dá)量、穩(wěn)定性、可溶性、親和力、特異性以及聚集狀態(tài)等產(chǎn)生影響。在本發(fā)明中優(yōu)選地所述連接肽的序列如seqidno.3所示。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供編碼所述單鏈抗體的基因，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中所述基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供表達(dá)抗ibrv單鏈抗體的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有編碼所述單鏈抗體的基因，在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中所述基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供用于表達(dá)抗ibrv單鏈抗體的宿主，所述宿主上述的表達(dá)載體。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供一種用于制備如上所述單鏈抗體的制備方法，包括下述步驟：

a)用包含核苷酸分子的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述核苷酸分子編碼如上所述的單鏈抗體；

b)在容許所述單鏈抗體分子合成的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；并且

c)自培養(yǎng)物回收所述單鏈抗體分子。

本發(fā)明的另一方面，還提供了如上所述單鏈抗體在用于檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒中的應(yīng)用。用于檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒的應(yīng)用，包括所述單鏈抗體用于免疫學(xué)方法檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒。

優(yōu)選地，所述免疫學(xué)方法為elisa、western-blot或間接免疫熒光法。需要注意的是，如上所述的用于檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒的檢測(cè)方法是非診斷性檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一方面，還提供了如上所述單鏈抗體在用于制備檢測(cè)牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。

如上所述的應(yīng)用，所述檢測(cè)試劑包括elisa、western-blot或間接免疫熒光檢測(cè)試劑。

本發(fā)明的另一方面，還提供了如上所述單鏈抗體在制備用于治療牛傳染性鼻氣管炎治療劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供含有所述單鏈抗體的檢測(cè)試劑、含有所述單鏈抗體的治療制劑。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的單鏈抗體是抗牛傳染性鼻氣管炎病毒囊膜gd糖蛋白單鏈抗體，其是由抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈可變區(qū)通過(guò)一段連接肽連接而成的一種小分子基因工程抗體，其單鏈抗體的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后獲得分子約為30kd的蛋白，其能夠特異性識(shí)別ibrv的gd蛋白，不僅具備完整抗體與ibrv抗原特異性結(jié)合的特性，還具有易于構(gòu)建和大規(guī)模表達(dá)、分子量小、穿透力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提供的單鏈抗體能在elisa中特異性地結(jié)合ibrv，能在western-blot中特異性結(jié)合大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物中的ibvgd蛋白，在間接免疫熒光試驗(yàn)(ifa)中能夠識(shí)別感染在牛腎細(xì)胞mdbk中的ibrv，其能被his標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合，還具備有比抗ibrv的gd蛋白的單克隆抗體更優(yōu)的特性，其將在牛傳染性鼻氣管炎的檢測(cè)與治療制劑的研制中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例1中scfv-vh-vl基因的pcr擴(kuò)增電泳結(jié)果圖。

圖2為實(shí)施例1制備的scfv-vh-vl重組蛋白的蛋白電泳圖。

圖3為純化后的scfv-vh-vl重組蛋白的蛋白電泳圖。

圖4為單鏈抗體用于western-blot檢測(cè)gd蛋白的表達(dá)結(jié)果。

圖5為單鏈抗體用于ifa檢測(cè)mdbk中感染的ibr病毒的結(jié)果圖。

圖6為單鏈抗體用于抗原捕獲elisa檢測(cè)ibrv與單抗比較結(jié)果示意圖。

圖7為單鏈抗體用于elisa檢測(cè)不同病毒的特異性的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明經(jīng)過(guò)發(fā)明人大量的研究發(fā)現(xiàn)，牛傳染性鼻氣管炎病毒的gd糖蛋白位于ibrv囊膜及感染細(xì)胞的表面，是ibrv病毒表面的主要糖蛋白之一，在病毒吸附、侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，不僅能誘導(dǎo)體液免疫，還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，因此本發(fā)明在制備了抗gd的單克隆抗體的基礎(chǔ)上，利用rt-pcr從抗gd單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的rna中獲得單鏈抗體基因，然后利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備抗ibrv的單鏈抗體，并進(jìn)一步應(yīng)用試驗(yàn)鑒定了其生物學(xué)活性和價(jià)值。

具體地，采用rt-pcr方法，以自行設(shè)計(jì)的兼并引物，從分泌抗牛傳染性鼻氣管炎(bovineinfectiousrhinotracheitisvirus，ibrv)gd蛋白的雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出單鏈抗體重鏈可變區(qū)(vh)基因和輕鏈可變區(qū)(vl)基因，通過(guò)重疊延伸pcr及l(fā)inker序列即引入一段柔性肽連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)兩個(gè)片段，獲得完整的單鏈抗體基因，將該單鏈抗體基因克隆至pet-28a載體并將其轉(zhuǎn)化bl(de3)大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后獲得分子約為30kd的單鏈抗體蛋白。其中，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno.1：gsmevklqqsggglvqpgeslklscesnecefpsyniswvrktpgksldlvaaiksgyyvdtmerrfiisrdntkktlylqmsslrsedaalyycarrgiittigakgprspspq，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為seqidno.2：divmtqtplslsvslgdqasiscrssqsivhsngntyfewylqkpgqsprlliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycsqgslipftfgsgtkleikr，柔性肽即連接肽的氨基酸序列為seqidno.3：ggggsggggsggggs。通過(guò)westernblot分析了該單鏈抗體能特異性結(jié)合gd蛋白，運(yùn)用elisa檢測(cè)了該單鏈抗體能特異性的結(jié)合ibrv，并且通過(guò)ifa證明了該單鏈抗體與mdbk細(xì)胞中的ibrv也能發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明該重組的單鏈抗體蛋白分子具備了常規(guī)抗體的結(jié)合活性，并利用實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明由該單鏈抗體制備的檢測(cè)試劑具有檢測(cè)靈敏度高，無(wú)非特異性交叉反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1單鏈抗體vh-vl蛋白的制備

以往獲取單鏈抗體基因均是通過(guò)構(gòu)建單鏈看抗體噬菌體展示文庫(kù)，其費(fèi)力費(fèi)時(shí)，本發(fā)明是從分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取細(xì)胞總rna后，反轉(zhuǎn)錄cdna作為模板，采用pcr引物分別擴(kuò)增抗體的重鏈可變區(qū)(vh)及輕鏈可變區(qū)(vl)后，然后挑取了100個(gè)克隆子進(jìn)行了測(cè)序和比較，篩選出重復(fù)性最高的3-4個(gè)基因，采用連接肽將vh及vl進(jìn)行連接成為完整的scfv基因后，構(gòu)建于pet28a表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌制備重組的scfv蛋白。

具體操作如下：

其中，本實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料可采用如下來(lái)源的材料：抗gd單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞、mdbk細(xì)胞、pet-28a載體為北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所高技術(shù)研究室保存，plb-simple-vector載體購(gòu)自天根生化科技公司，top10感受態(tài)細(xì)胞、bl(de3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；rneasyminikit、qiaquickpcrpurificationkit、qiaprepspinminiprepkit、plasmidmaxikit及gelextractionkit均購(gòu)自qiangen公司，fastquantrtsupermixfastquantcdna第一鏈合成預(yù)混試劑、dnamarkerdl2000、dnamarkerdl15000、pcr相關(guān)試劑購(gòu)自天根生化科技公司，dpni酶、bseri酶、bamhⅰ酶、xhoⅰ酶購(gòu)自neb公司；鼠抗his單克隆抗體、羊抗鼠-igg-hrp購(gòu)自sigma公司。

1、重鏈可變區(qū)(vh)及輕鏈可變區(qū)(vl)基因的擴(kuò)增

按照rneasyminikit的操作步驟提取抗gd單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的總rna，gd單抗雜交瘤細(xì)胞cdna第一鏈的合成使用fastquantrtsupermixfastquantcdna第一鏈合成預(yù)混試劑，以cdna為模板pcr擴(kuò)增vh及vl基因，pcr反應(yīng)體系為：10×pfubuffer10μl，fp4μl，rp4μl，模板4μl，dntpmixture8μl，pfu聚合酶2μl，ddh2o補(bǔ)足至100μl。擴(kuò)增vl的pcr反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃5min。其中，擴(kuò)增vl時(shí)，擴(kuò)增體系的上游引物為vl-f，下游引物為vl-r1、vl-r2、vl-r3、vl-r4按照等比例混合后的兼并引物；擴(kuò)增時(shí)將vl-r1、vl-r2、vl-r3、vl-r4等量混合成vl-r-mix，再以vl-f及vl-r-mix為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增vh的pcr退火溫度為58℃，其余條件與vl的pcr一致，pcr產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中，擴(kuò)增vl的引物為vl-r、vl-f。擴(kuò)增所用引物的核苷酸序列見(jiàn)表1。

2、vh-linker-vl基因的獲取

pcr產(chǎn)物切膠回收后連接plb-simple-vector并轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌液pcr鑒定為陽(yáng)性的克隆子送往北京生工公司測(cè)序鑒定。提取測(cè)序鑒定正確的克隆子的質(zhì)粒。以陽(yáng)性vh、vl質(zhì)粒為模板，bamh1-vh-f、linker-vh-r、xho1-vl-r、linker-vl-f為引物通過(guò)重疊延伸pcr構(gòu)建vh-linker-vl基因，pcr產(chǎn)物切膠回收后連接plb-simple-vector轉(zhuǎn)化top10感受態(tài)細(xì)胞并提取陽(yáng)性質(zhì)粒，其所用引物的核苷酸序列見(jiàn)表1。

以gd單抗雜交瘤細(xì)胞的cdna為模板擴(kuò)增得到vh及vl基因，其中vh基因?yàn)?34bp，vl基因?yàn)?39bp，通過(guò)重疊延伸pcr將連接肽的基因，將vh及vl基因連接，得到vh-linker-vl基因也就是單鏈抗體(scfv)基因，即scfv-vh-vl基因，其片段大小為738bp，其核苷酸序列如seqidno.4所示，片段大小與預(yù)期一致，電泳結(jié)果如圖1所示，其中，圖1中m：dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：vh的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；2：vl的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；3：重疊延伸pcr構(gòu)建的scfv-vh-vl。scfv-vh-vl的基因序列編碼的氨基酸如seqidno.1、3、2序列所示。scfv-vh-vl的基因序列也可以通過(guò)序列合成的方式或其他方式獲得。

表1擴(kuò)增單鏈抗體基因的引物表

注：vh-r、vl-f為簡(jiǎn)并引物，r/s/m/w字母代表的為不同堿基的組合，其中r表示為a/g，k表示為g/t，s表示為g/c；m表示為a/c，w表示為a/t。

3、pet-28a-scfv表達(dá)載體的構(gòu)建

酶切pet-28a載體及plb-vh-linker-vl質(zhì)粒，酶切體系為：nebbuffer3.12μl，bamh1酶1μl，xho1酶1μl，質(zhì)粒6μl，ddh2o補(bǔ)足至20μl。37℃酶切3小時(shí)后膠回收pet-28a載體及vh-linker-vl基因并連接載體及目的片段，連接體系為：酶切回收的pet28a1.5μl，vh-linker-vl1μl，t4dnaligase1μl，t4dnaligasebuffer1μl，ddh2o補(bǔ)足至10μl，配好上述體系后于16℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌液pcr鑒定為陽(yáng)性的克隆子送往北京生工公司測(cè)序鑒定。

4、重組蛋白的表達(dá)

挑取測(cè)序鑒定為陽(yáng)性的bl21(de3)表達(dá)菌接種于lb液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再以1:100接種于lb液體培養(yǎng)基，當(dāng)od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入iptg誘導(dǎo)6h，同時(shí)對(duì)含pet28a質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，作陰性對(duì)照。

5、重組蛋白的鑒定

(1)取誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的菌液離心收集菌體沉淀，用pbs緩沖液(ph＝7.4)重懸，加入5×蛋白上樣buffer煮沸10min，進(jìn)行12％sds-page凝膠電泳。用考馬斯亮藍(lán)對(duì)sds聚丙烯酰胺凝膠染色30min，用脫色液脫色直至背景清楚，觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)pet28a空載體對(duì)照，其結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白大小約為30kd，與預(yù)期的大小一致。結(jié)果如圖2、圖3所示，在圖2中，m：預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pet28a空載體表達(dá)菌；2：scfv-vh-vl重組蛋白表達(dá)菌；3：pet28a空載體表達(dá)菌與抗his單克隆抗體結(jié)合；4：scfv-vh-vl重組蛋白表達(dá)菌與抗his單克隆抗體結(jié)合。

(2)進(jìn)行western-blot鑒定時(shí)，菌液樣品進(jìn)行12％sds-page凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至pvdf膜，用5％脫脂奶封閉以1:5000稀釋的鼠抗his單克隆抗體以及1:10000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg進(jìn)行免疫印跡，用ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。結(jié)果表面表達(dá)的重組蛋白能特異性和鼠抗his單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明其融合表達(dá)了6×his標(biāo)簽。

6、重組蛋白的純化

取大量誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的菌液離心收集菌體沉淀，用pbs緩沖液重懸，用超聲破碎儀超聲破碎后離心收集沉淀，用bindingbuffer溶液溶解沉淀并進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析，收集elutionbuffer洗脫液作為純化的重組單鏈抗體，進(jìn)行12％sds-page凝膠電泳。結(jié)果如圖3所示，說(shuō)明單鏈抗體蛋白大小約為30kd，其中，圖3中m：預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后的scfv-vh-vl重組蛋白。

實(shí)施例2單鏈抗體用于western-blot檢測(cè)gd蛋白的表達(dá)

利用實(shí)施例1中制備的單鏈抗體用于western-blot檢測(cè)ibrvgd蛋白，具體地，取表達(dá)gd蛋白的大腸桿菌細(xì)胞裂解液進(jìn)行sds-page電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至pvdf膜。用5％脫脂乳封閉后用純化hrp標(biāo)記的單鏈抗體進(jìn)行免疫印跡，ecl化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。并設(shè)表達(dá)pet28a空載體的大腸桿菌裂解液為對(duì)照。

其結(jié)果如圖4所示，說(shuō)明本發(fā)明制備的單鏈抗體可以特異性結(jié)合大腸桿菌表達(dá)的gd蛋白。其中，圖4中m：預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：表達(dá)pet32a空載體的大腸桿菌裂解液；2：表達(dá)gd蛋白的大腸桿菌細(xì)胞裂解液。

實(shí)施例3單鏈抗體用于ifa檢測(cè)mdbk中感染的ibr病毒

利用實(shí)施例1制備純化后的單鏈抗體用于間接免疫熒光試驗(yàn)(ifa)檢測(cè)mdbk細(xì)胞中的ibrv，具體地，用ibrv感染6孔細(xì)胞板中生長(zhǎng)在玻片上的mdbk細(xì)胞，待出現(xiàn)病變時(shí)用4％多聚甲醛固定細(xì)胞1h后，以0.1％tritonx-100透化2h，0.5％bsa于37℃封閉1h，以實(shí)施例1中純化的重組單鏈抗體作為一抗，以1:100稀釋的fitc標(biāo)記的鼠抗his單克隆抗體作為二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，并設(shè)置gd單克隆抗體結(jié)合感染mdbk細(xì)胞的ibrv對(duì)照。

結(jié)果如圖5所示，其中，圖中dapi為采用的藍(lán)色熒光染料：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，fitc為綠色熒光染料：異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,fitc)，merge為兩種染料的混合，wt表示為本底對(duì)照，不加任試劑，control表示為對(duì)照加入抗體的稀釋液，scfv2d1表示加scfv，gd-mcab表示加gd單克隆抗體，各圖中的短線段表示為比例尺為50μm。

結(jié)果表明，加scfv作為一抗進(jìn)行檢測(cè)的ibrv感染實(shí)驗(yàn)組有較為明顯的綠色熒光，并且在病變明顯區(qū)域綠色熒光也越強(qiáng)烈，而未加scfv的ibrv感染細(xì)胞對(duì)照組無(wú)明顯可見(jiàn)的綠色熒光，加gd單克隆抗體的ibrv感染細(xì)胞對(duì)照組出現(xiàn)較為淺淡的綠色熒光，結(jié)果顯示scfv能與ibrv發(fā)生特異性結(jié)合，并且等質(zhì)量的單鏈抗體結(jié)合病毒的能力強(qiáng)于gd單克隆抗體。

實(shí)施例4單鏈抗體用于抗原捕獲elisa檢測(cè)ibrv

利用實(shí)施例1制備純化后的單鏈抗體用于抗原捕獲elisa檢測(cè)ibrv，酶標(biāo)板過(guò)夜包被純化的ibrv，用3％bsa封閉后以hrp標(biāo)記的單鏈抗體為抗體進(jìn)行elisa檢測(cè)，用tmb顯色試劑盒顯色后用終止液終止，并讀取od450值，本實(shí)施例中設(shè)置gd單克隆抗體對(duì)照。

采用graphpad數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖6所示，其中，圖6中橫坐標(biāo)數(shù)值表示單克隆抗體及單鏈抗體進(jìn)行elisa時(shí)的包被量，單位為μg?？v坐標(biāo)表示陽(yáng)性值(postive)與陰性值(nagtive)的比值。elisa結(jié)果顯示本發(fā)明制備的單鏈抗體能特異性結(jié)合ibrv，等量的單鏈抗體與gd單克隆抗體相比，結(jié)合的ibrv的能力更強(qiáng)。

實(shí)施例5單鏈抗體用于elisa特異性結(jié)合ibrv

利用實(shí)施例1制備純化后的單鏈抗體用于elisa檢測(cè)結(jié)合ibrv的特異性，酶標(biāo)板過(guò)夜包被純化的傳染性鼻氣管炎病毒(ibrv)，牛病毒性腹瀉病毒(bvdv)、口蹄疫病毒(fmdv)及偽狂犬病毒(prv)，用3％bsa封閉后以hrp標(biāo)記的單鏈抗體為抗體進(jìn)行elisa檢測(cè)，用tmb顯色試劑盒顯色后用終止液終止，并讀取od450值。

采用graphpad數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖7所示。elisa結(jié)果顯示本發(fā)明制備的單鏈抗體能特異性結(jié)合ibrv，與牛的其他病原體及同科的動(dòng)物皰疹病毒均不結(jié)合(其中，圖7中“***”表示差異極顯著p<0.001)，表明單鏈抗體結(jié)合ibrv是特異性的。

由上面的實(shí)施例可知本發(fā)明制備的單鏈抗體的特點(diǎn)具有：容易獲取，分子量小，去除了抗體發(fā)揮診斷及治療無(wú)關(guān)的序列、結(jié)合活性比抗體更好、具有靶向性、可以和許多診斷與治療相關(guān)的分子連接制備靶向診斷及治療藥物，除此之外，制備成本價(jià)格低廉，可適用于牛相關(guān)傳染病的檢測(cè)與治療過(guò)程中檢測(cè)試劑制備的應(yīng)用。本發(fā)明獲得的單鏈抗體具有較好的結(jié)合ibrv的功能，且能特異性的識(shí)別感染細(xì)胞內(nèi)的ibrv病毒粒子，識(shí)別效果比與之對(duì)應(yīng)的單抗較好，這是其他診斷手段無(wú)法達(dá)到的。

sequencelisting

<110>北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120>一種抗ibrv的單鏈抗體、其制備方法及應(yīng)用

<130>

<160>15

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>115

<212>prt

<213>重鏈可變區(qū)(vh)

<400>1

glysermetgluvallysleuglnglnserglyglyglyleuvalgln

151015

proglygluserleulysleusercysgluserasnglucysgluphe

202530

prosertyrasnilesertrpvalarglysthrproglylysserleu

354045

aspleuvalalaalailelysserglytyrtyrvalaspthrmetglu

505560

argargpheileileserargaspasnthrlyslysthrleutyrleu

65707580

glnmetserserleuargsergluaspalaalaleutyrtyrcysala

859095

argargglyileilethrthrileglyalalysglyproargserpro

100105110

serprogln

115

<210>2

<211>113

<212>prt

<213>輕鏈可變區(qū)(vl)

<400>2

aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalserleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserilevalhisser

202530

asnglyasnthrtyrpheglutrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proargleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyrcysserglngly

859095

serleuileprophethrpheglyserglythrlysleugluilelys

100105110

arg

<210>3

<211>15

<212>prt

<213>連接肽

<400>3

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>4

<211>738

<212>dna

<213>scfv-vh-vl基因

<400>4

ggatccatggaggtcaaactgcagcagtctgggggaggcttagtgcagcctggagagtcc60

ctgaaactctcctgtgaatccaatgaatgcgaattcccttcctataacatatcttgggtc120

cgcaagactccggggaagagtctggacttggtcgcagccattaagagtggctactatgta180

gacaccatggagagacgattcatcatctccagagacaataccaagaagaccctgtatttg240

caaatgagcagtctgaggtctgaggacgctgccttgtattactgtgcaagacggggaata300

attacgactattggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaggtggaggcggttca360

ggcggaggtggctctggcggtggcggatcggatattgtgatgacccagactccactctcc420

ctgtctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcattgta480

cacagtaatggaaacacttatttcgaatggtacttgcagaagccaggccagtctccaagg540

ctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagt600

ggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtt660

tattactgctctcaaggttcacttattccattcacgttcggctcggggaccaagctggaa720

ataaaacggtagctcgag738

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

ccgtttgatttccagcttggtgcc24

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

ccgttttatttccagcttggtccc24

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

ccgttttatttccaactttgtccc24

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

ccgtttcagctccagcttggtccc24

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

gatrttktgatgacccarastccact26

<210>10

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

tgaggagacggtgaccgtggtcccttggcccc32

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

aggtsmarctgcagsagtcwgg22

<210>12

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

ggatccatggaggtcaaactgcagcagtctggg33

<210>13

<211>48

<212>dna

<213>人工合成

<400>13

acctccgcctgaaccgcctccaccttgaggagacggtgaccgtggtcc48

<210>14

<211>69

<212>dna

<213>人工合成

<400>14

ggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcggatattgtgatgacc60

cagactcca69

<210>15

<211>33

<212>dna

<213>人工合成

<400>15

ctcgagctaccgttttatttccagcttggtccc33