本發(fā)明屬于生物化學領域，涉及一種蛋白酶，具體來說是一種雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶及其制備方法和用途。

背景技術：

心腦血管疾病(cardiovascularandcerebrovasculardiseases)是一種嚴重威脅人類，血栓性疾病屬于心腦血管疾病，已經(jīng)成為嚴重危害人類生命健康的“頭號殺手”?？刂菩哪X血管疾病蔓延已經(jīng)成為我國21世紀提高人民健康生活水平的重中之重。國內(nèi)外臨床常用的溶栓藥有尿激酶(urokinase,uk)、鏈激酶(streptokinase,sk)、葡激酶(staphylokinase,sak)、組織型纖溶酶原激活劑(tissuetypeplasminogenactivator,t-pa)、蛇毒降纖酶類(東菱迪芙酶、蝮蛇抗栓酶)及婦激酶(lumbrokinase,lk)等，t-pa價格昂貴，uk出血副作用非常大，其余藥物也有諸如需要的劑量大、溶解纖維蛋白特異性較低、出血副作用大、溶易再堵塞、毒性大、分子量大等缺點。所以，從各種天然生物資源中尋找和研發(fā)溶解纖維蛋白特異性高、出血副作用小及相對較便宜的具有我國自主知識產(chǎn)權的溶栓藥物已經(jīng)成了當務之急。

雙齒圍沙蠶為屬于環(huán)節(jié)動物門(annelida)，多毛綱(polychaeta)，沙蠶目(nereididae)，沙蠶科(nereididae)。我國是世界上最早記述沙蠶的國家之一，典籍中有海蟲、海蠶、沙蠶、鳳腸、龍腸和禾蟲等的記載。古書中記載的多味食補，現(xiàn)代主要用于抗血栓形成、抗腫瘤、提高免疫力、殺傷白血病腫瘤細胞及改善貧血作用。雙齒圍沙蠶是一種海洋生物，在我國沿海分布極為廣泛，資源十分豐富，多數(shù)用來作為魚蝦飼料，并未得到充分利用，造成了極大的資源浪費。從其體內(nèi)分離的活性物質(zhì)可具備海洋生物活性物質(zhì)的特點，即生物活性高、穩(wěn)定性強、分子量小。從雙齒圍沙蠶體內(nèi)提取的新型纖溶酶可充分利用我國海洋資源，且有可能發(fā)展成為新一代抗血栓藥物。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶及其制備方法和用途，所述的這種雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶及其制備方法和用途解決了現(xiàn)有技術中的溶解纖維蛋白特異性較低、出血副作用大、容易再堵塞、毒性 大、分子量大、價格昂貴的技術問題。

本發(fā)明提供了一種雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶，含有seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4所示的氨基酸序列。

進一步的，所述的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶的分子量為30.3kda；所述的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶的等電點為5.28；；纖溶活性為10000±1000u/mg。

進一步的，在所述的seqidno：1中，所述的蛋氨酸被氧化修飾過，在所述是seqidno：2中，所述的蛋氨酸被氧化修飾過。

本發(fā)明還提供了上述的一種雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶的制備方法，包括如下步驟：

1)將干品或鮮品雙齒圍沙蠶使用緩沖液浸泡后勻漿，自溶1～8小時，進行離心，收集上清液，得酶粗提液；

2)將粗酶提取液采用飽和硫酸銨溶液進行鹽析，獲得沉淀蛋白；

3)將步驟2)中的沉淀蛋白用緩沖液復溶后，離心配制成上樣樣品；

4)將高分離度凝膠層析柱用緩沖液平衡后，將步驟3)中的樣品用上樣緩沖液洗脫，收集的活性部位再用超濾濃縮脫鹽或凝膠柱層析脫鹽；

5)將高分辨離子交換層析柱用tris-hcl緩沖溶液或pb緩沖溶液平衡平衡，將步驟4)中收集的樣品上樣，用含有0-1m氯化鈉的緩沖液洗脫，收集的活性部位用超濾濃縮脫鹽或凝膠柱層析脫鹽；

6)采用高分辨率聚丙酰胺凝膠進一步純化步驟5)中的樣品，得到雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶。

進一步的，所述的高分離度凝膠層析柱為sephadex-g75層析柱，所述的高分離度凝膠層析柱為deaesepharosefastflow層析柱，所述的高分辨率聚丙酰胺凝膠采用質(zhì)量百分比濃度為10～15％聚丙酰胺凝膠。

進一步的，步驟1)中干品雙齒圍或鮮品雙齒圍的自溶時間為3-6h。

進一步的，步驟1)、3)、4)、5)中所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷緩沖液；步驟4)中所述的上樣緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、tris-hcl緩沖液或磷酸鹽緩沖液平衡。

進一步的，步驟2)中，先用飽和硫酸銨溶液沉淀一次除去雜蛋白，沉淀后的硫酸銨溶液的終濃度為10％-20wt％，然后再用飽和硫酸銨溶液沉淀，沉淀后 的硫酸銨溶液的終濃度為50％或60wt％，得到粗蛋白沉淀。

進一步的，步驟4)、5)中除鹽用sephadex-g25或截流分子量為3kda、5kda或10kda超濾離心管，步驟5)中緩沖鹽梯度洗脫時采用0-0.6m的氯化鈉溶液。

本發(fā)明還提供了上述的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶在用于制備溶栓藥物中的用途。

本發(fā)明還提供了上述的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶在降解纖維蛋白原aα、bβ、γ鏈中的用途。

本發(fā)明的纖溶蛋白酶具有如下生化特性：

(1)該成分的分子量為33.03kda；

(2)該成分的等電點為5.28；

(3)sds-page電泳顯示條帶為單一條帶；

(4)高效液相凝膠過濾色譜為單一峰；

(5)氨基酸序列為：

1)ttm(oxidation)yeaaar，

2)atylgm(oxidation)vtglgtsgnk，

3)ytsagysvagthr，

4)afagldssgldgvaatk；

(6)具有降解纖維蛋白原α、β、γ鏈的作用；

(7)該蛋白酶最適宜溫度為60℃；

(8)該蛋白酶最適宜ph為10左右。

本發(fā)明利用凝膠層析柱將具有纖溶活性的組分捕獲，再利用高分辨離子層析進一步細分，最后利用電泳法精制，該方法操作簡單，重復性好，易放大，用于工業(yè)生產(chǎn)制備溶栓藥物。用該法獲得的纖溶酶到達電泳純，用等電點聚焦分析得等電點為5.28，纖溶活性高，可達到10000±1000u/mg(蚓激酶單位)。本發(fā)明可用于治療血栓疾病的原料藥。

本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發(fā)明采用硫酸銨的分級鹽析，陰離子交換層析、凝膠過濾層析以及電泳制備結合，純化得到一種電泳純的纖溶蛋白酶。其使用的層析介質(zhì)具有載量大，重復使用等特點。用本發(fā)明方法可 制得纖溶活性高且純度高的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶。而且本發(fā)明的方法操作簡便，可控。

附圖說明

圖1是對分離純化得到的雙齒圍纖溶蛋白酶進行sds-page電泳的電泳圖。

圖2是采用高效液相凝膠過濾色譜法對純化后的纖溶活性液進行純度檢測的結果

圖3采用過多功能平板等電聚焦系統(tǒng)對雙齒圍沙蠶纖溶酶進行電泳的電泳圖。

圖4顯示了雙齒圍沙蠶纖溶酶的部分蛋白質(zhì)序列。

圖5顯示了雙齒圍沙蠶纖溶酶的纖溶活性。

圖6顯示了雙齒圍沙蠶纖溶酶水解纖維蛋白原各亞基的情況。

圖7顯示了溫度對酶活性的影響。

圖8顯示了ph對酶活性的影響。

具體實施方式

本發(fā)明涉及制備雙齒圍纖溶蛋白酶所用的層析介質(zhì)均來自ge公司。

實施例1

取2.5kg雙齒圍沙蠶干燥體，加入10倍體積ph7.420mm磷酸鹽緩沖液勻漿，室溫放置4h自溶，離心后用飽和硫酸銨10％-50％分級鹽析，離心后收集活性部分，用緩沖液復溶，上樣于ph7.420mm磷酸鹽緩沖液平衡后的sephadex-g75層析柱，用ph7.420mm磷酸鹽緩沖液洗脫，紫外波長280nm檢測流份吸收值，分部收集主要纖溶活性部位后，用sephadex-g25層析柱脫鹽，冷凍干燥濃縮。用ph7.420mm磷酸鹽緩沖液復溶樣品，上樣于ph7.420mm磷酸鹽緩沖液平衡后的deaesepharosefastflow層析柱，用含有0-0.6m的氯化鈉的緩沖液洗脫，收集主要活性部分，脫鹽濃縮后用10％聚丙酰胺凝膠進一步純化，收集的目標條帶用電透析的方法回收目的蛋白。

實施例2

取2.5kg雙齒圍沙蠶干燥體，加入10倍體積ph7.420mm磷酸鹽緩沖液勻 漿，室溫放置6h自溶，離心后用飽和硫酸銨10％-50％分級鹽析，離心后收集活性部分，用緩沖液復溶，上樣于ph7.420mm磷酸鹽緩沖液平衡后的sephadex-g75層析柱，用ph7.420mm磷酸鹽緩沖液洗脫，紫外波長280nm檢測流份吸收值，分部收集主要纖溶活性部位后，用5kda超濾離心管脫鹽濃縮。用ph7.420mm磷酸鹽緩沖液復溶樣品，上樣于ph7.420mm磷酸鹽緩沖液平衡后的deaesepharosefastflow層析柱，用含有0-0.6m的氯化鈉的緩沖液洗脫，收集主要活性部分，用5kda超濾離心管脫鹽脫鹽濃縮后用10％聚丙酰胺凝膠進一步純化，收集的目標條帶用電透析的方法回收目的蛋白。

實施例3

取2.5kg雙齒圍沙蠶干燥體，加入10倍體積ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液勻漿，室溫放置6h自溶，離心后用飽和硫酸銨20％-60％分級鹽析，離心后收集活性部分，用緩沖液復溶，上樣于ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡后的sephadex-g75層析柱，用ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗脫，紫外波長280nm檢測流份吸收值，分部收集主要纖溶活性部位后，用sephadex-g25層析柱脫鹽，冷凍干燥濃縮。用ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液復溶樣品，上樣于ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡后的deaesepharosefastflow層析柱，用含有0-0.6m的氯化鈉的緩沖液洗脫，收集主要活性部分，脫鹽濃縮后用10％聚丙酰胺凝膠進一步純化，收集的目標條帶用電透析的方法回收目的蛋白。

實施例4

取2.5kg雙齒圍沙蠶干燥體，加入10倍體積ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液勻漿，室溫放置6h自溶，離心后用飽和硫酸銨20％-60％分級鹽析，離心后收集活性部分，用緩沖液復溶，上樣于ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡后的sephadex-g75層析柱，用ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液洗脫，紫外波長280nm檢測流份吸收值，分部收集主要纖溶活性部位后，用5kda超濾離心管脫鹽濃縮。用ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液復溶樣品，上樣于ph7.420mm三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡后的deaesepharosefastflow層析柱，用含有0-0.6m的氯化鈉的緩沖液洗脫，收集主要活性部分，用5kda超濾離心管脫鹽脫鹽濃縮后用15％聚丙酰胺凝膠進一步純化，收集的目標條帶用電 透析的方法回收目的蛋白。

實施例5

對實施例1中分離純化得到的雙齒圍纖溶蛋白酶的鑒定如下：

(1)sds-page電泳檢測

配制15％的聚丙烯酰胺凝膠的分離膠，濃縮層濃度為5％，厚度為1.0mm。將樣品加入非變性上樣緩沖液溴酚藍混勻后沸水浴5min，離心(10000g·min^-1，30sec)后上樣10μl，并在最左邊泳道加入mark，然后立即電泳。電壓條件：濃縮層為80v電壓，等樣品到達分離膠后調(diào)為120v電壓，當電泳至底部時，停止電泳，取下凝膠，用考馬斯亮藍染色15min，再用脫色液將凝膠脫色至無背景顏色。電泳圖如圖1，sds-page電泳顯示條帶為單一條帶，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量marker的遷移率計算，求得方程式y(tǒng)＝-0.783x+1.9126(y代表marker分子量的對數(shù)，x代表相對遷移率rf)，r²＝0.9923，計算得出其分子量為33.03kda。

(2)高效液相色譜檢測

采用高效液相凝膠過濾色譜法(hplcgel-filtration)，對純化后的纖溶活性液進行純度檢測，色譜柱：shodexks804-802串聯(lián)，柱溫：室溫流動相：20mmpb+0.15mnacl(ph7.0)，檢測波長：280nm，流速：1.0ml·min^-1等度洗脫。結果見圖2，色譜為單一峰。

(3)等電點測定

采用過多功能平板等電聚焦系統(tǒng)(gehealthcaremμltiphorⅱ)電泳，按照電壓500v，電流50ma，功率為每1cm凝膠1w的電泳條件，電泳20分鐘，之后設置電壓2000v，電流50ma，功率為每1cm凝膠1w，再電泳90分鐘，之后用imagequanttlversion7.0軟件分析供試品的等電點，凝膠中只單一蛋白電泳點，根據(jù)pimarker的遷移率計算其等電點。結果見圖3，該成分的等電點為5.28。

(4)denovo測序

采用tripetof5600pluslc-ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜儀對上述實施例純化的雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶(fpa)進行denovo測序，將質(zhì)譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)利用proteinpilot4.5軟件檢索，檢索數(shù)據(jù)庫為ncbin全物種數(shù)據(jù)庫，對于數(shù)據(jù)庫檢索不成功的主要圖譜，denovo解析了部分主要峰的氨基酸序列，denovo方法基本過程為：將 lc-ms/ms二級圖譜導入analysttf1.6(absciex)軟件，利用bioexplore下的sequencepeptide工具進行denovo輔助分析，解析的序列再人工確認，主要依據(jù)b+y＝p(precusorion)+1公式，得到各個氨基酸的主要b、y離子質(zhì)量數(shù)，解析出部分特異性的蛋白質(zhì)序列。結果見圖4。

a顯示了其氨基酸序列為：ttm(oxidation)yeaaar；

b顯示了其氨基酸序列為：atylgm(oxidation)vtglgtsgnk；

c顯示了其氨基酸序列為：ytsagysvagthr；

d顯示了其氨基酸序列為：afagldssgldgvaatk。

(5)纖溶活性測定

采用體外平板纖溶法測定纖溶活性：牛血纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液制成半透明凝固體。不同濃度尿激酶，及各個純化過程中收集的溶液加樣于平板中，加蓋，37℃孵育5-12h，測溶圈直徑。結果見圖5，其中，1:uk5000iu/ml；2:uk2500iu/ml；3:uk1250iu/ml；4:uk625iu/ml；5:uk125iu/ml；6:uk62.5iu/ml；7:31.25iu/ml；8：粗提液；9：鹽析后的粗酶；10：sephadex-g75；11：deae-sepharose-ff；12：native-page；13：生理鹽水。經(jīng)過native-page純化后的蛋白酶活性可達10970.23u/mg(蚓激酶單位)。

(6)纖維蛋白原水解活性的測定

采用sds-page電泳法分析雙齒圍沙蠶纖溶酶水解纖維蛋白原。具體方法：1mg牛血纖維蛋白原和0.5μg純化的雙齒圍沙蠶纖溶酶溶解在1ml20mmtris–hcl(ph7.4)緩沖液中，37℃恒溫孵育，在不同的時間間隔(0、1、10、30、60、120、180、300min)取出50μl進行sds-page電泳分析(5％濃縮膠、10分離膠)，觀察雙齒圍沙蠶纖溶酶水解纖維蛋白原各亞基的情況。結果見圖6。從圖6可看出，牛血纖維蛋白原的aα鏈在與雙齒圍沙蠶纖溶酶作用1min，就被其完全水解；bβ鏈逐漸被水解，在30min內(nèi)水解完全；γ鏈是最后被水解的，在作用300分鐘時，被完全水解。這些結果說明，雙齒圍沙蠶纖溶酶具有降纖作用，而且水解纖維蛋白原各亞基的速度由快到慢的順序為aα鏈，bβ鏈和γ鏈。

(7)溫度對酶活性的影響

20μl的0.1g·l-1雙齒圍沙蠶纖溶酶在不同溫度(10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)恒溫孵育1小時，然后采用偶氮酪蛋白(azocasein)水解法檢測酶的殘余活性，繪制曲線，確定酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性。

雙齒圍纖溶酶活性在10℃～80℃間時，酶的活性隨著溫度的增加活性也逐漸增強，當溫度超過60℃以后，酶的活性隨著溫度的增加活性逐漸減弱，溫度在40℃～70℃之間，酶仍具有較高活性，說明其具有較好的溫度穩(wěn)定性，溫度在60℃時酶的活性最強，結果見圖7。

(8)ph對酶活性的影響

取20μl的0.1g·l^-1雙齒圍沙蠶纖溶酶在不同ph的緩沖液(3、4、5、6、7、8、9、10、11)中，在37℃下作用1.5小時后，采用偶氮酪蛋白水解法分別檢測殘余蛋白酶活性，確定最適ph及ph穩(wěn)定性。ph3-6選用50mm的醋酸鹽緩沖液，ph7-9選用50mm的tris–hcl緩沖液，ph10-11選用50mm的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

在比較寬的ph范圍內(nèi)(4-11)雙齒圍沙蠶纖溶蛋白酶都具有較高的活性，具有較的ph穩(wěn)定性。由于酶的最大活性集中在堿性條件下(ph7-11)，說明該纖溶酶是一種堿性蛋白酶，最適宜ph為10，結果見圖8。