本申請(qǐng)涉及微藻工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，具體而言，涉及高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻(haematococcuspluvialis)突變株及其應(yīng)用。

發(fā)明背景

血球藻是一種單細(xì)胞的淡水綠藻，隸屬于綠藻門(mén)(chlorophata)，綠藻綱(chlorophyeeae)，團(tuán)藻目(volvoeales)，血球藻科(haematoeoeeaceae)，血球藻屬(haematocoeeus)。血球藻是少數(shù)能夠在人工光生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的微藻之一。其中雨生血球藻(haematococcuspluvialis)，又稱雨生紅球藻，已經(jīng)成功用于商業(yè)規(guī)模的蝦青素生產(chǎn)。

蝦青素已經(jīng)被證實(shí)可以提高機(jī)體免疫力，防止紫外線(uv-a)對(duì)細(xì)胞的損傷，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，延滯衰老過(guò)程，預(yù)防心血管疾病，因此具有巨大的醫(yī)療應(yīng)用前景(hand,liy,huq.astaxanthininmicroalgae:pathways,functionsandbiotechnologicalimplications.algae,2013,28:131-147)。另外，蝦青素也是大馬哈魚(yú)(salmon)的色素主要成份。對(duì)于人工養(yǎng)殖的大馬哈魚(yú)等，需要在飼料中添加蝦青素以保證魚(yú)肉的鮮紅色澤。隨著這類經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，市場(chǎng)對(duì)蝦青素的需求量也迅速增長(zhǎng)。2013年，蝦青素作為魚(yú)飼料添加劑的銷售額已達(dá)五億美元。

本領(lǐng)域需要高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明人以雨生血球藻flotownies144為出發(fā)藻種，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘變，隨后利用本發(fā)明所建立的創(chuàng)造性的高通量篩選方法進(jìn)行篩選，獲得了蝦青素含量顯著提高的雨生血球藻突變株。

在一方面，本發(fā)明提供了一種高通量篩選高產(chǎn)蝦青素的微藻突變株的方法，所述方法包括：

a)對(duì)微藻的野生株或起始株進(jìn)行誘變處理；

b)在多孔板中培養(yǎng)經(jīng)誘變處理的野生株或起始株的單克隆藻株；

c)獲取經(jīng)培養(yǎng)的各單克隆藻株的圖像；

d)用圖像分析軟件對(duì)各單克隆藻株的顏色進(jìn)行分析，獲得r、g、b值；

e)根據(jù)下式計(jì)算出各單克隆藻株的redindex值：

f)將redindex值高于野生株或起始株的單克隆藻株鑒定為高產(chǎn)蝦青素的突變株。

在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明的方法篩選得到的高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻突變株。所述高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻(haematococcuspluvialis)包括于2015年12月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)保藏號(hào)為cgmccno.11806的c86，保藏號(hào)為cgmccno.11807的d154。

在另一方面，還提供了本發(fā)明的雨生血球藻突變株在制備蝦青素中的應(yīng)用。

在另一方面，還提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的雨生血球藻突變株的細(xì)胞和/或本發(fā)明的雨生血球藻突變株的提取物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.示出用不同濃度ems處理后雨生血球藻flotownies144的存活百分比。

圖2.示出初篩得到的76個(gè)突變株的熱圖及rindex值。

圖3.示出野生型和突變株c86、d154在高光脅迫培養(yǎng)不同天數(shù)的形態(tài)學(xué)變化。

圖4.示出野生型和突變株c86、d154在低光條件(第0-4天)和高光脅迫下(第5-8天)的生長(zhǎng)曲線。

圖5.示出野生型和突變株c86、d154在高光脅迫培養(yǎng)4天后的蝦青素含量(第8天，mg/mg干重)。

圖6.示出野生型和突變株c86、d154在高光脅迫培養(yǎng)不同天數(shù)的蝦青素產(chǎn)率(mg/l藻液/天)。

發(fā)明詳述

已有通過(guò)誘變并篩選高產(chǎn)蝦青素血球藻突變株的報(bào)道。然而這些報(bào)道是基于類胡蘿卜素生物合成抑制劑(cn101173214a)或顯微觀察(wo2006107736a1)的篩選方法，前者只能篩選出單一代謝途徑的突變株，而且必須在選擇壓力下進(jìn)行，后者依靠人工篩選，效率不高。

在本發(fā)明中，本發(fā)明人建立了一種高通量篩選高產(chǎn)蝦青素微藻的方法，所述方法能夠在全基因組水平上篩選由誘變?cè)斐傻耐蛔?，進(jìn)行無(wú)選擇壓力下的性狀篩選，并不限于具體的代謝途徑。

因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種高通量篩選高產(chǎn)蝦青素的微藻突變株的方法，所述方法包括：

a)對(duì)微藻的野生株或起始株進(jìn)行誘變處理；

b)在多孔板中培養(yǎng)經(jīng)誘變處理的野生株或起始株的單克隆藻株；

c)獲取經(jīng)培養(yǎng)的各單克隆藻株的圖像；

d)用圖像分析軟件對(duì)各單克隆藻株的顏色進(jìn)行分析，獲得r、g、b值；

e)根據(jù)下式計(jì)算出各單克隆藻株的redindex值：

f)將redindex值高于野生株或起始株的單克隆藻株鑒定為高產(chǎn)蝦青素的突變株。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述微藻是雨生血球藻。在一具體實(shí)施方式中，所述雨生血球藻是flotownies144藻株。

雨生血球藻flotownies144是一株廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)、應(yīng)用研究的雨生血球藻株系。flotownies144的特征是在低光、營(yíng)養(yǎng)充足的條件下，群體中以綠色的游泳細(xì)胞為主，當(dāng)細(xì)胞暴露于強(qiáng)光或營(yíng)養(yǎng)缺陷條件進(jìn)行環(huán)境脅迫誘導(dǎo)時(shí)，游泳細(xì)胞開(kāi)始積累蝦青素，形成紅色的游泳細(xì)胞。然而，nies144本身色素含量不高，每單位細(xì)胞干重的蝦青素含量較低，限制了該藻株在生產(chǎn)中的應(yīng)用。在一具體的實(shí)施方式中，通過(guò)利用本發(fā)明的高通量篩選方法，本發(fā)明人以雨生血球藻flotownies144為出發(fā)藻株，篩選到高產(chǎn)蝦青素的突變株。

在一些實(shí)施方式中，所述方法步驟a)中所述誘變是化學(xué)誘變?nèi)鏴ms誘變，或是輻射誘變?nèi)缱贤饩€誘變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，其他的誘變方法也可應(yīng)用于本發(fā)明。例如使用mnng、ntg誘變劑進(jìn)行誘變，或者可以使用根瘤農(nóng)桿菌或基因槍轟擊方法獲得經(jīng)誘變的群體?；蛘撸部梢允褂貌煌T變方法的組合。

本發(fā)明中，經(jīng)誘變的微藻可以使用自動(dòng)化高通量挑選儀器例如qpix450(moleculardevice,usa)挑選單克隆藻株。單克隆藻株可以在多孔板中培養(yǎng)。例如，可以在96孔板或384孔板或q-tray板中進(jìn)行所述單克隆藻株的培養(yǎng)。所述培養(yǎng)可以在液體培養(yǎng)基中或固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，優(yōu)選在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行。

在一些實(shí)施方式中，所述方法步驟b)中所述培養(yǎng)包括將所述單克隆藻株置于脅迫條件下培養(yǎng)以誘導(dǎo)蝦青素的積累。能夠誘導(dǎo)蝦青素積累的脅迫條件包括例如高光照、高鹽、高溫或營(yíng)養(yǎng)缺乏。

在一具體實(shí)施方式中，使用高光照脅迫條件誘導(dǎo)藻株的蝦青素積累。所述高光照脅迫條件例如是100-200μmolm^-2s^-1，優(yōu)選150μmolm^-2s^-1的光照強(qiáng)度。

在一些實(shí)施方式中，在非脅迫條件下培養(yǎng)所述菌株一段時(shí)間，例如0、1、2、3、4、5天后，使得藻株充分生長(zhǎng)后再進(jìn)行脅迫培養(yǎng)。所述非脅迫條件例如是5、10、15、20、25μmolm^-2s^-1的光照強(qiáng)度。所述脅迫培養(yǎng)進(jìn)行例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天。

在一些實(shí)施方式中，單克隆藻株的圖像使用例如chemidoc^tmmp成像系統(tǒng)(biorad,usa)獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以使用任何能夠獲得電子圖像如熱圖的系統(tǒng)。對(duì)圖像進(jìn)行顏色分析獲得r、g、b值的軟件也是本領(lǐng)域可獲得的，例如getrgb軟件。通過(guò)圖像顏色分析使得可以容易地進(jìn)行高通量篩選。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述方法還包括，

g)確定所述突變株的蝦青素含量。

測(cè)定蝦青素的方法是本領(lǐng)域已知的，例如通過(guò)hplc進(jìn)行所述測(cè)定。蝦青素含量高于野生株或起始株的突變株最終確定為高產(chǎn)蝦青素突變株。

在另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明上述方法獲得的高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻突變株。

在一些實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻突變株，其蝦青素含量相對(duì)于野生型提高50-100％。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的高產(chǎn)蝦青素的雨生血球藻突變株衍生自雨生血球藻flotownies144。

在具體的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法篩選到2個(gè)高產(chǎn)蝦青素雨生血球藻突變株，其中藻株c86以保藏號(hào)cgmccno.11806，d154以保藏號(hào)cgmccno.11807，于2015年12月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涵蓋本發(fā)明的雨生血球藻突變株在制備蝦青素中的應(yīng)用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涵蓋一種組合物，其包含本發(fā)明的雨生血球藻突變株的細(xì)胞和/或本發(fā)明的雨生血球藻突變株的提取物。在一些實(shí)施方式中，所述雨生血球藻突變株的提取物包含蝦青素。在一些實(shí)施方式中，所述組合物是藥物組合物、食品組合物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或飼料。

實(shí)施例

下面將通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所描述的實(shí)施例范圍中。

實(shí)施例1.血球藻的化學(xué)誘變

雨生血球藻flotownies144(購(gòu)自日本國(guó)立環(huán)境研究所)培養(yǎng)方法如下：將生長(zhǎng)在固體basal培養(yǎng)基上的單克隆藻落挑入裝有10ml培養(yǎng)基的50ml三角瓶中培養(yǎng)10天，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到3×10⁵/ml時(shí)，轉(zhuǎn)接至裝有100ml培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，接種量為3×10⁴/ml，待細(xì)胞數(shù)生長(zhǎng)到3×10⁵/ml時(shí)(大約3-4天)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)溫度為21℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為15μmolm^-2s^-1。basal培養(yǎng)基配方為14.6mm醋酸鈉、2.7mml-天冬酰胺、2g/l酵母提取物、0.985mmmgcl2、0.135mmcacl2、0.036mmfeso4，ph6.8(kobayashi,m.,kakizono,t.&nagai,s.(1991).astaxanthinproductionbyagreenalga,haematococcuspluvialisaccompaniedwithmorphologicalchangesinacetatemedia.j.ferment.bioeng.,71:335–339)。

取一定量對(duì)數(shù)期的雨生血球藻flotownies144藻液，通過(guò)離心收集藻體，得到的藻細(xì)胞沉淀用不同濃度的甲磺酸乙酯(ems)溶液處理，ems濃度為：0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，0.9％，1.0％，1.2％，1.4％，1.6％，1.8％，2.0％(w/v)，處理時(shí)間為一個(gè)小時(shí)。ems溶液的配制需用0.2m的磷酸緩沖液進(jìn)行逐級(jí)稀釋配制。反應(yīng)結(jié)束后加入10％na2s2o3終止反應(yīng)，再用新鮮培養(yǎng)基將殘留的na2s2o3洗去。處理完成后，加入一定量的新鮮培養(yǎng)基避光培養(yǎng)24小時(shí)后涂布于固體培養(yǎng)基上，接種量為1×10⁵/平板。待克隆長(zhǎng)出計(jì)算每個(gè)ems濃度下藻細(xì)胞的萌發(fā)率。萌發(fā)率結(jié)果如圖1所示。通過(guò)以上結(jié)果得知在不同濃度ems處理下雨生紅球藻flotownies144的萌發(fā)率并沒(méi)有明顯規(guī)律，最終將ems濃度定為1％(w/v)，處理時(shí)間為1小時(shí)。

實(shí)施例2.高產(chǎn)蝦青素突變株的篩選

2.1.基于rindex的高通量篩選

取一定量實(shí)施例1中用1％(w/v)ems處理1小時(shí)的雨生血球藻藻液涂布于固體培養(yǎng)基上，接種量為1×10⁵/平板。待兩周后，將長(zhǎng)出的單克隆用高通量挑選儀器qpix450(moleculardevice,usa)挑出到96孔板中，培養(yǎng)溫度為21℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為15μmolm^-2s^-1。

將上述96孔板中長(zhǎng)出的藻液點(diǎn)陣到裝有固體basal培養(yǎng)基的q-tray板上，點(diǎn)樣體積為2μl，放入培養(yǎng)溫度為21℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為15μmolm^-2s^-1的培養(yǎng)架上培養(yǎng)兩天后，將光照強(qiáng)度調(diào)為150μmolm^-2s^-1，脅迫五天。通過(guò)chemidoc^tmmpimagingsystem(biorad,usa)得到每個(gè)藻落的熱圖；用getrgb軟件對(duì)每個(gè)藻落的顏色進(jìn)行分析；根據(jù)下式計(jì)算出每個(gè)藻落的redindex值：

初步篩選出76個(gè)突變株。76個(gè)突變株熱圖及rindex值(如圖2所示)。

2.2.基于分光光度法的篩選

將以上的到的76株突變體以相同的細(xì)胞數(shù)接種于250ml三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，先于低光條件下培養(yǎng)四天，培養(yǎng)溫度為21℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為15μmolm^-2s^-1，再于光照強(qiáng)度為150μmolm^-2s^-1的高光條件下脅迫培養(yǎng)三天，從第四天起，每天通過(guò)分光光度計(jì)法測(cè)定其色素含量。

分光光度計(jì)法測(cè)色素：每天取樣1ml，離心收集后加入1mldmso混勻，靜置30min后離心收集上清。反復(fù)4-5次直至沉淀變?yōu)槿榘咨ㄟ^(guò)分光光度計(jì)測(cè)定上清在665nm、649nm以及480nm處的吸光度。

用以上得到的吸光度計(jì)算出每突變株的單細(xì)胞總類胡蘿卜素含量，計(jì)算方法為：ca＝12.19a665－3.45a649，cb＝21.99a649－5.32a665，cx+c＝(1000a480－2.14ca－70.16cb)/220(μg/ml)；單細(xì)胞總類胡蘿卜素含量為cx+c/細(xì)胞數(shù)(ca：葉綠素a；cb：葉綠素b；cx+c：總類胡蘿卜素)。以此方法篩選出2株單細(xì)胞色素含量明顯高于野生型的突變株：c86、d154。

所篩選到的雨生血球藻藻株c86以保藏號(hào)cgmccno.11806，d154以保藏號(hào)cgmccno.11807于2015年12月4日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)。

本發(fā)明的上述方法可用于高通量篩選高產(chǎn)蝦青素的微藻突變株。

實(shí)施例3.高產(chǎn)蝦青素突變株的培養(yǎng)及蝦青素含量測(cè)定

將實(shí)施例2得到的2個(gè)突變株以相同的細(xì)胞數(shù)接種于250ml三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。先于低光條件下培養(yǎng)4天，培養(yǎng)溫度為21℃，連續(xù)光照強(qiáng)度為15μmolm^-2s^-1，再于光照強(qiáng)度為150μmolm^-2s^-1的高光條件下脅迫培養(yǎng)4天。每天取10ml藻液進(jìn)行真空膜過(guò)濾(glassmicrofibrefilter,696,vwr)，再用相同體積的碳酸氫銨(0.5moll^-1)溶液沖洗膜兩次。隨后把膜放入烘箱100℃烘干至恒重，濾膜的增量即為細(xì)胞干重。從第四天起每天觀察細(xì)胞形態(tài)。再將第4天、第6天及第8天的藻樣，通過(guò)hplc進(jìn)行蝦青素含量測(cè)定。色素提取的具體方法如下：

1.取60ml藻液用磷酸緩沖液離心去鹽，收集細(xì)胞沉淀，用液氮速凍后放入冷凍干燥機(jī)中過(guò)夜干燥成藻粉。

2.稱取5mg上述得到的藻粉，在預(yù)冷的研缽中用液氮研磨，加入提取液甲醇:二氯甲烷(3:1)將研缽中的色素溶出，離心收集上清，反復(fù)數(shù)次直至沉淀變?yōu)槿榘咨?/p>

3.將上述得到的色素上清通過(guò)氮?dú)獯蹈珊?，?fù)溶到相同體積的提取液中，用hplc進(jìn)行蝦青素的測(cè)定。hplc測(cè)定條件如下：

alliance^tm高效液相色譜儀，配光電二極管陣列檢測(cè)器(hplc-pda，waters公司)。色譜柱：symmetryc18(4.6mm×150mm，5μm)。流動(dòng)相：a相為二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(5:85:5.5:4.5，v/v)，b相為二氯甲烷:甲醇:乙腈:水(25:28:42.5:4.5，v/v)。梯度洗脫程序：0.0-8.0min，0％b；8.0-14.0min，0％–100％b；14.0-28.0min，100％b；28.0-30.0min，100％-0b；30.0-35.0min，0％b。流速：1.0ml/min。進(jìn)樣量：10μl。柱溫：35℃。檢測(cè)波長(zhǎng)：250-700nm，以480nm為類胡蘿卜素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

兩個(gè)突變株c86、d154及野生型在第4、6和第8天的形態(tài)圖像見(jiàn)圖3。從圖中可見(jiàn)兩個(gè)突變體c86、d154在第6天(高光脅迫后的第2天)即全部轉(zhuǎn)化為紅色厚壁孢子(呈圓形)，而野生型大多數(shù)細(xì)胞仍然為游動(dòng)細(xì)胞。

兩個(gè)突變體c86、d154及野生型干重增長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。圖中可見(jiàn)突變體d154的生長(zhǎng)速率與野生型基本相同。

兩個(gè)突變株c86、d154的蝦青素含量參見(jiàn)圖5，產(chǎn)率參見(jiàn)圖6。從圖中可見(jiàn)，本發(fā)明所獲得的2個(gè)雨生血球藻突變株的蝦青素含量顯著高于野生型。