本發(fā)明涉及抗體技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及抗蛇毒抗體技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種抗平頦海蛇毒素抗體；此外，本發(fā)明還涉及該抗平頦海蛇毒素抗體的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
海蛇均為劇毒蛇，是最危險(xiǎn)的海洋生物之一，主要分布于澳大利亞北部至東南亞海域，全球范圍約50種，我國海域有19種，其分布北起遼寧、南至海南及廣西沿海，其中分布最廣、數(shù)量最多、咬傷發(fā)病率較高的海蛇為平頦海蛇(lapemiscurtus)和青環(huán)海蛇(hydrophiscyanocinctus)。平頦海蛇的毒性極強(qiáng)，比陸上最毒的蛇毒還要強(qiáng)得多。因其毒液是多種蛋白的混合物，冷凍干燥后的平頦海蛇毒中多肽占90％左右，其中包含酶、多肽毒素及小肽等，經(jīng)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析，平頦海蛇神經(jīng)毒素的短肽鏈由60－62個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈，有4個(gè)二硫鍵；長肽鏈由66－74個(gè)氨基酸殘基組成，一般有5個(gè)二硫鍵。它們高專一性結(jié)合乙酰膽堿受體，阻斷突觸傳遞，主要是阻斷膽堿能神經(jīng)肌肉接頭部位，引起麻痹，多以呼吸肌麻痹而導(dǎo)致窒息死亡?，F(xiàn)已證明，多種海蛇毒均有共同的抗原，現(xiàn)用免疫學(xué)方法，制備出抗蛇毒血清，如裂頦海蛇毒的抗毒素能中和7－8種海蛇毒素，還能中和多種陸地蛇毒如蝰、眼鏡蛇、眼鏡王蛇等的蛇毒。故平頦海蛇抗毒素血清，有廣泛使用價(jià)值，臨床上可用于治療毒蛇咬傷尤其是含有神經(jīng)毒素的毒蛇如金環(huán)蛇、銀環(huán)蛇等的咬傷。
平頦海蛇毒素毒性很強(qiáng)，其毒性相當(dāng)眼鏡蛇毒的50倍，是氰化鈉毒性的80倍，3.5毫克的平頦海蛇毒液就足以使一個(gè)成年人喪命。這僅僅是眼鏡蛇毒致死劑量的五分之一，而這種平頦海蛇的毒性在海蛇中還不是最毒的。據(jù)對(duì)120起被平頦海蛇咬傷的例子分析，平頦海蛇主要是當(dāng)漁民在提網(wǎng)、揀魚時(shí)，當(dāng)涉水或潛水作業(yè)時(shí)，被它所咬。所以，在人口密度大、平頦海蛇多的地方，特別是河口附近，水質(zhì)混濁的地方，平頦海蛇會(huì)對(duì)人構(gòu)成很大的威脅。泰國、越南和印度沿海地區(qū)就常有人被平頦海蛇咬傷或咬死。海蛇咬傷也是部隊(duì)濱海訓(xùn)練和未來重點(diǎn)作戰(zhàn)海域軍事行動(dòng)及海島居民面臨的重要醫(yī)療衛(wèi)生問題。如不及時(shí)處理，海蛇咬傷患者死亡率高達(dá)50％。因此，研制特效海蛇咬傷救治藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
免疫佐劑也稱佐劑或抗原佐劑，是一類單獨(dú)使用時(shí)一般無免疫原性，但是與抗原物質(zhì)合并使用時(shí)能增強(qiáng)抗原物質(zhì)免疫原性，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，或改變機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)類型的物質(zhì)。免疫佐劑的生物作用包括：抗原物質(zhì)混合佐劑注入機(jī)體后，改變了抗原的物理性狀，可使抗原物質(zhì)緩慢地釋放，延長了抗原的作用時(shí)間；佐劑吸附了抗原后，增加了抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細(xì)胞吞噬；佐劑能刺激吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的處理；佐劑可促進(jìn)淋巴細(xì)胞之間的接觸，增強(qiáng)輔助t細(xì)胞的作用；可刺激致敏淋巴細(xì)胞的分裂和漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體。故免疫佐劑的作用可使無免疫原性物質(zhì)變成有效的免疫原；可提高機(jī)體初次和再次免疫應(yīng)答的抗體滴變；改變抗體的產(chǎn)生類型以及產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，并使其增強(qiáng)。
細(xì)胞因子(cytokine,ck)是由細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱，細(xì)胞因子介導(dǎo)多種免疫細(xì)胞間的相互作用。天然的細(xì)胞因子由抗原、絲裂原或其他刺激物活化的細(xì)胞分泌；且多以單體形式存在；以非特異性方式發(fā)揮作用。參與免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)，如ifn-γ刺激apc表達(dá)mhc-ii；il-1輔助t細(xì)胞活化；il-2、4、5、6、gm-csf等促進(jìn)t、b細(xì)胞的增殖與分化；tnf-α、il-1、ifn-γ等激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)吞噬殺傷活性，tnf-αtnf-b具有細(xì)胞毒性并刺激中性粒細(xì)胞，ifn-γ抑制病毒復(fù)制。為了提高馬匹免疫后機(jī)體免疫水平，以增強(qiáng)馬的抵抗力，本申請(qǐng)發(fā)明人試用幾種不同馬細(xì)胞因子的佐劑，配合抗原免疫馬匹。發(fā)現(xiàn)含有g(shù)mcsf的佐劑可以明顯提高被免疫動(dòng)物的抗體滴度。
甲醛常用來滅活病毒制造疫苗，或者用于毒素滅活生產(chǎn)類毒素，是一種經(jīng)典的滅活方法。目前國內(nèi)蛇毒滅活方法是甲醛滅活法，此法系將毒素和甲醛混合或?qū)兹┩肝?-7天或更長時(shí)間進(jìn)行脫毒，導(dǎo)致高度交聯(lián)的蛇毒。這個(gè)脫毒反應(yīng)比較復(fù)雜，涉及賴氨酸與吲哚、苯環(huán)、胍、ε-nh2、酰胺等基團(tuán)交聯(lián)形成亞甲基橋。這種交聯(lián)橋的生成使得蛋白相互鏈接形成很大的復(fù)合物，同時(shí)，這種反應(yīng)是很難調(diào)控和重復(fù)，抗原的構(gòu)象因此而發(fā)生改變，部分抗原表位被屏蔽(visserj,chapmands.snakesandsnakebite.capetown,struik,1978)。滅活毒素不像天然毒素，失去了部分能產(chǎn)生中和作用抗體的表位。表現(xiàn)為免疫后抗體的滴度很高，但是僅有很小一部分抗體具有中和蛇毒活性(whoguidelinesfortheproduction,controlandregulationofsnakeantivenomimmunoglobulins.2008)。甲醛處理過的滅活蛇毒和抗蛇毒血清混合培育后，這些血清仍能中和蛇毒毒性，這從另外一個(gè)方面說明甲醛滅活抗原的構(gòu)象發(fā)生了重大的變化。平頦海蛇的神經(jīng)毒素分子量小，毒性大，免疫原性差，既不容易脫毒又很難免疫獲得高中和活性的抗體。同時(shí)，甲醛滅活是不完全的，有部分抗原的毒性位點(diǎn)未被消除，毒性沒有完全被去除。甲醛滅活蛇毒免疫動(dòng)物時(shí)反應(yīng)很大，注射后常出現(xiàn)顫抖，發(fā)熱，甚至出現(xiàn)神經(jīng)和血液系統(tǒng)的癥狀，而導(dǎo)致死亡。用甲醛滅活的蛇毒免疫馬等大型動(dòng)物，需要大劑量抗原才能產(chǎn)生可用于治療的抗毒素效價(jià)。這種方法使得動(dòng)物不能耐受，也成為我們抗毒素生產(chǎn)中一個(gè)瓶頸?？傊?，甲醛滅活蛇毒仍保留蛇毒的部分毒性、蛇毒抗原構(gòu)象改變、抗原性下降，導(dǎo)致動(dòng)物免疫時(shí)不能耐受，獲得的中和抗體效價(jià)低。本發(fā)明采用蛋白烷基化試劑碘乙酰胺烷基化平頦海蛇毒，這種方法滅活的蛇毒蛋白其構(gòu)象不發(fā)生明顯變化，保留著天然蛇毒的關(guān)鍵性抗原表位，免疫后可以產(chǎn)生高效價(jià)中和抗體。同時(shí)高保真的蛇毒的應(yīng)用，得以降低動(dòng)物免疫用的抗原用量，動(dòng)物的副反應(yīng)明顯降低，體質(zhì)獲得提高，免疫系統(tǒng)的功能可以正常發(fā)揮，比較迅速地產(chǎn)生高滴度的中和抗體。
who明確指出，傳統(tǒng)的草藥以及一般的藥物對(duì)平頦海蛇毒素?zé)o解毒作用，唯有特異的抗平頦海蛇血清才有治療效果，因此非常有必要研究抗平頦海蛇毒血清。平頦海蛇毒的毒性成分主要是小分子多肽，這些小肽的免疫原性比較弱，用常規(guī)的免疫方法不能獲得高效價(jià)的抗血清，為此亟需研發(fā)一種高效價(jià)的抗平頦海蛇血清。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)以上存在的問題與不足，提供一種效價(jià)高，能具有很好的中和平頦海蛇毒素的功能，能保護(hù)人和動(dòng)物平頦海蛇咬傷時(shí)免受平頦海蛇毒素傷害，特異性高，反應(yīng)靈敏，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用的抗平頦海蛇毒素抗體及其相關(guān)制備方法和應(yīng)用。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗平頦海蛇毒素抗體，其是采用平頦海蛇毒素經(jīng)滅活而成的平頦海蛇毒素抗原免疫馬匹產(chǎn)生的igg抗體。
較佳的，所述的平頦海蛇毒素依次經(jīng)苯甲基磺酰氟(pmsf)、乙二胺四乙酸(edta)和碘乙酰胺處理進(jìn)行滅活。
較佳的，所述平頦海蛇毒素經(jīng)滅活而成的平頦海蛇毒素抗原與重組馬gmcsf(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)混合后免疫馬匹，然后提取馬抗平頦海蛇毒免疫球蛋白f(ab’)2。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述的抗平頦海蛇毒素抗體的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：抗原制備：稱取平頦海蛇毒素，然后進(jìn)行滅活制得所述的平頦海蛇毒素抗原；
步驟二：免疫馬匹：將步驟一制得的所述的平頦海蛇毒素抗原免疫馬匹，收集所述馬匹的血漿；
步驟三：提取抗體：從步驟二制得的血漿中提取馬抗平頦海蛇毒免疫球蛋白f(ab’)2。
較佳的，在所述的步驟一中，所述的平頦海蛇毒素依次經(jīng)pmsf、edta和碘乙酰胺處理進(jìn)行滅活。
較佳的，在所述的步驟二中，用所述的平頦海蛇毒素抗原與重組馬gmcsf混勻后注射所述的馬匹，收集免疫馬匹的血漿。更佳的，所述的平頦海蛇毒素抗原與重組馬gmcsf佐劑等量混勻后注射所述的馬匹，使最終的滅活毒素的濃度為5毫克/毫升、重組馬gmcsf濃度為20微克/毫升，之后每隔10天加強(qiáng)免疫一次，共5次或6次，免疫50天或60天后采集免疫馬匹血漿。注射采用多點(diǎn)皮下注射法，一般選用4點(diǎn)。
較佳的，在所述的步驟三中，所述提取馬抗平頦海蛇毒免疫球蛋白f(ab’)2的方法包括如下步驟：步驟a.將所述的血漿和胃蛋白酶消化溶液用硫酸銨沉淀、壓濾后，將濾出液加硫酸銨二次沉淀，沉淀免疫球蛋白f(ab’)2。更具體地，步驟a.將血漿用注射用水稀釋(通常1-2倍體積)，充分?jǐn)嚢?ph可調(diào)整為2.8-3.6)，加胃蛋白酶消化，消化結(jié)束后加硫酸銨(例如25％飽和度)沉淀雜蛋白。壓濾除去沉淀后上清加硫酸銨(例如至50％飽和度)，沉淀免疫球蛋白f(ab’)2。
更佳的，在所述的步驟a后，還包括步驟b：將所述的免疫球蛋白f(ab’)2壓濾后，將沉淀溶于注射用水，用超濾膜(例如50kd超濾膜)超濾除去硫酸銨，并加入磷酸鈉緩沖液(例如ph7.0，20mm磷酸鈉)，經(jīng)(deae-sepharoseff)離子交換層析獲得精制免疫球蛋白f(ab’)2。
在本發(fā)明的第三方面，提供了上述的抗平頦海蛇毒素抗體在制備抗海蛇血清制劑中的應(yīng)用。。
較佳的，所述抗平頦海蛇毒素抗體為馬抗平頦海蛇毒免疫球蛋白f(ab’)2，其抗體效價(jià)為每毫升制品能中和至少20ld50平頦海蛇毒素，蛋白濃度不大于170克/升。
本發(fā)明有益效果在于：
1、本發(fā)明的抗平頦海蛇毒素抗體是采用平頦海蛇毒素經(jīng)滅活后免疫馬匹，此免疫方法獲得的抗體效價(jià)高，能具有很好的中和平頦海蛇毒素的功能。制成抗平頦海蛇毒素抗體制劑能保護(hù)人和動(dòng)物在平頦海蛇免受相應(yīng)蛇毒素的傷害，抗體特異性高，反應(yīng)靈敏，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹，其免疫馬匹獲得的血漿抗體效價(jià)明顯高于用甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑免疫馬匹來源的血漿，用其制備的抗平頦海蛇毒血清的效價(jià)比后者高1倍以上，達(dá)到了預(yù)料不到的技術(shù)效果。因此，本發(fā)明優(yōu)選重組馬gmcsf(粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子)佐劑結(jié)合新型碘乙酰胺抗原滅活方法制備平頦海蛇毒抗原佐劑混合注射劑對(duì)馬匹進(jìn)行免疫，獲得含有高效價(jià)抗體的馬血漿并以此為原料制備抗平頦海蛇血清。
2、上述制備方法流程簡單，十分具有實(shí)用性，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實(shí)施例9中不同濃度的碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素加重組馬gmcsf佐劑免疫馬匹得到的海蛇抗毒血清對(duì)抗5ld50的小鼠生存曲線圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方法作進(jìn)一步說明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
實(shí)施例1碘乙酰胺法滅活平頦海蛇毒素：
平頦海蛇毒素凍干粉用ph7.020mmtris緩沖液溶解成20毫克/毫升濃度，加入pmsf(苯甲基磺酰氟)至其終濃度為0.8-1.2mm，蛋白濃度為20毫克/毫升；攪拌后加入edta(乙二胺四乙酸溶液)至其濃度為0.8-1.5mm，調(diào)節(jié)蛋白濃度至1毫克/毫升，取100毫升蛇毒蛋白溶液加900毫升50mmph7.8tris緩沖液，離心4000rpm30分鐘，除去沉淀顆粒物質(zhì)，上清緩緩倒入3000毫升含碘乙酰胺溶液(50mmtris，1.33mmedta，2.67mnacl，2.67m尿素，266.7mm碘乙酰胺ph8.0)，充分混勻，使其中的碘乙酰胺濃度為100-200mm范圍內(nèi)，置37℃水浴箱避光反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用分子量截留值10kd的millipore板式超濾器超過濾，同時(shí)更換緩沖為ph7.0，50mmtris，0.15m氯化鈉緩沖液，將最終蛋白濃度濃縮到20毫克/毫升，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2甲醛滅活平頦海蛇毒素：
平頦海蛇毒素凍干粉用ph7.020mmtris緩沖液溶解成20毫克/毫升濃度，離心4000rpm30分鐘，除去沉淀顆粒物質(zhì)，加入0.3-0.6％甲醛(v/v)，37℃保溫2周后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例3重組馬gmcsf制備
根據(jù)中國發(fā)明專利申請(qǐng)cn201110090267.0所述，用基因工程的方法，在大腸桿菌中表達(dá)，獲得的包涵體經(jīng)變性、復(fù)性、層析、透析等方法制備而成，用此方法得到的重組馬gmcsf的純度大于95％，蛋白濃度在0.01-50毫克/毫升范圍，比活性等于或大于4x106unit/mg。
實(shí)施例4碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素加入重組馬gmcsf佐劑免疫健康馬匹：
用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素(實(shí)施例1制得)與重組馬gmcsf佐劑等量混合，使最終的滅活毒素的濃度為5毫克/毫升、重組馬gmcsf濃度為20微克/毫升，每匹馬每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天強(qiáng)化注射一次，共5次；第5次免疫10天后采集血漿。共5匹馬免疫碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf佐劑配制而成的抗原，馬號(hào)分別為1、2、3、4、5。
實(shí)施例5甲醛滅活平頦海蛇毒素加福氏不完全佐劑免疫健康馬匹：
用滅活平頦海蛇毒素(實(shí)施例2制得)與福氏不完全佐劑等量混合，使最終的滅活毒素的濃度為5毫克/毫升，每匹馬每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天強(qiáng)化注射一次，共5次；第5次免疫10天后采集血漿。共5匹馬免疫甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑配制而成的抗原，馬號(hào)分別為11、12、13、14、15。
實(shí)施例6碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素加福氏不完全佐劑免疫健康馬匹：
用滅活平頦海蛇毒素(實(shí)施例1制得)與福氏不完全佐劑等量混合，使最終的滅活毒素的濃度為5毫克/毫升，每匹馬每次注射1毫升，在第一次注射后，每隔10天強(qiáng)化注射一次，共5次；第5次免疫10天后采集血漿。共5匹馬免疫碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑配制而成的抗原，馬號(hào)分別為21、22、23、24、25。
實(shí)施例7馬抗平頦海蛇毒血清e(cuò)lisa效價(jià)測定：
于每次免疫后10天經(jīng)頸靜脈取血1毫升，分離血清，采用間接elisa法測定血清中的抗體效價(jià)。用ph9.6，50mm碳酸鈉緩沖液稀釋天然平頦海蛇毒素到1μg/ml的濃度，取96孔酶標(biāo)板(nunc-maxisorb)，每孔加200微升稀釋的平頦海蛇蛇毒，37℃孵育2小時(shí)，傾去稀釋的蛇毒，然后加200微升5％脫脂奶粉(溶于pbs-tween20(m-pbst))37℃封閉1小時(shí)。馬血清用m-pbst稀釋1024倍，后加到包被有蛇毒的孔內(nèi)37℃孵育60分鐘，充分洗滌后加入1:5000稀釋的hrp標(biāo)記抗馬igg(sigma)，孵育60分鐘后充分洗滌，顯色，酶標(biāo)儀上讀數(shù)。
下表1為馬抗平頦海蛇毒血清e(cuò)lisa檢測效價(jià)結(jié)果：免疫馬匹在免疫第10、20、30、40、50天分別采血，分離血清，檢測抗體效價(jià)，(血清1024倍稀釋)檢測的結(jié)果為od495讀數(shù)。
表1馬抗平頦海蛇毒血清e(cuò)lisa檢測效價(jià)結(jié)果
實(shí)施例8分離提取用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹來源的血漿中的免疫球蛋白f(ab’)2:
馬號(hào)1、2、3、4、5的馬匹在第五次免疫后的第十天和第十二天，每匹馬各采取3000毫升血漿，混合后加注射用水90升，調(diào)節(jié)ph至3.5，加胃蛋白酶150克，30℃消化90分鐘后加硫酸銨180公斤，溫度升至57-58℃，攪拌30分鐘，壓濾取濾過液，按每升濾過液加200克硫酸銨的比例加入硫酸銨，充分?jǐn)嚢韬髩簽V取沉淀。沉淀加60升注射用水，超過濾除去硫酸銨并濃縮至15升并進(jìn)行超濾置換緩沖液，所置換的緩沖液為ph7.0磷酸鈉緩沖液，超濾后的液體過q-sepharoseff凝膠，大部分雜蛋白與q-sepharoseff凝膠結(jié)合，igg抗體流穿后，收集流穿液，繼而過事先用ph7.0，20mm磷酸鈉緩沖液平衡過的sp-sepharoseff離子交換凝膠層析柱，上樣完畢后，凝膠柱用含50mm氯化鈉的ph7.0，20mm磷酸鈉緩沖液洗滌，然后用含250mm氯化鈉的ph7.0，20mm磷酸鈉緩沖液洗脫，洗脫液精制igg抗體。
實(shí)施例9分離提取用甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑免疫馬匹來源的血漿中的免疫球蛋白f(ab’)2:
馬號(hào)11、12、13、14、15的馬匹在第五次免疫后的第十天和第十二天，每匹馬各采取3000毫升血漿，純化方法同實(shí)施例8。
實(shí)施例10平頦海蛇毒毒性試驗(yàn)(ld50)
1)平頦海蛇蛇毒ld50初步確定實(shí)驗(yàn)：
(1)平頦海蛇毒素：用稀釋液溶解配制為0.5mg/ml(作為母液)
稀釋液：硼酸鹽緩沖液
氯化鈉8.5g
硼酸4.5g
硼砂0.5g
加蒸餾水至1000ml,過濾，調(diào)ph值為7～7.4滅菌后使用。
(2)毒力初步測定：選擇體重18－20克小鼠進(jìn)行蛇毒毒力初步確定試驗(yàn)。用生理鹽水稀釋平頦海蛇毒至不同的濃度，每個(gè)濃度取0.5毫升腹腔注射一只小鼠，注射48小時(shí)觀測小鼠的成活狀況。根據(jù)預(yù)初試驗(yàn)的結(jié)果，初步推斷出蛇毒致死的劑量。毒素最小劑量定為0.5μg/g，小鼠存活，最大劑量為2μg/g小鼠死亡。
2)平頦海蛇蛇毒ld50試驗(yàn)：
(1)動(dòng)物分組：昆明小鼠分10組，每組6只，空白對(duì)照組2只，共62只。體重20克。
毒素梯度稀釋，注射小鼠
(2)每只小鼠注射量：200μl/只，每組配制10只小鼠的注射量
(3)通過改良寇氏法計(jì)算平頦海蛇毒素ld50，劑量必須按等比級(jí)數(shù)分組，而且最小劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為0％，最大劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為100％，經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)摸索，毒素最小劑量定為0.5μg/g，最大劑量為2μg/g，總共十組，組間等比倍數(shù)為1.17，因此每組小鼠的毒素注射劑量如下表2：
表2小鼠ld50測定試驗(yàn)
觀察各組小鼠的死亡情況
3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
改良寇氏法計(jì)算公式：ld50＝lg-1[xm-i(∑p-0.5)]
本次實(shí)驗(yàn)中：dm(最大劑量)為2μg/g，r(組間倍數(shù))為1.17，xm為lgdm；i為lgr；p為各組陽性反應(yīng)(死亡)發(fā)生率，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算毒素ld50為1μg/g，即1μg/g劑量的平頦海蛇毒素能使半數(shù)小鼠死亡。
實(shí)施例11用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹來源的血漿制備的抗平頦海蛇毒血清中度有效劑量試驗(yàn)(themediumeffectivedose，ed50)試驗(yàn)：
抗平頦海蛇毒血清e(cuò)d50范圍初步測定試驗(yàn)：
抗平頦海蛇毒血清效價(jià)測定按國際通用的中和試驗(yàn)法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，其方法是把抗原和特異性igg抗體作用一定時(shí)間后，再給動(dòng)物注射，借助動(dòng)物體的反應(yīng)情況來判定igg的效價(jià)。本發(fā)明所用的動(dòng)物試驗(yàn)方法是以動(dòng)物死亡為反應(yīng)指征，以小白鼠注射抗蛇毒igg與蛇毒混合液后，動(dòng)物的生存死亡情況，確定igg的效價(jià)。
為了確定igg的中和劑量范圍，5ld50劑量的平頦海蛇蛇毒與不同濃度的igg混合成1毫升體積后在37℃水浴箱中放置1小時(shí)，取0.4毫升這種混合液體注射到小鼠的腹腔內(nèi)，每個(gè)濃度注射一只小鼠，觀測小鼠在48小時(shí)內(nèi)存活狀態(tài)。通過這種預(yù)初試驗(yàn)獲得小鼠100％存活和100％死亡所用的igg的濃度范圍。
根據(jù)igged50范圍初步測定試驗(yàn)獲得的小鼠100％存活和100％死亡所用的igg的濃度，將ed50所用的igg濃度在這個(gè)范圍進(jìn)行分組，每組試驗(yàn)的小鼠為6只，體重在20克。免疫igg效價(jià)的測定采用固定蛇毒劑量、改變igg劑量的方法，即取0.5毫升濃度蛇毒溶液(蛇毒以ld50或mg為單位)加入0.5毫升含不同濃度的igg，混合后置37℃1小時(shí)，取0.4毫升注射小白鼠腹腔內(nèi)作中和反應(yīng)測定之，以含igg最低濃度量動(dòng)物不死亡為中和終點(diǎn)，計(jì)算1毫升igg中和蛇毒量。
1.實(shí)驗(yàn)方法
前期準(zhǔn)備
1)平頦海蛇毒素：用稀釋液溶解配制為0.5mg/ml。
稀釋液：硼酸鹽緩沖液
氯化鈉8.5g
硼酸4.5g
硼砂0.5g
加蒸餾水至1000ml,過濾，調(diào)ph值為7～7.4滅菌后使用。
2)抗海蛇毒素血清準(zhǔn)備：
抗海蛇血清原液10毫升，檢測蛋白濃度為81mg/ml。
3)動(dòng)物分組：昆明小鼠分10組，每組6只，對(duì)照組(純毒素組)2只，共62只。體重20克。
注：本次抗毒血清e(cuò)d50測定是針對(duì)于平頦海蛇毒素5ld50(0.1mg/只)而進(jìn)行，即能使半數(shù)注射過5ld50毒素量的小鼠存活的抗毒血清量。
樣品混合、注射小鼠
1)每只小鼠注射量：400μl/只
2)每組配制10只小鼠的注射量
3)毒素與抗血清在37℃孵育45分鐘
4)通過改良寇氏法計(jì)算ed50，劑量必須按等比級(jí)數(shù)分組，而且最小劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為0％，最大劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為100％，經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)摸索，最小劑量定為0.05mg/g，最大劑量為0.405mg/g，總共十組，組間等比倍數(shù)為1.26，因此每組小鼠的注射劑量如下表3：
表3馬抗海蛇毒血清e(cuò)d50測定試驗(yàn)
觀察小鼠24～48小時(shí)，詳細(xì)記錄發(fā)病和死亡情況。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1)小鼠發(fā)病和死亡情況
第一組死亡6只，存活率0％
第二組死亡6只，存活率0％
第三組死亡6只，存活率0％
第四組死亡6只，存活率0％
第五組死亡6只，存活率0％
第六組死亡6只，存活率0％
第七組死亡5只，存活率16.7％
第八組到第十組全部存活，存活率100％
對(duì)照組(純毒素組)全部死亡，具體死亡時(shí)間在圖1中有詳細(xì)記錄，詳見圖1。
2)改良寇氏法計(jì)算ed50
計(jì)算公式：ed50＝lg-1[xm-i(∑p-0.5)]
本次實(shí)驗(yàn)中：dm(最大劑量)為0.405mg/g，r(組間倍數(shù))為1.26，xm為lgdm；i為lgr；p為各組陽性反應(yīng)(存活)發(fā)生率，根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算ed50為0.215mg/g，即0.215mg/g劑量的海蛇抗毒血清能使半數(shù)注射過5ld50毒素的小鼠存活。
3)海蛇抗毒血清中和平頦海蛇毒素劑量
根據(jù)實(shí)驗(yàn)可知，0.2ml濃度為25.5mg/ml的血清即能對(duì)抗0.1mg毒素，所以應(yīng)用本發(fā)明所獲得的1毫升蛋白濃度為81mg/ml的igg能中和1.6mg的平頦海蛇毒素。
實(shí)施例12用甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑免疫馬匹來源的血漿制備的抗平頦海蛇毒血清中度有效劑量試驗(yàn)(themediumeffectivedose，ed50)試驗(yàn)：
1.實(shí)驗(yàn)方法
前期準(zhǔn)備
1)平頦海蛇毒素：用稀釋液溶解配制為0.5mg/ml
稀釋液：硼酸鹽緩沖液
氯化鈉8.5g
硼酸4.5g
硼砂0.5g
加蒸餾水至1000ml,過濾，調(diào)ph值為7～7.4滅菌后使用。
2)抗海蛇毒素血清準(zhǔn)備：
抗海蛇血清原液10毫升，檢測蛋白濃度為80mg/ml
3)動(dòng)物分組：昆明小鼠分6組，每組6只，對(duì)照組(純毒素組)2只，共38只。體重20克。
注：本次抗毒血清e(cuò)d50測定是針對(duì)于平頦海蛇毒素5ld50(0.1mg/只)而進(jìn)行，即能使半數(shù)注射過5ld50毒素量的小鼠存活的抗毒血清量。
樣品混合、注射小鼠
1)每只小鼠注射量：400ul/只
2)每組配制6只小鼠的注射量
3)毒素與抗血清在37℃孵育45分鐘。
4)通過改良寇氏法計(jì)算ed50，劑量必須按等比級(jí)數(shù)分組，而且最小劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為0％，最大劑量組的陽性反應(yīng)率應(yīng)為100％，經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)摸索，最小劑量定為0.2mg/g，最大劑量為0.792mg/g，總共六組，組間等比倍數(shù)為1.32，因此每組小鼠的注射劑量如下：
觀察小鼠24～48小時(shí)，詳細(xì)記錄發(fā)病和死亡情況。
表4
觀察小鼠24～48小時(shí)，詳細(xì)記錄發(fā)病和死亡情況。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1)小鼠發(fā)病和死亡情況
第一組死亡6只，存活率0％
第二組死亡5只，存活率16.7％
第三組死亡4只，存活率33.3％
第四組死亡4只，存活率33.3％
第五組死亡2只，存活率66.7％
第六組死亡0只，存活率100％
對(duì)照組(純毒素組)全部死亡。
2)改良寇氏法計(jì)算ed50
計(jì)算公式：ed50＝lg-1[xm-i(∑p-0.5)]
本次實(shí)驗(yàn)中：dm(最大劑量)為0.792mg/g，r(組間倍數(shù))為1.32，xm為lgdm；i為lgr；p為各組陽性反應(yīng)(存活)發(fā)生率，根據(jù)以上數(shù)據(jù)計(jì)算ed50為0.46mg/g，即0.46mg/g劑量的海蛇抗毒血清能使半數(shù)注射過5ld50毒素的小鼠存活。
實(shí)施例13抗海蛇血清制劑原液制備
通過sp-sepharoseff離子交換層析用250mm氯化鈉洗脫抗海蛇毒血清用10kd超濾膜超濾，置換緩沖液為150mm氯化鈉，20mm磷酸鈉，ph6.0～7.0，同時(shí)濃縮至蛋白濃度80-170克/升。測定抗血清的ed50，并用ph6.5pbs(20mm磷酸鈉，150mm氯化鈉溶液)稀釋至每毫升抗血清能中和20～30ld50海蛇毒，加入間甲酚使其最終濃度為0.2％(v/v)，分裝成5毫升/支。
該抗血清制劑原液包含有以下組分：
1、精制特異性抗平頦海蛇毒素免疫球蛋白f(ab’)2，其抗體效價(jià)為每毫升制品能中和至少20ld50(小鼠)平頦海蛇毒素；蛋白濃度不大于170克/升；
2、0.15m氯化鈉-滲透壓保持劑；
3、0.2％間甲酚-防腐劑；
4、蒸餾水；
5、20mm磷酸鈉-ph穩(wěn)定劑。
本發(fā)明實(shí)施例所獲得用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹來源的血漿制備的抗平頦海蛇毒血清和用甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑免疫馬匹來源的血漿制備的抗平頦海蛇毒血清均能有效地中和海蛇毒素，但是用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹，其免疫馬匹獲得的血漿抗體效價(jià)明顯高于用甲醛滅活平頦海蛇毒素與福氏不完全佐劑免疫馬匹來源的血漿，用其制備的抗平頦海蛇毒血清的效價(jià)比后者高1倍以上，達(dá)到了預(yù)料不到的技術(shù)效果。因此用碘乙酰胺滅活平頦海蛇毒素與重組馬gmcsf免疫馬匹更具實(shí)用價(jià)值，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法過程簡單，本制品特異性高，能保護(hù)人和動(dòng)物在平頦海蛇咬傷時(shí)免受海蛇毒素的傷害，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。