本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：當(dāng)前，世界性能源短缺和環(huán)境污染已經(jīng)成為人類(lèi)社會(huì)所面臨的巨大挑戰(zhàn)，因此，尋找一種替代化石能源的新型可再生清潔能源，已成為世界各國(guó)的共識(shí)。生物柴油(biodiesel)，其性能跟石化柴油基本相當(dāng)，且具有良好環(huán)保性和生物降解性，已成為國(guó)際上應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的理想可再生能源。目前，生物柴油是指來(lái)自生物體的油脂(主要為甘油三酯)與醇類(lèi)(甲醇或乙醇)經(jīng)酯交換作用而形成單烷基脂肪酸酯。微藻制生物柴油的原理是利用微藻油脂合成相關(guān)基因的高效表達(dá)，提升油脂含量，，然后利用物理或化學(xué)方法把微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂轉(zhuǎn)化到細(xì)胞外，再進(jìn)行提煉加工，從而生產(chǎn)出生物柴油。微藻是光合自養(yǎng)型的低等水生植物，其種類(lèi)繁多，分布極其廣泛。其具有光合作用效率高，生長(zhǎng)快速，生物量大等特點(diǎn)。而且油脂含量較客觀，已成為制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)天然原料，是未來(lái)生物柴油發(fā)展的研究熱點(diǎn)。目前，微藻生物柴油的生產(chǎn)能耗和高昂成本是阻礙其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。海洋硅藻富含油脂，一般占細(xì)胞干重的40％-60％，且短鏈脂肪酸(c14與c16)占總脂肪酸的67％-70％左右。2008年，海洋硅藻三角褐指藻基因組已測(cè)完，是硅藻生物學(xué)研究的模式藻。其油脂含量一般在20％-30％左右，是制備生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料。通過(guò)基因工程技術(shù)手段構(gòu)建出高油脂含量的工程微藻有望提高生物柴油的產(chǎn)率。目前，通過(guò)基因工程手段獲得的高產(chǎn)油三角褐指藻，大多數(shù)都是過(guò)表達(dá)某個(gè)脂質(zhì)相關(guān)的關(guān)鍵基因得到的。然而，這種方法獲得的工程微藻藻株的產(chǎn)油效果是有限的。當(dāng)前，在三角褐指藻產(chǎn)油的研究中，廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子只有一種，這大大阻礙了微藻基因工程的發(fā)展。啟動(dòng)子是一段位于基因5'端上游區(qū)的dna序列，能活化rna聚合酶，使之與模板dna準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。啟動(dòng)子一般由啟動(dòng)子核心元件和上游元件組成。位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-20～-30bp處的tatabox為啟動(dòng)子核心元件，是富含有at的保守序列區(qū)，與dna(脫氧核糖核酸)雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的選擇，是絕大多數(shù)植物啟動(dòng)子正確表達(dá)所必需的。tatabox上游的保守序列稱(chēng)為啟動(dòng)子上游元件，包括上游-75bp處的caatbox和-80--110bp附近的gcbox等一般上游啟動(dòng)子元件及其他特殊的上游元件。大量文獻(xiàn)表明啟動(dòng)子元件的種類(lèi)、數(shù)量以及彼此間胡順序與距離都可能影響基因的轉(zhuǎn)錄與否或轉(zhuǎn)錄程度，不同基因其啟動(dòng)子的長(zhǎng)度各有不同，所含有胡元件也各有不同，因此，啟動(dòng)子的長(zhǎng)度與其啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。目前，通過(guò)基因工程獲得的高產(chǎn)油工程微藻藻株一般都是使用三角褐指藻內(nèi)源型啟動(dòng)子fcp(fucoxanthin，chlorophylla/c-bindingprotein，墨角藻葉綠素a/c結(jié)合蛋白)基因簇，此啟動(dòng)子已實(shí)現(xiàn)多個(gè)報(bào)告基因與目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。然而，若想同時(shí)表達(dá)多個(gè)脂質(zhì)關(guān)鍵基因，只有一個(gè)啟動(dòng)子是不夠的，在動(dòng)物中，同時(shí)過(guò)表達(dá)多個(gè)基因的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟。只要有不同的啟動(dòng)子，就能同時(shí)過(guò)表達(dá)不同的基因。但是，在三角褐指藻中只有少數(shù)啟動(dòng)子被證實(shí)并廣泛應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因在三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)周期內(nèi)高效表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種啟動(dòng)子，包括基本組成元件、特有元件和誘導(dǎo)元件；所述特有元件選自3-af3bindingsite、box4、box-w1、p-box、tc-richrepeats、wbox；所述基本組成元件選自tata-box或caat-box；所述誘導(dǎo)元件選自光誘導(dǎo)順式作用元件、光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件、熱誘導(dǎo)元件、硫反應(yīng)核心元件或質(zhì)體patpb基因啟動(dòng)子核心元件。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子中所述光誘導(dǎo)順式作用元件為-10promoterelement；所述光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件選自t-box或gt-1box；所述熱誘導(dǎo)元件為ccaatbox；所述硫反應(yīng)核心元件為sure；所述質(zhì)體patpb基因啟動(dòng)子核心元件為boxii。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個(gè)：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸獲得的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子中所述取代為取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37或38個(gè)核苷酸。本發(fā)明還提供了所述啟動(dòng)子在啟動(dòng)下游基因在微藻生長(zhǎng)周期內(nèi)高效表達(dá)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述微藻為三角褐指藻；所述下游基因?yàn)槿呛种割A(yù)測(cè)蛋白基因pt48882。本發(fā)明的三角褐指藻預(yù)測(cè)蛋白基因pt48882，在genbank的基因組編號(hào)為phatrdraft_48882，本發(fā)明克隆該基因的預(yù)測(cè)編碼區(qū)的上游區(qū)域，命名為啟動(dòng)子ppt48882。其在微藻的生長(zhǎng)周期內(nèi)均可高效啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明的三角褐指藻預(yù)測(cè)蛋白基因pt48882高表達(dá)啟動(dòng)子位于三角褐指藻19號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1103bp，在染色體上位置是：568482--569585。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，含有本發(fā)明提供的所述啟動(dòng)子。作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體還包括報(bào)告基因gus。把此啟動(dòng)子與報(bào)告基因gus連接，構(gòu)建到帶有抗性基因(博來(lái)霉素)的質(zhì)粒中，通過(guò)電擊等方法，把重組質(zhì)粒整合到三角褐指藻的基因組中，只需驗(yàn)證gus的表達(dá)即能驗(yàn)證啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率。作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體依次包括ori、ppt48882、gus、tfcpa、pnr、ble和tnr。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，含有所述表達(dá)載體。作為優(yōu)選，所述宿主細(xì)胞為微藻。優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為硅藻。更優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為三角褐指藻。本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個(gè)的啟動(dòng)子：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸獲得的核苷酸序列；步驟2：將步驟1獲得的所述dna分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞在提高微藻內(nèi)目的產(chǎn)物的產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞在生產(chǎn)生物柴油中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)生物柴油的方法，利用本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞的油脂合成相關(guān)基因的高效表達(dá)，提升油脂含量，用于生產(chǎn)生物柴油。具體的，本發(fā)明還提供了所述宿主細(xì)胞的制備方法，包括如下步驟：步驟1：獲得具有(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)所示的核苷酸序列中任意一個(gè)的啟動(dòng)子：(ⅰ)如seqidno:1所示；(ⅱ)與如seqidno:1所示序列具有至少70％同源性的序列；(ⅲ)如seqidno:1所示序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸獲得的核苷酸序列；步驟2：將步驟1獲得的所述dna分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；步驟3：利用含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞的油脂合成相關(guān)基因的高效表達(dá)，提升油脂含量，用于生產(chǎn)生物柴油。本研究發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子序列沒(méi)有任何文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)，在genbank等公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)也沒(méi)有任何注釋是啟動(dòng)子及何種特征的啟動(dòng)子。本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)并鑒定該啟動(dòng)子的功能、啟動(dòng)效率。本發(fā)明從三角褐指藻中克隆出基因pt48882的啟動(dòng)子：三角褐指藻預(yù)測(cè)蛋白基因的ppt48882啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因在三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)周期內(nèi)能高效表達(dá)，將其應(yīng)用于基因工程中，獲得的工程微藻藻株能夠顯著提高生物量。尤其是提高生物柴油的產(chǎn)率，顯著節(jié)約生產(chǎn)成本。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示重組載體圖譜；圖2示pcr驗(yàn)證結(jié)果，其中，tc是轉(zhuǎn)化藻，wt是野生藻；圖3示轉(zhuǎn)化藻gus染色圖，其中，1是對(duì)照藻，2是轉(zhuǎn)化藻；圖4示三角褐指藻染色后細(xì)胞形態(tài)圖，其中，a是野生藻，b是轉(zhuǎn)化藻；圖5示第一、四、八天野生藻和轉(zhuǎn)化藻gus染色效果，其中，第1、3、5為第一、四、八天野生藻，第2、4、6為第一、四、八天正常條件轉(zhuǎn)化藻；圖6示第一天rt-pcr分析結(jié)果；圖7示第四天rt-pcr分析結(jié)果；圖8示第八天rt-pcr分析結(jié)果；圖9示本發(fā)明提供的啟動(dòng)子。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種三角褐指藻基因pt48882高表達(dá)啟動(dòng)子。所述的三角褐指藻基因pt48882高表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，其核苷酸序列如seqidno.1所示。本發(fā)明的三角褐指藻基因pt48882，在genbank的基因組編號(hào)為phatrdraft_48882，本發(fā)明克隆該基因的預(yù)測(cè)編碼區(qū)的上游區(qū)域，命名為啟動(dòng)子ppt48882。其在微藻的生長(zhǎng)周期內(nèi)均可高效啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。本發(fā)明的三角褐指藻lhcf15基因高表達(dá)啟動(dòng)子位于三角褐指藻19號(hào)染色體上，全長(zhǎng)1103bp，在染色體上位置是：568482--569585。通過(guò)place(adatabaseofplantcis-actingregulatorydnaelements)和plantcare預(yù)測(cè)軟件對(duì)該啟動(dòng)子(1103bp)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動(dòng)子的基本組成元件tata-box、caat-box，且包含多個(gè)誘導(dǎo)元件，光誘導(dǎo)順式作用元件：-10promoterelement；光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件：t-box、gt-1box；熱誘導(dǎo)元件：ccaatbox；硫反應(yīng)核心元件：sure；質(zhì)體patpb基因啟動(dòng)子核心元件：boxii。其中，含有的特有元件選自3-af3bindingsite、box4、box-w1、p-box、tc-richrepeats、wbox。作為優(yōu)選，特有元件及其含有的個(gè)數(shù)如下所示：(括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為本發(fā)明提供的啟動(dòng)子中含有該特有元件的個(gè)數(shù))：3-af3bindingsite(1)、box4(1)、box-w1(1)、p-box(2)、tc-richrepeats(1)、wbox(1)。本專(zhuān)利把此啟動(dòng)子與報(bào)告基因gus連接，構(gòu)建到帶有抗性基因(博來(lái)霉素)的質(zhì)粒中，通過(guò)電擊等方法，把重組質(zhì)粒整合到三角褐指藻的基因組中，只需驗(yàn)證gus的表達(dá)即能驗(yàn)證啟動(dòng)子的啟動(dòng)效率。目前在轉(zhuǎn)基因植物中廣泛應(yīng)用的gus基因由大腸桿菌e.coli菌株k12中uida(也稱(chēng)gusa)基因座編碼。該基因編碼的β-葡萄糖苷酸酶，系統(tǒng)命名為β-d-glucuronideglucuronosohydrolase(ec3.2.1.31)。該酶是一種外切水解酶，能催化多種β-d-葡萄糖苷酸類(lèi)物質(zhì)水解為d-葡萄糖醛酸和糖苷配基。1987年jefferson等克隆了gus基因并進(jìn)行了測(cè)序，由此發(fā)展出用gus基因作為基因融合標(biāo)記的系統(tǒng)。由于在絕大多數(shù)植物的細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的gus活性，而且gus基因表達(dá)產(chǎn)物具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、易于定量及定位分析、可以與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)點(diǎn)，使得gus基因成為近年來(lái)在植物基因工程研究中應(yīng)用最為廣泛的報(bào)道基因之一。目前常用于gus組織化學(xué)定位的酶作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolylglucuronide,簡(jiǎn)稱(chēng)x-gluc)。這一底物能夠在酶活性位點(diǎn)形成藍(lán)色沉淀物。β-葡萄糖苷酸酶作用于x-gluc的初始產(chǎn)物為無(wú)色的吲哚衍生物，經(jīng)過(guò)氧化二聚化作用形成不溶解的5,5′-二溴-4,4′-二氯深色的靛藍(lán)色物質(zhì)，使得具有g(shù)us活性的部位呈現(xiàn)藍(lán)色。本發(fā)明的啟動(dòng)子ppt48882是三角褐指藻內(nèi)源啟動(dòng)子，啟動(dòng)lhcf15的表達(dá)，因此，本發(fā)明驗(yàn)證了在三角褐指藻一個(gè)生長(zhǎng)繁殖周期的正常條件和熱激后的啟動(dòng)子效率。分別利用gus染色組織染色法和實(shí)時(shí)熒光pcr(real-timeqpcr)方法來(lái)檢測(cè)該啟動(dòng)子的效率。real-timeqpcr就是在pcr擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)pcr進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在pcr擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。real-timeqpcr由于其操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)發(fā)展非常迅速。設(shè)在已經(jīng)涉及到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，比如基因的差異表達(dá)分析，snp檢測(cè)，等位基因的檢測(cè)，藥物開(kāi)發(fā)，臨床診斷，轉(zhuǎn)基因研究等。對(duì)rt-pcr產(chǎn)生的結(jié)果，分析時(shí)采用2-ct法，即按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：1.δct(目的基因ct—內(nèi)參ct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；2.δδct(待測(cè)樣品中目的基因δct—參照樣品中目的基因δct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；3.相對(duì)表達(dá)量(2-δδct)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種表達(dá)載體，其特征在于，含有上述三角褐指藻lhcf15基因ppt48882高表達(dá)啟動(dòng)子。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞，其特征在于，含有上述表達(dá)載體。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為三角褐指藻。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供上述啟動(dòng)子ppt48882在啟動(dòng)下游基因在三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)周期內(nèi)高效表達(dá)的應(yīng)用。所述的微藻優(yōu)選為三角褐指藻。所述的下游基因優(yōu)選為三角褐指藻基因pt48882。本研究發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子序列沒(méi)有任何文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)，在genbank等公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)也沒(méi)有任何注釋是啟動(dòng)子及何種特征的啟動(dòng)子。本發(fā)明為首次發(fā)現(xiàn)并鑒定該啟動(dòng)子的功能、啟動(dòng)效率。本發(fā)明從三角褐指藻中克隆出基因pt48882的啟動(dòng)子：三角褐指藻lhcf15基因ppt48882啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)下游基因在三角褐指藻的細(xì)胞生長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期內(nèi)均能高效表達(dá)，因此可將其應(yīng)用于基因工程中在基因工程中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明提供的一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1：?jiǎn)?dòng)子和gus基因的克隆首先，提取三角褐指藻的基因組dna，采用magene公司的植物dna提取試劑盒進(jìn)行。引物由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)page方法純化，使用時(shí)稀釋到100μm。啟動(dòng)子ppt48882在三角褐指藻dna中克隆，gus基因于通用載體pcambia1301(于上海捷蘭生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi))中克隆。其中克隆條件均采用pcr方法，使用kod-plus-neo酶(toyobo，japan)pcr獲得，啟動(dòng)子ppt48882及gus基因的pcr引物如表1所示，pcr反應(yīng)體系分別如表2和表3所示，三角褐指藻基因pt48882的啟動(dòng)子沒(méi)有確認(rèn)，本發(fā)明通過(guò)多個(gè)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)到ppt48882啟動(dòng)子的核心元件，并取其中1103bp為啟動(dòng)子區(qū)域，在此區(qū)域設(shè)計(jì)引物。表1.pcr引物表2.pcr反應(yīng)體系(20l)表3.gus基因pcr反應(yīng)體系(20l)反應(yīng)條件為：預(yù)變性：94℃,2min.通過(guò)place(adatabaseofplantcis-actingregulatorydnaelements)和plantcare預(yù)測(cè)軟件對(duì)上述克隆的序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列具有啟動(dòng)子的基本組成元件tata-box、caat-box，且包含多個(gè)誘導(dǎo)元件，光誘導(dǎo)順式作用元件：-10promoterelement；光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄元件：t-box、gt-1box；熱誘導(dǎo)元件：ccaatbox；硫反應(yīng)核心元件：sure；質(zhì)體patpb基因啟動(dòng)子核心元件：boxii。該序列被命名為啟動(dòng)子ppt48882。實(shí)施例2：構(gòu)建重組載體把上述克隆出來(lái)的啟動(dòng)子ppt48882、gus基因以及fcpa終止子(277bp，由上海生工生物有限公司合成)通過(guò)采用clonexpressmultisonestepcloning試劑盒(vazymebiotechco.,ltd，nanjing)同源重組的方法連接到含有博來(lái)霉素抗性表達(dá)盒的載體，含有博來(lái)霉素抗性表達(dá)盒的載體是由ppt-apcat載體(ppt-apcat載體的構(gòu)建步驟參考niu等，2011)把氯霉素抗性基因通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)基因工程手段替換成博來(lái)霉素基因獲得，得到含有啟動(dòng)子ppt48882和gus基因的重組表達(dá)載體(如圖1所示)。采用的試劑盒是諾唯贊生物科技有限公司的onestepcloningkit。實(shí)施例3：三角褐指藻轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化藻的篩選參考niu等(2012)的電擊方法把重組載體整合到三角褐指藻基因組中。通過(guò)4-5次博來(lái)霉素的篩選獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化藻。實(shí)施例4：轉(zhuǎn)化藻的驗(yàn)證第一步，在分子水平上驗(yàn)證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心5min收集，用pbs溶液清洗3次后用magene公司的植物dna提取試劑盒提取基因組dna，用gus-f引物(如seqidno.6所示，f:5’atgttacgtcctgtagaaa3’)和gus-r引物(如seqidno.7所示，r:5’tgtttgcctccctgctgcggt3’)進(jìn)行pcr，結(jié)果如圖2所示，第2列是轉(zhuǎn)化藻，第1列是野生型藻，轉(zhuǎn)化藻在大概1.8kb處有條帶，而野生型藻沒(méi)有，可知轉(zhuǎn)化藻中已含有g(shù)us基因。第二步，在表觀上驗(yàn)證，把100ml轉(zhuǎn)化藻和100ml野生型三角褐指藻3000g離心5min收集，藻沉淀用gus染色試劑盒37℃染色過(guò)夜，然后5000g離心棄上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脫30min，結(jié)果如圖3所示，1為對(duì)照藻，染色后無(wú)顏色變化，2為轉(zhuǎn)化藻，染色后形成藍(lán)色沉淀物，由此可知，轉(zhuǎn)化藻均能表達(dá)gus基因。第三步，從細(xì)胞形態(tài)上觀察。轉(zhuǎn)化藻通過(guò)gus染色后，取10μl的藻液置于倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖4所示。a為野生型的藻細(xì)胞沒(méi)有染上藍(lán)色，b為轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞整個(gè)細(xì)胞均染成藍(lán)色。實(shí)施例5：gus染色驗(yàn)證啟動(dòng)子效率對(duì)轉(zhuǎn)化藻的報(bào)告基因gus進(jìn)行表觀驗(yàn)證。將野生型藻和轉(zhuǎn)化藻分別放置在新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1x106個(gè)/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在2.2x108個(gè)。藻沉淀用gus染色試劑盒37℃染色過(guò)夜，然后5000g離心棄上清，加入1ml固定液(乙醇：乙酸＝3:1)洗脫30min后拍照。結(jié)果如圖5所示，由圖5可知，第一天轉(zhuǎn)化藻gus染色顯示最接近藍(lán)綠色，第四，第八天gus染色為藍(lán)色，推測(cè)原因是，在三角褐指藻生長(zhǎng)周期初期啟動(dòng)表達(dá)的gus基因效率相比后期不高，對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期啟動(dòng)效率最高。實(shí)施例6：rt-pcr檢測(cè)啟動(dòng)子效率本發(fā)明對(duì)轉(zhuǎn)化藻的報(bào)告基因gus進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量分析。野生型藻和轉(zhuǎn)化藻放置新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1x106個(gè)/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在3x108個(gè)。3000g離心5min，于-80°保存。采用omega公司的植物rna提取試劑盒獲得三角褐指藻的rna，takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。針對(duì)gus基因的特異引物f:5’gccaaaagccagacagagtg3’(如seqidno.8所示，)；r:5’tgacgaccaaagccagtaaag3’(如seqidno.9所示，)，用于實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。所用熒光探針sybrqpcrmix購(gòu)自takara公司，實(shí)驗(yàn)所用的檢測(cè)設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司的cfx96touchtm熒光定量pcr檢測(cè)系統(tǒng)。結(jié)果如圖6-8所示。由此可見(jiàn)，該啟動(dòng)子在三角褐指藻生長(zhǎng)周期內(nèi)都能高效啟動(dòng)目的基因表達(dá)，并且均能顯著性提高目的基因表達(dá)。實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果可知，ppt48882啟動(dòng)子在三角褐指藻生長(zhǎng)生長(zhǎng)周期內(nèi)均能高效啟動(dòng)基因的表達(dá)。實(shí)施例7對(duì)照組：beta-tubulin(tub)啟動(dòng)子；實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明提供的啟動(dòng)子ppt48882；分別將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的啟動(dòng)子構(gòu)建重組載體，制得轉(zhuǎn)化藻。轉(zhuǎn)化藻放置新的培養(yǎng)基中且藻密度控制在1×106個(gè)/ml，分別取第一天、第四天和第八天的微藻，微藻的數(shù)量控制在3×108個(gè)。3000g離心5min，于-80℃保存。采用omega公司的植物rna提取試劑盒獲得三角褐指藻的rna，takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。選用相應(yīng)的引物用于實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。所用熒光探針sybrqpcrmix購(gòu)自takara公司，實(shí)驗(yàn)所用的檢測(cè)設(shè)備為美國(guó)bio-rad公司的cfx96touchtm熒光定量pcr檢測(cè)系統(tǒng)。實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果見(jiàn)表4。表4實(shí)時(shí)定量pcr結(jié)果組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組第一天20.12162.80**第四天50.86483.66**第八天300.80753.35**注：與對(duì)照組相比，*示p＜0.05，**示p＜0.01.由表4結(jié)果可知，第一天、第四天和第八天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的啟動(dòng)子在三角褐指藻生長(zhǎng)周期內(nèi)都能高效啟動(dòng)目的基因表達(dá)，并且均能顯著性提高目的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，具有極顯著差異(p＜0.01)。實(shí)施例8對(duì)照組：beta-tubulin(tub)啟動(dòng)子；實(shí)驗(yàn)組：本發(fā)明提供的啟動(dòng)子ppt48882；分別將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的啟動(dòng)子構(gòu)建重組載體，制得轉(zhuǎn)化藻。利用對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組制得的微藻油脂合成相關(guān)基因的高效表達(dá)，提升油脂含量，，然后利用物理或化學(xué)方法把微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂轉(zhuǎn)化到細(xì)胞外，再進(jìn)行提煉加工，從而生產(chǎn)出生物柴油。結(jié)果如表5所示。表5生物柴油產(chǎn)量及成本組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組生物柴油的產(chǎn)率(％)10.2024.70*生物柴油相對(duì)產(chǎn)量12.86*注：與對(duì)照組相比，*示p＜0.05，**示p＜0.01.由表5結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)組的啟動(dòng)子在三角褐指藻生長(zhǎng)周期通過(guò)高效啟動(dòng)目的基因表達(dá)，顯著提高的生物柴油的產(chǎn)率，顯著節(jié)約了生產(chǎn)成本。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，均具有顯著差異(p＜0.05)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>暨南大學(xué)<120>一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用<130>mp1618582<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>1163<212>dna<213>人工序列<400>1gagtagatcaaacgtaaaggagaaataagagagaatctatttattacgtcttcttgatct60gagtagatcaaacgtaaaggagaaataagagagaatctatttattacgtctctgttgtca120gctagtaatcgtatatttatgtgaccaatttcttgatcttgatgctgcgttccttcgcgt180tcttcggaagtcctcctaacagtgaactccattcacatgtccatgttccctgccttttgt240gagctgtcgtatcgtaggttcgggccacacctatttacaattggcactatctagccgcta300ctagagagaggctttcgctataagcaatctccatagaatcggtatgaatccctttttcga360atcaatgtcataaaatcgtatatttatgtgaccaatttcttgatgttgacaccgcgttcc420tcgcgttctttggatatcctttagaatttcattcacaggtcaatgtccagtgcattttgt480gagctgtcgcaggttcgggttctacttatttacagtattgactagccaaccttgaggctt540tcgctgcgaccgttttacagcaatcagttttgattatgcgcattctccattaatctggta600tgattccctttttagaatcagtgtcattaaatcgtatgttcatgtgaccaatttcttgaa660gttgacaccgcgttccttcgcgttcttcggaaatcctcctgaatccattttcaaccccaa720gttccgtgccttttgtgagctgtcgtaggttcggctttacttatttaaaggaagcaatag780ccagcttaggctttcgctgcgactatttcacggcagtccttatgcttcaattgatctagc840ttgacagctcgacgcaactgtcgctgaatcttgatttacattagctctcaatttcgagtc900attagtgaaggtactggtacatcaatagttaattaagcaaaacaaattcctttgtattct960tactagctttccttcaacacattcgtccccaggatcttctcactggacttattgtcggag1020tctatcaaaaatacctgactgtgaatgacatgactgcgtgcactatattgaagttttcct1080tcaactgggatcctgaaaaagtcacgccaccgtgggaaccatgtatagcctgatttgccc1140aaagccccacagtgaattcgaag1163<210>2<211>47<212>dna<213>人工序列<400>2ctggaaagcgggcagtgagagtagatcaaacgtaaaggagaaataag47<210>3<211>37<212>dna<213>人工序列<400>3ttgttggtaattgttcttcgaattcactgtggggctt37<210>4<211>44<212>dna<213>人工序列<400>4aattacaatccagtggtaccatgttacgtcctgtagaaacccca44<210>5<211>39<212>dna<213>人工序列<400>5cgtccttgtagtccaggtgttgtttgcctccctgctgcg39<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6atgttacgtcctgtagaaa19<210>7<211>21<212>dna<213>人工序列<400>7tgtttgcctccctgctgcggt21<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8gccaaaagccagacagagtg20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9tgacgaccaaagccagtaaag21當(dāng)前第1頁(yè)12