本發(fā)明公開了一條能有效編輯豬rosa26基因的sgrna及其應(yīng)用，同時(shí)還公開了與該sgrna相關(guān)的更加安全的外源基因的定點(diǎn)策略及可行性分析，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

crispr/cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源dna。crispr/cas9系統(tǒng)通過將入侵噬菌體和質(zhì)粒dna的片段整合到crispr中，并利用相應(yīng)的crisprrnas（crrnas）來指導(dǎo)同源序列的降解，從而提供免疫性。后來，研究人員發(fā)現(xiàn)，它更是一種精確且萬能基因編輯工具，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，包括人、老鼠、豬、牛、羊、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、酵母、線蟲和農(nóng)作物等的基因。利用這種機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)基因組的精確編輯，如條件性基因敲除、基因敲進(jìn)、基因替換、點(diǎn)突變等等。crispr/cas9技術(shù)以自己操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，該技術(shù)面世以后，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的諸多不足，在基因編輯領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。

轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)新品種培育和生物醫(yī)藥研究中具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。長期以來，由于缺乏豬胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因豬的制備主要依賴于體細(xì)胞基因修飾和體細(xì)胞核移植技術(shù)。而目前，對(duì)體細(xì)胞的基因修飾主要依賴將外源基因隨機(jī)插入豬基因組的方法，導(dǎo)致外源基因在豬基因組中的整合位點(diǎn)和拷貝數(shù)不可控，進(jìn)而使外源基因豬體內(nèi)表達(dá)不穩(wěn)定，引發(fā)轉(zhuǎn)基因豬個(gè)體之間表型不均一等問題。又因?yàn)閭鹘y(tǒng)轉(zhuǎn)基因豬的制備過程中對(duì)外源啟動(dòng)子基因及正負(fù)篩選標(biāo)記基因的依賴性，進(jìn)一步增加了轉(zhuǎn)基因豬的安全評(píng)價(jià)等問題。這些因素限制了轉(zhuǎn)基因豬的培育與應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一條能有效編輯豬rosa26基因的sgrna，該sgrna能用于特異識(shí)別和靶向編輯豬rosa26基因及rosa26基因定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因豬的制備。

本發(fā)明所提供了一種能有效編輯豬rosa26基因的sgrna，其特征在于：該sgrna的rna序列如：seqid1所示，互補(bǔ)鏈的rna序列如：seqid2所示。

本發(fā)明能有效編輯豬rosa26基因的sgrna的dna序列，其特征在于：該sgrna的dna序列如seqid3所示，互補(bǔ)鏈的dna序列如：seqid4所示。

本發(fā)明所述的能有效編輯豬rosa26基因的sgrna的制備方法，包括以下步驟：

1）在基因庫中調(diào)出豬rosa26基因的序列，根據(jù)pam序列（ngg）選擇用于基因敲除的sgrna靶向的區(qū)域；

2）根據(jù)靶位點(diǎn)的序列，設(shè)計(jì)并合成對(duì)應(yīng)的引物序列；

3）引物退火形成寡聚核苷二聚體（oligoduplex）；

4）將寡核苷酸二聚體連接到相應(yīng)的質(zhì)粒載體中，即可獲得sgrna的表達(dá)載體；

本發(fā)明所述的能有效編輯豬rosa26基因的sgrna在豬rosa26位點(diǎn)編輯的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的所述的能有效編輯豬rosa26基因的sgrna在豬rosa26位點(diǎn)編輯的應(yīng)用，其特征在于：能有效編輯豬rosa26基因的sgrna在特異識(shí)別和靶向編輯豬rosa26基因中的應(yīng)用以及在制備rosa26基因定點(diǎn)整合轉(zhuǎn)基因豬中的應(yīng)用。

本發(fā)明的積極效果在于：

以豬基因組中的一個(gè)能特異識(shí)別豬rosa26基因的sgrna為前提，利用crispr/cas9介導(dǎo)基因敲入技術(shù)，成功地構(gòu)建了egfp定點(diǎn)整合的豬胎兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系，結(jié)果顯示該細(xì)胞系能穩(wěn)定且高效的表達(dá)egfp基因，且該細(xì)胞系的制備過程中沒有引入任何的外源的啟動(dòng)子基因及正負(fù)篩選標(biāo)記基因。這大大的增加的轉(zhuǎn)基因豬的安全性，對(duì)去除轉(zhuǎn)基因豬農(nóng)產(chǎn)品的生物、食品安全隱患具有重要意義。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明用于評(píng)估3條不同sgrna切割效率的測序峰圖；

圖2為本發(fā)明egfp定點(diǎn)打靶質(zhì)粒載體示意圖；

圖3為本發(fā)明egfp定點(diǎn)整合細(xì)胞克隆的熒光顯微鏡圖；

圖4為本發(fā)明egfp定點(diǎn)整合的細(xì)胞克隆的pcr鑒定電泳圖。

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術(shù)解決方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1

1-1、sgrna序列的設(shè)計(jì)及px330表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)并合成了3條針對(duì)豬rosa26位點(diǎn)的sgrna序列。上述設(shè)計(jì)完成的shrna序列合成；6條單鏈的sgrna的dna序列分別經(jīng)過退火后形成3條靶向豬rosa26第一內(nèi)含子不同位點(diǎn)的sgrna的寡核苷酸鏈；然后將該寡聚核苷酸連連入px330質(zhì)粒載體。

這3條sgrna的序列及其作用位點(diǎn)的序列分別為：

sgrna-86序列：5-atcgcagtggtagtcaagat-3；

sgrna-86作用位點(diǎn)的序列：5-atcttgactaccactgcgat-3；

sgrna-89序列：5-atcttgagcataggcccaac-3；

sgrna-89作用位點(diǎn)的序列：5-gttgggcctatgctcaagat-3；

sgrna-91序列：5-tacggtcagataactctcac-3；

sgrna-91作用位點(diǎn)的序列：5-gtgagagttatctgaccgta-3；

其中，本發(fā)明所涉及的

sgrna的rna序列為：5-uacggucagauaacucucac-3（seqidno.1）；

sgrna的rna序列的互補(bǔ)序列為：5-uacggucagauaacucucac-3（seqidno.2）；

其中，本發(fā)明所涉及的

sgrna的dna序列為：5-tacggtcagataactctcac-3（seqidno.3）；

sgrna的dna序列的互補(bǔ)序列為：5-tacggtcagataactctcac-3（seqidno.4）。

、高效sgrna的評(píng)估和篩選

通過對(duì)3種sgrna的表達(dá)載體進(jìn)一步的測序后，進(jìn)行質(zhì)粒的大提和質(zhì)粒的乙醇沉淀，將純化后一定濃度的三種sgrna的px330的表達(dá)載體，通過電穿孔轉(zhuǎn)染的方式引入到豬的胎兒成纖維細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后的72小時(shí)，提取各組細(xì)胞的基因組，然后用特異性的檢測突變效率的引物進(jìn)行pcr反應(yīng)，將所獲得的pcr產(chǎn)物一方面送去測序通過對(duì)測序峰圖的分析初步評(píng)估個(gè)sgrna的切割效率，同時(shí)將剩下的pcr產(chǎn)物用于連t載體或同過t7e1分析來精確的評(píng)估各sgrna對(duì)靶基因的切割效率。圖1為本發(fā)明用于評(píng)估3條不同sgrna切割效率的測序峰圖。

實(shí)施例2

egfp定點(diǎn)整合打靶載體的構(gòu)建

根據(jù)篩選出的高效sgrna設(shè)計(jì)并構(gòu)建與該sgrna配套的egfp基因打靶載體（puc57-egfp-ki-donor），該打靶載體的主要原件依次為：上游同源臂、sa位點(diǎn)、egfp基因、polya位點(diǎn)、下游同源臂及原核表達(dá)的骨架載體。該egfp定點(diǎn)整合打靶質(zhì)粒與篩選出的sgrna共同作用可以對(duì)豬基因組的rosa26位點(diǎn)進(jìn)行特異的基因改造，然后再結(jié)合熒光顯微鏡與pcr的方法可以很方便的分析外源基因在該sgrna識(shí)別位點(diǎn)整合并表達(dá)的可行性。圖2為本發(fā)明egfp定點(diǎn)打靶質(zhì)粒載體示意圖。

實(shí)施例3

（1）px330質(zhì)粒與puc57-egfp-ki-donor質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染

復(fù)蘇原代豬的胎兒成纖維細(xì)胞，傳至f3代時(shí)，消化f3代的豬的胎兒成纖維細(xì)胞，用dpbs洗2~3遍后，棄上清，加入電轉(zhuǎn)染緩沖液，然后將px330質(zhì)粒與puc57-egfp-ki-donor質(zhì)粒按比例加入到細(xì)胞和緩沖液中，用移液器輕輕混勻后，輕輕的將混合液移入電極杯中，將電極杯放到電穿孔儀器上進(jìn)行電擊操作。電擊完成后，將電極杯在4℃靜置10分鐘后，將電極杯中的混合液轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)皿中。最后將該細(xì)胞培養(yǎng)皿置于39℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)12小時(shí)后，換液。

實(shí)施例4

egfp細(xì)胞克隆的挑取與鑒定及熒光顯微鏡圖片

電轉(zhuǎn)染72h后，通過極限稀釋的方法將豬的胎兒成纖維細(xì)胞鋪到100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，2~3天更換一次細(xì)胞培養(yǎng)液。9~10天后待細(xì)胞克隆長成后，在熒光顯微鏡下將發(fā)綠光的細(xì)胞克隆統(tǒng)一做上標(biāo)記，然后將這些標(biāo)記過的克隆挑取入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接著培養(yǎng)。2~3天后，待24孔板中的細(xì)胞長至一定得匯合度，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代同時(shí)分出部分克隆的細(xì)胞，將這些細(xì)胞用np40裂解液裂解后再通過pcr和測序的方法進(jìn)一步驗(yàn)證定點(diǎn)egfp的整合事件。圖3為本發(fā)明egfp定點(diǎn)整合細(xì)胞克隆的熒光顯微鏡圖；圖4為本發(fā)明egfp定點(diǎn)整合的細(xì)胞克隆的pcr鑒定電泳圖。

<110>吉林大學(xué)

<120>一條能有效編輯豬rosa26基因的sgrna及其應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

aucgcagugguagucaagau20

<210>2

<211>20

<212>rna

<213>人工序列

<400>2

aucuugagcauaggcccaac20

<210>3

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<212>rna

<213>人工序列

<400>3

uacggucagauaacucucac20

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

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atcgcagtggtagtcaagat20

<210>5

<211>20

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<213>人工序列

<400>5

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tacggtcagataactctcac20