本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一個番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的克隆及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

番茄是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟、園藝作物。在其生長過程中，由各種病原物引起的植物病害，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量，造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年來，晚疫病成為最嚴(yán)重的番茄病害之一，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展造成了重大損失。雖然化學(xué)農(nóng)藥對晚疫病的發(fā)生和蔓延有一定的控制作用，但由此引發(fā)的環(huán)境污染，病原菌抗藥性等問題，依舊給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了極大的困擾，因此，研究番茄抗病的分子機制，用生物學(xué)方法提高番茄對晚疫病的抗性成為了關(guān)鍵問題。

在自然界中，包括番茄在內(nèi)的植物經(jīng)常遭受各種病原菌的入侵，嚴(yán)重影響它們的生長發(fā)育。為了抵御這些病原菌，植物進化出了一系列的免疫機制。當(dāng)病原菌入侵植物時，其保守分子被植物的胞外跨膜受體所識別，激活病原物相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫(pti)。盡管pti成功抵御了大部分病原菌的入侵，少數(shù)病原菌進化出了相應(yīng)的效應(yīng)因子來突破pti防線。植物中抗性基因(r基因)所編碼的抗性蛋白(r蛋白)可以識別這些效應(yīng)因子，從而激活高效的免疫反應(yīng)，效應(yīng)子觸發(fā)免疫(eti)。

nbs-lrr基因是植物基因組中一類高度保守且豐富的r基因。其編碼的nbs-lrr蛋白可以識別病原物的效應(yīng)因子avr蛋白進而引起過敏反應(yīng)(hr)。hr反應(yīng)可以導(dǎo)致初始侵染部位的植物細胞程序性死亡抑制病原菌的生長。目前，研究者們已經(jīng)從多種植物中克隆得到了大量nbs-lrr基因并對其在植物免疫中的功能進行了探究。如從抗性辣椒品系hda149中得到的carknr基因，對其進行沉默后辣椒對于線蟲的抗性明顯下降。小麥pm3b基因可為其提供白粉病的小種特異抗性。在水稻中，pi64可以提高其對稻瘟病菌的抵抗能力，另一個基因osrp1l1可以提高其對于白葉枯病的抗性。同時絲瓜中的nbs-lrr基因與葉卷曲和花葉病抗性有關(guān)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于一種克隆番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的方法，并提供該基因在番茄抗晚疫病中的應(yīng)用方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一個番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr，其序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了上述番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的克隆方法，以野生型抗晚疫病番茄l3708的cdna為模板，以spnbs-lrr-fp、spnbs-lrr-rp為特異性引物，進行pcr擴增；所述特異性引物的序列分別如seqidno.2、seqidno.3所示；

克隆所用特異性引物具體為如下：

spnbs-lrr-fp：cgggatccatgtgtgtgggaagagttacagatt，

spnbs-lrr-rp：cgagctcttactctagtctttcaagtttgggg；

將得到的pcr產(chǎn)物與pmd-19t克隆載體連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α并涂布在含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行測序。測序結(jié)果如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的應(yīng)用方法，用于培育抗晚疫病番茄植株。

具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

將含有番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的重組表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101并涂布在含有卡那霉素、鏈霉素及利福平的yeb固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行菌液pcr驗證；選取陽性工程菌侵染預(yù)培養(yǎng)后的番茄子葉，共培養(yǎng)，分化出芽；將抗性芽移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根后移栽，實時定量pcr驗證過表達植株；對過表達spnbs-lrr的番茄苗進行抗病性檢測，得到抗晚疫病番茄植株。

本發(fā)明目的植物為雙子葉植物番茄。

優(yōu)選方式下，所述重組載體由將所述番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr插入表達載體得到。

進一步優(yōu)化，所述重組載體的具體制備方法為：

對所述番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr進行克隆：即上述以野生型抗晚疫病番茄l3708的cdna為模板，以spnbs-lrr-fp、spnbs-lrr-rp為特異性引物，進行pcr擴增；所述特異性引物的序列分別如seqidno.2、seqidno.3所示；將得到的pcr產(chǎn)物與pmd-19t克隆載體連接，得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α并涂布在含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行測序；

構(gòu)建了含有番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的重組表達載體：提取上述含有番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的菌體的質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶bamhi及saci雙酶切，回收得到目的片段，將所述目的片段與去除gus基因的pbi121表達載體連接，得到的連接產(chǎn)物即為重組表達載體。

將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α并涂布在含有卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進行pcr及雙酶切驗證；結(jié)果顯示表達載體構(gòu)建成功。

本發(fā)明的技術(shù)創(chuàng)新在于：

本發(fā)明克隆得到了一個番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr；構(gòu)建了含有番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的表達載體；獲得了過表達spnbs-lrr的抗晚疫病番茄植株。本發(fā)明方法得到的過表達植株中spnbs-lrr的表達量高于野生型植株，其抗晚疫病效果更優(yōu)。本發(fā)明通過過表達spnbs-lrr基因使番茄對晚疫病的抗性增強，對培育抗晚疫病番茄品種具有重要意義。

附圖說明

圖1為過表達與野生型植株中spnbs-lrr的表達量；

圖2為晚疫病菌處理5天后過表達與野生型植株表型。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。實施例中未注明的實驗條件及方法，均為常規(guī)方法。

實施例一：番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的克隆

1.番茄總rna的提取

(1)將樣品放入研缽中，加入液氮充分研磨至粉末。

(2)取適量粉末，置于1.5mlrnase/dnasefree離心管中，同時迅速加入1ml預(yù)冷的trizol，搖勻，室溫靜置5min。

(3)向離心管中加入200μl氯仿，搖勻，室溫靜置5min，4℃12000r/min離心15min。

(4)將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，并加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置20min后，4℃12000r/min離心10min。

(5)棄去上清，加入1ml預(yù)冷的75％乙醇，清洗沉淀，4℃12000r/min離心5min。

(6)小心棄去上清，在室溫下開蓋放置，待乙醇完全揮發(fā)后，加入20μlrnasefreedh2o溶解沉淀。

(7)取5μlrna，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.番茄cdna的合成

以總rna作為模板進行反轉(zhuǎn)錄，操作應(yīng)用reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)(購自takara)參照說明書完成。

3.spnbs-lrr基因的pcr擴增

以番茄l3708的cdna為模板，應(yīng)用特異性引物，進行pcr擴增。

克隆所用特異性引物如下：

spnbs-lrr-fp：cgggatccatgtgtgtgggaagagttacagatt

spnbs-lrr-rp：cgagctcttactctagtctttcaagtttgggg

反應(yīng)條件如下：

4.pcr擴增產(chǎn)物的回收純化

1％瓊脂糖凝膠電泳檢測上述pcr產(chǎn)物后，用切膠回收試劑盒(購自takara)回收符合目標(biāo)片段大小的pcr產(chǎn)物。

5.目標(biāo)片段與克隆載體連接

將上述回收得到的目標(biāo)片段與克隆載體pmd-19t(購自takara)連接，反應(yīng)體系如下：

16℃連接8h，即得到連接產(chǎn)物pmd-19t-spnbs-lrr。

6.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌

(1)將10μl的連接產(chǎn)物加入至上述200μl的感受態(tài)細胞中，吹打混勻后，冰水浴30min；

(2)將上述冰水浴后的混合液立即轉(zhuǎn)移至42℃水浴鍋中，90s后再次冰水浴2min；

(3)向上述混合液中加入1ml新鮮的lb培養(yǎng)基，于37℃恒溫搖床中，180rpm振蕩培養(yǎng)1.5h；

(4)將上述菌液于4000r/min離心10min，吸去1ml上清，留下200μl菌液，將其充分吹打懸浮后，均勻涂布于lb平板上(含100mg/l氨芐青霉素、24mg/liptg以及20mg/lx-gal)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；

(5)挑取白色單菌落，接至lb液體培養(yǎng)基(含100mg/l氨芐青霉素)中，于37℃恒溫搖床中180rpm振蕩培養(yǎng)過夜。

7.pmd-19t-spnbs-lrr質(zhì)粒的提取

依據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒(購自tiangen)的說明，提取上述菌液中所含有的pmd-19t-spnbs-lrr質(zhì)粒。取5μl的質(zhì)粒樣品進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

8.測序

將得到的質(zhì)粒送至華大基因(北京)公司測序，分析測序結(jié)果。

實施例二：番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr表達載體的構(gòu)建

1.pmd-19t-spnbs-lrr質(zhì)粒的酶切

將pmd-19t-spnbs-lrr質(zhì)粒用bamhi和saci(購自takara)進行雙酶切，回收目標(biāo)片段即小片段。酶切反應(yīng)體系及方法如下：

37℃酶切6h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

2.pbi121質(zhì)粒雙酶切

用bamhi和saci對pbi121質(zhì)粒進行雙酶切，切除gus基因，回收pbi121片段即大片段。反應(yīng)體系如下：

37℃酶切6h，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物。

3.目標(biāo)片段與pbi121載體連接

利用t4dna連接酶(購自takara)，將上述切膠回收得到的目標(biāo)片段和切掉gus基因的pbi121載體連接。反應(yīng)體系如下：

16℃連接過夜，連接產(chǎn)物即為表達載體pbi121-spnbs-lrr。

實施例三：番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr的應(yīng)用

1.pbi121-spnbs-lrr農(nóng)桿菌工程菌的制備

(1)將2μl的pbi121-spnbs-lrr質(zhì)粒加入到200μl的農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，充分吹打混勻后，冰水浴10min，之后迅速移至液氮中冷凍5min；

(2)將冷凍后的混合液于37℃水浴5min，加入1ml新鮮的yeb培養(yǎng)基，置于28℃恒溫搖床中，180rpm振蕩培養(yǎng)3h；

(3)將上述得到的菌液離心后，吸去1ml上清，充分吹打懸浮余下的200μl菌液，將其均勻涂布于yeb固體培養(yǎng)基上(含100mg/l鏈霉素、100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素)，28℃培養(yǎng)36h。

(4)農(nóng)桿菌工程菌的pcr檢測

挑取上述平板中經(jīng)抗生素篩選得到的菌落，置于5mlyeb中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16-17h。

吸取上述菌液2μl，加入18μl的ddh2o稀釋，于-20℃冷凍30-40min后，99℃加熱10min，使菌體充分裂解釋放dna；

以上述dna為模板，利用spnbs-lrr特異性引物進行pcr，反應(yīng)條件及反應(yīng)體系同“實施例一，3”。

2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化番茄早粉2號

(1)番茄種子的萌發(fā)

用水將番茄種子沖洗干凈后轉(zhuǎn)移至75％的乙醇中，浸泡30s，中間不斷晃動，再將種子移至2.5％的次氯酸鈉中表面除菌30min，最后用無菌水沖洗4次，每次2min。將上述表面已除菌的種子均勻擺放于預(yù)先濕潤的濾紙上，并于其表面覆蓋一層濕潤的濾紙，以保持較高濕度。將處理后的種子置于無菌環(huán)境中，于25-28℃暗培養(yǎng)，直至種子萌發(fā)。

(2)番茄子葉的獲得

當(dāng)番茄種子長出胚芽后，將其移至于1/2ms培養(yǎng)基中，待1周后長出子葉。

(3)番茄子葉外植體的制備

待番茄的兩片子葉完全舒展后，剪除其兩端，作為后續(xù)農(nóng)桿菌侵染的外植體，于含有1.5mg/l6-ba和0.5mg/liaa的ms培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d。

(4)農(nóng)桿菌工程菌液的制備

將上述得到的農(nóng)桿菌陽性菌接種于新鮮的yeb培養(yǎng)基中(含100mg/l鏈霉素、100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素)，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)16h左右。按照1:50的比例將菌液接種于不含任何抗生素的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)至菌液od600為0.5-0.6之間。

(5)農(nóng)桿菌對番茄外植體的侵染

將預(yù)培養(yǎng)后的番茄外植體轉(zhuǎn)移至上述菌液中，28℃，180rpm振蕩培養(yǎng)7-10min，室溫靜止2min，用無菌濾紙吸干葉片表面多余的菌液，將葉片均勻放置于ms培養(yǎng)基中(含1.5mg/l6-ba和0.5mg/liaa)共培養(yǎng)2d(遠軸面朝上)。

(6)番茄抗性芽的獲得及生根

將共培養(yǎng)后的番茄外植體轉(zhuǎn)移至ms篩選培養(yǎng)基中(含1.5mg/l6-ba，0.5mg/liaa，50mg/l卡那霉素和200mg/l羧芐青霉素)，培養(yǎng)至產(chǎn)生抗性芽。待抗性芽長至1-2cm時，將其剪下移至1/2ms生根培養(yǎng)基(含50mg/l卡那霉素和200mg/l羧芐青霉素)中，進行生根培養(yǎng)。

(7)番茄過表達植株的驗證

挑選長勢一致的過表達及野生型植株，提取葉片總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna并以此為模板，利用spnbs-lrr的特異性引物進行實時定量pcr檢測，結(jié)果如圖1所示，過表達植株中spnbs-lrr的表達量明顯高于野生型植株。rna提取同“實施例一，1”。反轉(zhuǎn)錄同“實施例一，2”。實時定量所用試劑盒為premixextaqtmii(tlirnasehplus)(購自takara)，反應(yīng)體系及條件參照說明書。

實時定量所用特異性引物如下：

qspnbs-lrr-fp：ggtatgggtggtgtaggtaaga

qspnbs-lrr-rp：gactgacagtgaccatgacaac

3.過表達spnbs-lrr番茄植株的抗病性檢測

(1)晚疫病菌孢子懸浮液的制備

將保存的晚疫病菌菌種接種于燕麥培養(yǎng)基上，于18℃的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)15d，用無菌水將菌體全部洗下，并用三層紗布過濾菌液。調(diào)節(jié)孢子終濃度至1×l0⁶spores/ml，于4℃低溫保存1h。

(2)晚疫病菌接種番茄材料

選取長勢一致的過表達和野生型番茄植株，對其均勻噴灑上述晚疫病菌孢子懸浮液。將處理后的番茄植株首先置于20±2℃，100％濕度的黑暗條件下培養(yǎng)24h，恢復(fù)正常光照后，置于溫度為20±2℃，75％濕度的條件下培養(yǎng)4d。觀察并拍照記錄發(fā)病情況，如圖2所示，過表達植株的病情明顯輕于野生型植株，說明過表達spnbs-lrr的番茄植株對晚疫病具有更高的抗性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>大連理工大學(xué)

<120>番茄抗晚疫病基因spnbs-lrr及其克隆方法與應(yīng)用方法

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2316

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtgtgtgggaagagttacagattgcttgatgcagccacctgcgcaacagattgggtat60

ttcttttactacaacagcaacatcacatctttggataatggatctcacaagctggacaat120

attacaagtggggtgcagcaaagagcggaggctgcacggagaaacttgcaagtcatttca180

caagatgttgaagcttggttaaatagtgttaccaagattaattcagatgtggaaggtgta240

atgcatggtagagttgaggttgaaagaggttgtttttatggttggtgtccaaatttgaag300

tcacggtactcgttgagcaagagagctaagagaattacactagcggtgattgaacttcga360

aatgatggaaaagattatgttgatttctcctatcctgcaccacctgtagttgaaattcaa420

gctatgagtgaggagtttgactccagaaaattgaaagaggaagaggtcatggcagctttg480

agagatgaggatgtctctgttattgggatttgtggtatgggtggtgtaggtaagacgaca540

ctagctgagaaaataagagtaagggcgaaaaaagaaaggttttttgatgaagttgtcatg600

gtcactgtcagtcaacaaccagacttgaaaacaattcaagctgagatagctggaggagtt660

ggcctaacattccaaggcgacaatttctggaatcgtggagatcagttgcgttcaaggtta720

atgggtcaggacagcatccttataatcttggatgatgtctgggaggctcttgatctgaac780

aaacttggaattcctagttgtagcaatcacaaccatcagtgcaaagtaacattgacaacg840

cgactccgagatgtttgtgaaacaatggaggctcgaaagatcatagaagttggaatctta900

cctgaaaaggaagcatgggtccttttcaggcagaaagccggtaattcggtagctgatctt960

tctcttcatgacacagcaaaagatgttgtgaaagaatgcaaggggttgccacttgcaatt1020

attacagttgcaggagcgctaaagcgtaaaagcaagccttcatgggaggatgcccttaaa1080

caattacaaaaatccacaccaaaaaatatcccaggagtgattaaaaatgtgtatcaatct1140

ctcaagctaagctatgatcagttggaaagtgatgaagtcaggtacctgtttttgctttgt1200

tccttgtttgaggaagatagtaatatctggcatgaacaattacttagatatggaatgggg1260

cttggcatcttctcggaaattgaaaatttagaagaagcaagaaagagggtgtgccatctg1320

ctagaaacattgaaggatcgtttcttgctatcccaaggttcaggaaaaaattatgtcaaa1380

atgcatgatgtggtccgagacgtggctatatatatcgcctctgagggaaggcatgttttt1440

atggtaagtcacagtgtgaactcagaagagttcccaagaagaacctcttacgagccatac1500

agtcacatgtcaattgttgcacaaaaaattgatgagcttcctaaaccaatatctttccca1560

agacttgagtttctaatgttaaaactattagaagagccgttcaaattacaggatgatttt1620

tttattggaatgagtaaacttaatgtcttaagcctgagtggatatgaggactccatttta1680

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aagttggatgacatatcaattattggcgaacttgtcactttagagattctcattattaga1800

gattctactatagatgtgcttccagtggagattggaaatttgagcaatttaattttgtta1860

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gacatttcctccaatttgacacggtattatctaaatatgggccaacaagttcatagttac2040

cacgatagttcgctcatggataattacaacaggattatggtcctcaatgttattgagacc2100

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<210>2

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<212>dna

<213>人工引物

<400>2

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<210>3

<211>32

<212>dna

<213>人工引物

<400>3

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