桔小實(shí)蠅Taiman基因和其可變剪切體檢測(cè)方法及其dsRNA與流程

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桔小實(shí)蠅Taiman基因和其可變剪切體檢測(cè)方法及其dsRNA與流程

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及桔小實(shí)蠅taiman基因和其可變剪切體檢測(cè)方法及其dsrna。

背景技術(shù)：

桔小實(shí)蠅(bactroceradorsalis)作為我國重要的檢疫性害蟲，在水果和蔬菜產(chǎn)業(yè)方面的危害最為嚴(yán)重，也被認(rèn)為是我國國際貿(mào)易中農(nóng)產(chǎn)品出口和國內(nèi)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中重要的制約因子。桔小實(shí)蠅以其寄主范圍廣、繁殖能力強(qiáng)和世代重疊的特點(diǎn)，使防治的難度大大加大。近年來，主要使用化學(xué)防治的方法對(duì)于桔小實(shí)蠅的治理，雖然簡單方便，但長期使用單一藥劑，抗藥性日益上升為亟待解決的問題。

rna干擾(rnainterference，rnai)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默手段，是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈rna(dsrna，double-strandedrna，雙鏈核糖核酸)誘發(fā)的、同源rna高效特異性降解的現(xiàn)象，是通過dsrna的介導(dǎo)特異性的降解對(duì)應(yīng)序列的mrna。由于使用rnai技術(shù)可以特異性抑制特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和基因治療領(lǐng)域。

保幼激素(juvenilehormone,jh)是調(diào)控昆蟲發(fā)育、變態(tài)與生殖最重要的激素之一。在昆蟲幼蟲期，jh阻止由蛻皮激素(ecdysone)引起的變態(tài)，從而使幼蟲蛻皮后仍然維持幼蟲形態(tài)。在幼蟲最后一次蛻皮前，jh滴度降低或缺失，導(dǎo)致全變態(tài)昆蟲化蛹和不完全變態(tài)昆蟲羽化為成蟲。保幼激素在全變態(tài)和不全變態(tài)昆蟲生長發(fā)育變態(tài)過程中不可或缺，所以保幼激素信號(hào)通路taiman基因的功能研究有利于我們了解保幼激素作用機(jī)理。由于人類、高等動(dòng)物、植物并不含有保幼激素，故保幼激素信號(hào)通路基因作為害蟲的靶標(biāo)相對(duì)安全，基于該途徑研發(fā)的新型殺蟲劑，應(yīng)用于害蟲的防治具有很大的潛力，但是目前針對(duì)桔小實(shí)蠅保幼激素通路taiman基因的相關(guān)研究較少，也未見針對(duì)桔小實(shí)蠅保幼激素信號(hào)通路taiman基因的dsrna的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種桔小實(shí)蠅taiman基因，其核苷酸序列如seqidno:11或12或13或14所示。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種如seqidno:11或12或13或14所示的桔小實(shí)蠅taiman基因全長的分段擴(kuò)增引物對(duì)，其特征在于，共計(jì)5對(duì)引物，引物bdtais1-f、bdtais1-r、bdtais2-f、bdtais2-r、bdtais3-f、bdtais3-r、bdtais4-f、bdtais4-r、bdtais5-f、bdtais5-r的序列依次如seqidno:1～10所示。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種如seqidno:11或12或13或14所示的桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna，為由序列如seqidno:18所示的核苷酸和與其序列互補(bǔ)的核苷酸組成的雙鏈rna。

本發(fā)明還提供了seqidno:18所示的桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna的合成方法，包括如下步驟：提取桔小實(shí)蠅的總rna，反轉(zhuǎn)錄成為cdna作為擴(kuò)增模板，以序列為seqidno:16的上游引物和以序列為seqidno:17的下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳后回收產(chǎn)物，以膠回收產(chǎn)物為模板合成得到桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna。

本發(fā)明還提供了一種如seqidno:11或12或13或14所示的桔小實(shí)蠅taiman基因進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)的方法，qpcr中的使用的上下游引物為bdtai-core-f、bdtai-core-r，其序列分別如seqidno:27、28所示。

本發(fā)明還提供了一種針對(duì)seqidno:11所示的桔小實(shí)蠅taiman基因進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)的方法，qpcr中的使用的上下游引物為bdtaia-f、bdtaia-r，其序列分別如seqidno:29、30所示。

還提供了一種針對(duì)seqidno:12所示的桔小實(shí)蠅taiman基因進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)的方法，qpcr中的使用的上下游引物為bdtaib-f、bdtaib-r，其序列分別如seqidno:31、32所示。

還提供了一種針對(duì)seqidno:13所示的桔小實(shí)蠅taiman基因進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)的方法，qpcr中的使用的上下游引物為bdtaic-f、bdtaic-r，其序列分別如seqidno:33、34所示。

還提供了一種針對(duì)seqidno:14所示的桔小實(shí)蠅taiman基因進(jìn)行qrt-pcr檢測(cè)的方法，qpcr中的使用的上下游引物為bdtaid-f、bdtaid-r，其序列分別如seqidno:35、36所示。

本發(fā)明還提供了上述dsrna在桔小實(shí)蠅發(fā)育、變態(tài)與生殖調(diào)節(jié)方面的應(yīng)用，在桔小實(shí)蠅防治上的應(yīng)用，或者在制備桔小實(shí)蠅殺蟲劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明運(yùn)用pcr技術(shù)克隆獲得桔小實(shí)蠅保幼激素信號(hào)通路taiman基因的可變剪切體，并根據(jù)可變剪切體的序列得到taiman基因的dsrna，可以應(yīng)用于對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行rna干擾從而起到防治桔小實(shí)蠅的效果。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，dsrna基因沉默效率高，基因干擾后桔小實(shí)蠅有明顯表型變化，解決了桔小實(shí)蠅目前沒有有效的保幼激素信號(hào)taiman基因的dsrna的問題，在研發(fā)新型殺蟲劑方面有很好的應(yīng)用前景。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)taiman基因被dsrna干擾后會(huì)縮短桔小實(shí)蠅幼蟲生長發(fā)育進(jìn)程，使幼蟲提前化蛹近24h，除此之外，處理組蛹的體長和體重與對(duì)照組相比有顯著差異。

附圖說明

圖1為擴(kuò)增桔小實(shí)蠅taiman基因得到的5個(gè)可變剪切體進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)結(jié)果圖。

圖2為桔小實(shí)蠅的taiman基因的氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖3為桔小實(shí)蠅注射dsrna后taiman基因或注射sitaiman-e后taiman-e基因的qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果，其中a、b為注射dsrna，c、d為注射sitaiman-e。

圖4為桔小實(shí)蠅注射dsrna或sitaiman-e后幼蟲化蛹時(shí)間變化統(tǒng)計(jì)圖，其中，a為注射dsrna，b為注射sitaiman-e。

圖5為桔小實(shí)蠅注射dsrna或sitaiman-e后蛹的表型，其中，a、c、e為注射dsrna后的蛹的表型，b、d、f為注射sitaiman-e后的蛹的表型。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

主要試劑及生產(chǎn)者：

primestarmaxpremix、primestarmaxpremix、膠回收純化試劑盒、perfectrealtimertreagent(takara公司,日本)

trizolkit(invitrogen公司，美國)

rneasyplusmicrokit(qiagen公司，德國)

transcriptaidt7highyieldtranscriptionkit、transcriptaidenzymemix、atp/ctp/gtp/utpmix、primescriptrtenzymemixi、oligodtprimer(thermofisherscientific公司，美國)qpcrmastermix(promega公司，美國)實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例一、桔小實(shí)蠅taiman基因可變剪切體序列克隆

按照如下步驟操作：

1)利用rna提取試劑盒rneasyplusmicrokit按照使用說明提取桔小實(shí)蠅的總rna，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒perfectrealtimertreagent按照使用說明將1μg總rna反轉(zhuǎn)錄成為cdna。

2)以上述得到的cdna為模板，根據(jù)ncbi上預(yù)測(cè)的桔小實(shí)蠅taiman基因序列以及該基因保守結(jié)構(gòu)序列，分段設(shè)計(jì)全長擴(kuò)增引物，共設(shè)計(jì)了5對(duì)分段擴(kuò)增引物進(jìn)行全長擴(kuò)增：bdtais1-f/bdtais1-r，bdtais2-f/bdtais2-r，bdtais3-f/bdtais3-r，bdtais4-f/bdtais4-r，bdtais5-f/bdtais5-r。pcr條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性30s、60℃退火15s、72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃條件下延伸10min。pcr反應(yīng)體系共25μl，包括：濃度為1000ng/μl的cdna模板1μl，濃度為0.15-0.25μm的前述上、下游引物各1μl，primestarmaxpremix12μl以及去核酸酶水10μl。前述5對(duì)分段擴(kuò)增引物的序列如下：

bdtais1-f：5’-gtgtaatcctgggcagaaacg-3’(如seqidno:1所示)，

bdtais1-r：5’-accgctaccacaaccaatgtc-3’(如seqidno:2所示)，

bdtais2-f：5’-aataatatgccgtatggagttagcg-3’(如seqidno:3所示)，

bdtais2-r：5’-cacttatgctgctactgctgttt-3’(如seqidno:4所示)，

bdtais3-f：5’-ccttcgcctcagtcaaataca-3’(如seqidno:5所示)，

bdtais3-r：5’-cagtgggagtaggtgctgataca-3’(如seqidno:6所示)，

bdtais4-f：5’-gcgttatggactatgtttcagacg-3’(如seqidno:7所示)，

bdtais4-r：5’-gttgagacttcgccgctgatt-3’(如seqidno:8所示)，

bdtais5-f：5’-cctatgttaagcgcgcagtt-3’(如seqidno:9所示)，

bdtais5-r：5’-cgacggccgttagtagtgta-3’(如seqidno:10所示)。

3)將pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行分離，分別得到1600bp、1500bp、1300bp、1100bp、750bp左右的條帶，將pcr產(chǎn)物純化，隨后將純化產(chǎn)物進(jìn)行加a反應(yīng)，然后將加a后的產(chǎn)物與載體pgem-teasy連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌dh5α中。轉(zhuǎn)化后經(jīng)藍(lán)白斑篩選，選出白色菌落轉(zhuǎn)入lb液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床震蕩繁殖(4h)，以菌液為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將陽性克隆菌液送往上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。

4)將測(cè)序結(jié)果通過手工校對(duì)、序列拼接，發(fā)現(xiàn)bdtais5-f/bdtais5-r的擴(kuò)增產(chǎn)物(750bp的產(chǎn)物)有5個(gè)可變剪切體，將5個(gè)可變剪切體對(duì)應(yīng)的taiman基因分別命名為taiman-a、taiman-b、taiman-c、taiman-d、taiman-e基因，其核苷酸序列分別如序列表中seqidno:11～15所示。

5)用dnaman6.0對(duì)引物bdtais5-f/bdtais5-r擴(kuò)增的片段所獲得的5個(gè)可變剪切體氨基酸序列進(jìn)行相似性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖1所示：taiman-a、taiman-b、taiman-c、taiman-d的氨基酸序列依次比taiman-e的氨基酸序列缺失249、183、167、75個(gè)氨基酸。

6)構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示：用前述seqidno:11～15所示的序列與雙翅目的果蠅、埃及伊蚊聚到一枝，確定得到的序列為桔小實(shí)蠅taiman基因序列。

實(shí)施例二、桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna

1)根據(jù)克隆獲得的桔小實(shí)蠅taiman基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增taiman基因的上、下游引物(含有t7啟動(dòng)子的序列)：t7-tai-core-f(如seqidno:16所示)、t7-tai-core-r(如seqidno:17所示)，引物序列分別為：

t7-tai-core-f：5’-taatacgactcactataggggctctcaattcgacgacacc-3’；

t7-tai-core-r：5’-taatacgactcactatagggacctgaccgttaagcagtga-3’。

2)利用rna提取試劑盒rneasyplusmicrokit按照使用說明提取桔小實(shí)蠅的總rna，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒perfectrealtimertreagent按照使用說明將1μg總rna反轉(zhuǎn)錄成為cdna，反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，其中包括：totalrna1μl(約1μg)，5×primescriptbuffer4μl，primescriptrtenzymemixi1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，rnasefreeddh2o12μl。

3)對(duì)步驟2)得到的cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性30s、60℃退火10s、72℃延伸5min，共35個(gè)循環(huán)；72℃條件下延伸10min；pcr反應(yīng)體系共25μl，包括：濃度為1000ng/μl的cdna模板0.5μl，濃度為0.15-0.25μm的上、下游引物(t7-tai-core-f、t7-tai-core-r)各1μl，primestarmaxpremix12.5μl以及去核酸酶水10μl。

4)將步驟3)中的pcr產(chǎn)物用膠回收純化試劑盒按照說明書純化回收之后作為合成dsrna的轉(zhuǎn)錄模板，用體外合成dsrna試劑盒transcriptaidt7highyieldtranscriptionkit按照使用說明轉(zhuǎn)錄合成并純化得到桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna溶液，將該dsrna命名為dstaiman-core，為由序列如seqidno:18所示的核苷酸和與其序列互補(bǔ)的核苷酸組成的雙鏈rna，seqidno:18所示序列為：

gcucucaauucgacgacaccuaauaacaacaauagcagcucaacuucuaaaagcaacgauaaucgaaauaauacagcaucuacacguuguuuacgaugugcaacugacaauugcucuauccauccaguacaacaaggugacguuucaucgaccgaacccccauugccggagccaucacugcuuaacggucaggu。

將dsrna溶液濃度稀釋到200-300ng/μl備用。dsrna合成反應(yīng)體系為20μl，其中包括：膠回收片段模板4μl(約1μg)、5×transcrptaidreactionbuffer4μl、濃度為100mm的atp/ctp/gtp/utpmix8μl、transcriptaidenzymemix2μl和depc-treated水2μl；反應(yīng)條件為：37℃孵育6h。

同時(shí)利用上述方法合成并純化得到gfp(綠色熒光蛋白)的dsrna溶液作為陰性對(duì)照，反轉(zhuǎn)錄得到的cdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增時(shí)使用的上下游引物序列分別為gfp-ds-t7f(如seqidno:19所示)、gfp-ds-t7r(如seqidno:20所示)，序列為：

gfp-ds-t7f：

5’-taatacgactcactatagggcagttcttgttgaattagatg-3’；

gfp-ds-t7r：

5’-taatacgactcactatagggtttggtttgtctcccatgatg-3’。

實(shí)施例三、桔小實(shí)蠅taiman基因的sirna

根據(jù)實(shí)施例一中得到的桔小實(shí)蠅taiman基因的5個(gè)可變剪切體，針對(duì)5個(gè)可變剪切體對(duì)應(yīng)的taiman基因taiman-a、taiman-b、taiman-c、taiman-d、taiman-e基因，相應(yīng)地設(shè)計(jì)5條特異性sirna序列送于廣州瑞博生物有限公司合成，sirna序列如下：

sitaiman-a：5’-guguaucugcacuacuuaaua-3’，如seqidno:21所示；

sitaiman-b：5’-ucuaaugucgguccuggcggu-3’，如seqidno:22所示；

sitaiman-c：5’-aauucuuuucaagguggcggc-3’，如seqidno:23所示；

sitaiman-d：5’-ucaacauuuaccugcagguaa-3’，如seqidno:24所示；

sitaiman-e：5’-guauuguuggcuuugguggca-3’，如seqidno:25所示；

sigfp：5’-gccacaacgucuauaucaugg-3’，如seqidno:26所示。

實(shí)施例四、桔小實(shí)蠅taiman基因的基因沉默驗(yàn)證

一、將桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna/sirna導(dǎo)入桔小實(shí)蠅

將實(shí)施例二、三中的桔小實(shí)蠅taiman基因的dsrna/sirna導(dǎo)入桔小實(shí)蠅：

利用nanojiectiiauto-nanoliter(drummondscientific)顯微注射儀對(duì)桔小實(shí)蠅注射dsrna/sirna，按照如下步驟操作：

1)將玻璃毛細(xì)管(美國drummond)固定于拉針儀(美國sutter)指定位置，參數(shù)設(shè)置為heat＝510，pull＝60，vel＝35，del＝30的拉針程序，取下拉制的毛細(xì)管。

2)將拉制后的毛細(xì)管至于磨針儀(美國sutter)指定位置，調(diào)整角度，將毛細(xì)管尖端磨成光滑表面，減少注射時(shí)對(duì)蟲體的傷害。

3)將磨好的毛細(xì)管置于顯微注射儀(美國drummond)，操作步驟嚴(yán)格遵循nanojectii/autonanoliterinjector說明書。

4)挑取桔小實(shí)蠅體型大小一致的4日齡幼蟲，置于裝有清水的培養(yǎng)皿中洗去體表飼料殘余，然后用濾紙吸干體表水分。

5)手持4日齡幼蟲，將1μgtaiman基因dsrna/80ngsirna溶液注射至幼蟲腹末倒數(shù)第三節(jié)間，以gfp的dsrna/sirna溶液的處理作為對(duì)照。

6)將注射后的幼蟲放入幼蟲人工飼料內(nèi)，置于恒溫箱正常飼養(yǎng)(溫度27.5±1℃，相對(duì)濕度70±5％，無光照)。

每30頭桔小實(shí)蠅為一個(gè)生物重復(fù)，設(shè)置3個(gè)taiman基因dsrna/sirna溶液的生物重復(fù)作為實(shí)驗(yàn)組。同時(shí)設(shè)置注射gfp的dsrna/sirna溶液的處理作為對(duì)照組。

二、沉默效率以及表型的檢測(cè)：

隨機(jī)選取注射taiman基因的dsrna/sirna后的24h和72h桔小實(shí)蠅幼蟲，以及gfp的dsrna/sirna溶液處理的對(duì)照組的桔小實(shí)蠅，使用trizol法分別提取rna之后利用perfectrealtimertreagent反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cdna，反轉(zhuǎn)錄體系為20μl，其中包括：totalrna1μl(約1μg)，5×primescriptbuffer4μl，primescriptrtenzymemixi1μl，oligodtprimer(50μm)1μl，random6mers(100μm)1μl，rnasefreeddh2o12μl。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。

利用qrt-pcr技術(shù)，檢測(cè)taiman基因以及5條可變剪切體在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量。qpcr中，針對(duì)5個(gè)可變剪切體的公共部分檢測(cè)的上、下游引物為bdtai-core-f(如seqidno:27所示)、bdtai-core-r(如seqidno:28所示)；針對(duì)taiman-a基因檢測(cè)的上、下游引物為bdtaia-f(如seqidno:29所示)、bdtaia-r(如seqidno:30所示)；針對(duì)taiman-b基因檢測(cè)的上、下游引物為bdtaib-f(如seqidno:31所示)、bdtaib-r(如seqidno:32所示)；針對(duì)taiman-c基因檢測(cè)的上、下游引物為bdtaic-f(如seqidno:33所示)、bdtaic-r(如seqidno:34所示)；針對(duì)taiman-d基因檢測(cè)的上、下游引物為bdtaid-f(如seqidno:35所示)、bdtaid-r(如seqidno:36所示)；針對(duì)taiman-e基因檢測(cè)的上、下游引物為bdtaie-f(如seqidno:37所示)、bdtaie-r(如seqidno:38所示)。各引物序列如下：

bdtaia-f：5’-cctatgttaagcgcgcagtt-3’；bdtaia-r：5’-taagtagtgcagatacacccc-3’；

bdtaib-f：5’-cctatgttaagcgcgcagtt-3’；bdtaib-r：5’-gccaggaccgacattagttc-3’；

bdtaic-f：5’-cctatgttaagcgcgcagtt-3’；bdtaic-r：5’-gccgccaccttgaaaagaat-3’；

bdtaid-f：5’-aggtggtgaatctggtggtt-3’；bdtaid-r：5’-cctgcaggtaaatgttgggt-3’；

bdtaie-f：5’-ggagtgtcggtattgttggc-3’；bdtaie-r：5’-cctgagcgcgaccataaaat-3’；

bdtai-core-f：5’-gctctcaattcgacgacacc-3’；bdtai-core-r：5’-acctgaccgttaagcagtga-3’。

qrt-pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s、60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。pcr反應(yīng)體系為20μl，包括：cdna模板1μl(250ng)，前述上、下游qpcr引物各1μl，去核酸酶水7μl和熒光染料qpcrmastermix10μl。選用桔小實(shí)蠅的α-tubulin基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，分析方法則采用國際上慣用的2^-δδct法。內(nèi)參基因α-tubulin的qpcr引物序列：

α-tubulin-f：5’-cgcattcatggttgataacg-3’，如seqidno:39所示；

α-tubulin-r：5’-gggcaccaagttagtctgga-3’，如seqidno:40所示。

qrt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示，在rna干擾4日齡幼蟲24-72h后，桔小實(shí)蠅的taiman基因5條可變剪切體在注射dsrna的實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組(gfp)均顯著下調(diào)，而且下調(diào)高達(dá)50％左右，如圖3a、3b所示。注射sitaiman-e的實(shí)驗(yàn)組中taiman-e基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著下調(diào)，如圖3c、3d所示。同時(shí)，通過觀察發(fā)現(xiàn)，taiman基因的dsrna及taiman-e基因的sirna處理的實(shí)驗(yàn)組的桔小實(shí)蠅幼蟲化蛹提前，提前約24h(結(jié)果如圖4所示)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組的蛹重和蛹長較對(duì)照組相比顯著減小，圖5中a、c、e為注射taiman基因dsrna后的蛹的表型，處理組與對(duì)照組相比蛹明顯變小，圖5中b、d、f為注射sirna-tai-e后的蛹的表型，taiman-e基因被單獨(dú)干擾之后的表型與dsrna干擾的taiman-core(前述5個(gè)可變剪切體的公共部分)被干擾后的表型一致，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)組的桔小實(shí)蠅的taiman基因的表達(dá)受到抑制，且taiman基因參與昆蟲的變態(tài)發(fā)育，也進(jìn)一步證明了實(shí)施例一中的序列seqidno:11～15為桔小實(shí)蠅taiman基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明利用本發(fā)明方法對(duì)桔小實(shí)蠅進(jìn)行taiman基因的dsrna和taiman-e的sirna，能夠有效導(dǎo)入dsrna和sirna，達(dá)到rna干擾的效果。

研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)分別注射針對(duì)5個(gè)可變剪切體對(duì)應(yīng)的taiman基因taiman-a、taiman-b、taiman-c、taiman-d、taiman-e基因的sirna進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在5條可變剪切體中，taiman-e基因被干擾后的表型與dsrna處理后的表型一致，而其他4條可變剪切體被干擾后無明顯表型，說明taiman-e基因主要發(fā)揮該方面功能。

序列表

<110>西南大學(xué)

<120>桔小實(shí)蠅taiman基因和其可變剪切體檢測(cè)方法及其dsrna

<130>1

<160>40

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais1-f

<400>1

gtgtaatcctgggcagaaacg21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais1-r

<400>2

accgctaccacaaccaatgtc21

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais2-f

<400>3

aataatatgccgtatggagttagcg25

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais2-r

<400>4

cacttatgctgctactgctgttt23

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais3-f

<400>5

ccttcgcctcagtcaaataca21

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais3-r

<400>6

cagtgggagtaggtgctgataca23

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais4-f

<400>7

gcgttatggactatgtttcagacg24

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais4-r

<400>8

gttgagacttcgccgctgatt21

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais5-f

<400>9

cctatgttaagcgcgcagtt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<223>bdtais5-r

<400>10

cgacggccgttagtagtgta20

<210>11

<211>5520

<212>dna

<213>人工序列

<223>taiman-a

<400>11

atgtcaattgttgcagccgaaaatgcagggcttggcccatgtgatttaccagattcgtgg60

gcaccaaacacaaataatagcaacaacaatattactagtatcgttgcaaatagtagagac120

atctcatcgttatcagcagtcacagaaaattcatcaaacacggctgtccctcttaatatt180

gacaacaatattagctcgaatatagtgttcttcaagaaccaaagcagtccaactacaact240

gccattcaaccgaccacttctttcggcttttcaccaacatcaacggcaagagcaacaaca300

tcaaccacttccagtcttatatacaaggtgcctctctcatcgccagccgctgctacagcc360

gctgttactgtttcaccagccagcattggtagtctagtaacgtctttaggtgtgggtctg420

gtaccctcaataccgacgtgtgtgtccgttactggaacgagtaccggtggaactggagcc480

tttgctggtgtactgttatcaagcccaatatcagctggtggtagtagcaatagtatttcg540

gctcaaaaaaccattacaaattatcaagtaaacaacgtcaataataacgcaaataacacc600

ggcaataccagcgttagaagtctaacacttccattgcagcaacaacaactacaattgcaa660

caacaaaacggcttattgctacataacaaacagagcaaccaaaacaacaataacagctct720

ttagtgaataataaccacgataaaaatagcaacaattttaatttaatactacgacagaag780

tctgcagcaactgtaagtttagccgccgcacttcaaaattcaatcaccatgaatgcggta840

gcttcgccaatctcaaacaacccagcgacgccgactcgaaaaattagaagaaaaactgat900

ccgaaagccaatttgccacaatcacagattaataaatgtaataacgagaaaaggcgtcgc960

gaattggaaaacaattatatcgagcaattgtccgagtttttacaactcaacaaacgcggt1020

gatacagcctcaacgaaaccagacaaggcagcaatactgaaccaagtagtgaaaacgtat1080

cgtgagttttgtgacaagggccaaagccgtgatatttcttcctcaacgtcgactaccgct1140

tcttcagctctcaattcgacgacacctaataacaacaatagcagctcaacttctaaaagc1200

aacgataatcgaaataatacagcatctacacgttgtttacgatgtgcaactgacaattgc1260

tctatccatccagtacaacaaggtgacgtttcatcgaccgaacccccattgccggagcca1320

tcactgcttaacggtcaggtgcccgaaatatctgcctattttgaggcgttggaacattac1380

ctctcttcagtcgattgggtgcttttacaagtcactgcagacgggataatcgagtcgtgt1440

acgcagaatatacgagagctaatcggctatgacaaacaggaactgtttcgtaaaccacta1500

tatcagtacctacactccgacgatcatgcgaaattaaatccaattataaataatatgccg1560

tatggagttagcggaaatgcaactggtgacattggttgtggtagcggtagccaaagtggc1620

tggaatgatttggaagatgcgaatagtggtacaaattcgcaacattcaacagcttcgtta1680

ggtccaggaagtgctaaagctaaaagaaatatagcagctaaagtccgaatgctagtgaaa1740

gatttgcgttcggctactcaaacatctatgacgcaccaaaacgatgctttggatcagaaa1800

actgtcggacaacatataaaccccgaaaaatatgaggaagttatgctcctagcaacaccg1860

atgaaagacgatggtgatacaacgtcctccatattgtgtttgattacccgtcccgaagat1920

gaaccggccatacaacagatacaaccgcaggccatagagcatttaacctttaaacttgac1980

gtacacggcaagatactcaatttggatgtaaccgcacttcgtcaaccctatcgtcaacat2040

ttaagtagttggttgggacgccttttgcaggatctttgtcatccgcaagacttaaatgct2100

ctgaaatcacacttacgcgaggttcaagagtcagctgcttcagtccatttgatgaactct2160

ccatcatcacactcacctggtggaacgcctgcaacactcattcatcctcccattgcgaat2220

gtgatgtcacgtccatttagattgcgtctcggcgcacccgatgtttatgtccatgttaag2280

gcgaattcacgactttttttaaatcagtcgcaaactgagggcgattatattatgtctctg2340

caaacattacttaacacggataacgatataggcggaggaggtataagtggattgaacatc2400

ggaggtatcgggaacagtagtatgatgccatctagcagtttgtcaacaatgtcgcctagt2460

ccatcgttagtttcgcccctttctctgcccttggactcacttgttaataacaattcgtca2520

tgctcctcttcgtcggcgtcagctttagcaagtgtaagtagcggtgtacatatgttagga2580

ggactagttggaggtggtggtatgccaccaatcaccacgcaaactactaatgtgggtgga2640

ccactgatgacttcagctgttatcaatggtacagggagtggtacacaacgtaacaatcct2700

gcagtggcaacatcggcatcgacttcgaataattccaatctggtgaattcgtttaccgca2760

tcgcctgctggacccgaagcaacgattttctatagttccgacccttttgattttgacttg2820

gcacattccagttttgaaatggacgccactggttggacggattcgcgtccaaactctcgc2880

gcttctgttactaccccagtaagcactccgcgtccaccgtcagcgggacatggtttcagt2940

ccggcagtatgtgcttcaccatctacaccatatcaactgtcgtcacactcagctgcgagc3000

ttgccttcgcctcagtcaaatacaagtcagccgtcatctgctggtcccggggttagtgga3060

gggccgtttgggtttggttttccggcgtttgaaacaagtgataaaaataatgataaagac3120

cacatgaacgctagcataaacagcagtagcagcataagtggcaataattctggacctcaa3180

ggtggttccagtggtgcgttgagcggccctgcaaatttaccaaatggtggtccgccatta3240

cttaccactgttgctaacatgactcaactatctgcacagccgaatccaccccaaccggaa3300

tcagagcgtttacggcacttattgacaaataaatcgcattcaatgacctcaggaatgaac3360

ccggccgatggtgataaagatcatcttagcctgtgccataagctgcttaacgaaaaatcg3420

gaggatgatgatggaaaaggaccttcgcttggtcgacaaagtgaattgatgcgtcaacta3480

caaaaggacgatggtcattatagtcattcacacggtcatagccacgggcaacatcactcc3540

aaggacatgtcgcaagaggatttactaaaaagtttaaagtaccagggtgatcctacaact3600

cgcaagcgttcgctcaatgaaccggatgatggcatattagcaaaacgtgaaagtgaccgc3660

ccatccaagttacgtgagagcaataaaatgcttgcctcgctgttagaaaatccgccaaag3720

aatcctatagtcactgtaccacctcaagtcaaaactatacctgacattgcaccttcagca3780

agccgcgtcaactcgacacccggtgttatgagtgtttcagcgccaaatagtctaggtggc3840

atgccaccaaaaagcggcataatgacgacgacctcatcaattagtgcaggaggcagttct3900

gtcggagccggtggacggagcaatagtatgcgcaaacaattttccgatgcctacctcacg3960

ctgcaacagcagcaacatcagcaacaactccacctacaacaacaacagcaacaatgttta4020

ggtaacactcaacgttcttcacatcagcagccaacacaactatctcaaccgcaaataaac4080

tttgcttcatcggacgccttcggaacatcttcacataacaccacagctacctcagggaca4140

gccaacgtcacagcgtcaattgtgacgtcacaagcaaactcccaattagccgctcctagc4200

ggcgctgatggcgattcagaattatctaagattttggatagcgttatggactatgtttca4260

gacgatgggccatttgtatcagcacctactcccactgccttggctggattaacgcagcaa4320

gagattaatgaacgcatggctatcaacgctattcaaaattcattgatggtcgagacatct4380

caactgcaacagcagcaacatcatcaacaacagccgcaaccgccagcctatcctggcaac4440

ataatggggagtggcactggagggaatttaactcagcaacaacaacagctacagctccag4500

catcacctgcagatgttgcaaaggcagcaggctgcaattggaggcaatcaacagtcaact4560

caggtacaacaaatgttggaggtactacgtgtcaacgccaatcaaagtttccaacgaccg4620

ccacctatgtattcggcgtcgcgtaacaggggcccaatgaatactgttacgacacctgga4680

ggctctgttttgccagcgcatcagcagtaccgaattcgtcaacaacagcaacagcaacaa4740

caacagaaagagcgtcttcttcagcaacaacaaaagcaacagcttttggttcctgagagt4800

gcaacagcgcgcacagaccagttatgtctaaatccgaacatcaacaacattggttcgctg4860

ttaaataacacagtagcgccaaatgtcgccttgtctcgtaccaacttgccgcccgattcg4920

caactgagtccgaattttgcacagaatttacttcaacaacaacagttaagtccagggcaa4980

cgtaatgcaccatttagtccacaaacgaatgcaggttatgcaccgcaatattcacaaagc5040

ggacaacgtctatcgccccatcatcaacagcatatttcacagcagcaacaacaagtgaat5100

gctcagcaacaacaacagatggcgtttcaggctgcccaagcagcaaacgctaatgtcact5160

ccgcagctatcaccacgccaaccgccttttggtggaggagcaggtggtgtacaatcacct5220

acaggcatgccgtcatcacaacaatggaatgcaagtggtaatgttagtacgccaagtgta5280

caactaagtggaaatgtgacaactcaacgcggtcattcattacaacaacataatcctatg5340

ttaagcgcgcagttacaacagggtgttagtccttatacaacacgtccgtatcaaaatcag5400

cggcgaagtctcaactctccgaacggagggggtgtatctgcactacttaatacaccagat5460

ccttccatgaattttagcttcgatgcacaagatttctttggcaacaatgctacaaggtga5520

<210>12

<211>5718

<212>dna

<213>人工序列

<223>taiman-b

<400>12