本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2004年12月1日、發(fā)明名稱為“液體因子vii組合物的病毒過(guò)濾”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)no.200480035708.5的分案申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及用于改善液體因子vii組合物、特別是那些包含活性因子vii多肽(因子viia多肽)的組合物的病毒安全性的新型方法。

發(fā)明背景

已經(jīng)確定了參與血液凝固過(guò)程的多種因子，包括因子vii(fvii)，一種血漿糖蛋白。止血是通過(guò)在血管壁損傷之后暴露于循環(huán)血液的組織因子(tf)與在循環(huán)中存在的因子viia(其在循環(huán)中的量占總因子vii蛋白量的大約1％)之間形成復(fù)合物起始的。因子vii在血漿中主要以單鏈的酶原形式存在，酶原被因子xa切割成為雙鏈、活性形式的因子viia。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出重組的活化因子viia(rfviia)作為止血促進(jìn)劑。rfviia的給藥為具有出血的血友病受治療者提供了迅速和高效的促凝血應(yīng)答，由于抗體形成，所以不能使用其他的凝血因子產(chǎn)物對(duì)這些受治療者進(jìn)行治療。而且，可以使用因子viia成功治療在有因子vii缺陷的受治療者或者具有正常凝血系統(tǒng)但是出現(xiàn)過(guò)度出血的受治療者中的出血。

對(duì)因子vii的純化和處理必須要小心，原因是該分子具有降解的可能性。因子vii和因子viia是大分子(分子量大約是50kd)，易于受到由于在純化和過(guò)濾中的剪切力造成的機(jī)械降解。而且，因子viia是活性的蛋白水解酶，它降解其他蛋白質(zhì)，包括因子viia。因子viia的降解主要包括因子viia重鏈中的切割，特別是在該分子中的第290和315位氨基酸處。最后，因子vii和因子viia中的甲硫氨酸殘基可能會(huì)被氧化。

本發(fā)明的目的是提供從液體因子vii組合物中去除病毒或者使病毒失活的方法，通過(guò)這個(gè)方法，因子vii組分的完整性基本上得到保持。

wo96/00237公開(kāi)了含有大分子(例如蛋白質(zhì)，如血漿蛋白因子ix)的溶液的病毒過(guò)濾的方法。

wo98/37086公開(kāi)了使用具有平均孔徑大小為15nm的膜通過(guò)納濾(nanofiltration)從血漿來(lái)源的蛋白質(zhì)溶液中除去病毒。

tomokiyo等,voxsanguinis,2003,84,54-64公開(kāi)了人血漿衍生的活化因子vii濃縮物的大規(guī)模制備。該制備方法包括對(duì)包含無(wú)活性因子vii的溶液進(jìn)行病毒過(guò)濾的步驟。

發(fā)明概述

在廣義的方面，本發(fā)明涉及去除因子vii組合物中的病毒和/或使其失活的方法。如這里所使用的，術(shù)語(yǔ)“病毒”指的是任何超顯微的感染性物質(zhì)，它們只能在活宿主的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制，或者是指來(lái)自感染性物質(zhì)的非感染性顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是感染性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是非感染性的病毒顆粒。

本發(fā)明的第一方面涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的方法包括使用具有孔徑大小至多為80nm的納濾器(nanofilter)對(duì)所述的溶液進(jìn)行納濾。

本發(fā)明的第二方面涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的一種或者多種因子vii多肽的至少5％呈活化形式，所述的方法包括使用具有孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述的溶液進(jìn)行納濾。

本發(fā)明的第三方面涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的液體組合物基本上不含血清，所述的方法包括使用具有孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述的溶液進(jìn)行納濾。

本發(fā)明的另一方面涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的方法包括使用具有孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述的溶液進(jìn)行納濾，所述的納濾膜具有由選自下列的一種或者多種材料制成的膜：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf以及聚醚砜。

本發(fā)明的另一方面涉及滅活液體因子vii組合物中的病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，該方法包括將去污劑與所述組合物相組合的步驟。

本發(fā)明的另一方面涉及從液體因子vii組合物中高水平地消除活性病毒存在的方法，該方法包括(i)滅活病毒和(ii)除去病毒的步驟。

附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1示意闡明了適于本發(fā)明方法的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括可以提供壓縮空氣的壓力罐(1)，用于除去會(huì)堵塞病毒濾器的顆粒的預(yù)過(guò)濾器(2)，壓力計(jì)(p)，病毒濾器(3)和儲(chǔ)液罐(4)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了從通常包含顯著比例的活化的、所以具有蛋白水解活性的因子vii多肽的液體因子vii組合物中去除病毒、包括無(wú)包膜病毒或使其滅活的方法。該方法包括使用孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)液體因子vii組合物進(jìn)行納濾的步驟。

該方法對(duì)于去除有包膜病毒以及無(wú)包膜病毒特別有用，例如小鼠白血病病毒(有包膜)可以使用孔徑大小約為50nm的濾器除去，豬細(xì)小病毒(無(wú)包膜)可以使用孔徑大小約為20nm的濾器除去。

液體因子vii組合物，例如那些包含顯著比例的活化因子vii多肽的組合物，原則上可以由干的因子vii成分制備，但是更經(jīng)常的是從大規(guī)模制備工藝，例如包括重組技術(shù)的工藝中獲得。在這些工藝中，通常收獲細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，接下來(lái)對(duì)其進(jìn)行一個(gè)或者更多個(gè)處理步驟，包括但是不限于離心或者過(guò)濾以除去未固定在載體中的細(xì)胞；親和層析、疏水相互作用層析；離子交換層析；大小排阻層析；電泳步驟(例如制備型等電聚焦(ief))、差異溶解性(例如硫酸銨沉淀)或者提取等等，獲得所需的蛋白。一般地，參見(jiàn)scopes,proteinpurification,springer-verlag,newyork,1982；和proteinpurification,j.-c.janson和larsryden編,vchpublishers,newyork,1989。因子vii多肽的純化還可以包括例如在抗因子vii抗體柱上進(jìn)行的親和層析(參見(jiàn)例如,wakabayashietal.,j.biol.chem.261:11097,1986；以及thimetal.,biochem.27:7785,1988)以及使用因子xiia或者其他具有胰蛋白酶樣特異性的蛋白酶例如因子ixa、激肽釋放酶、因子xa和凝血酶，經(jīng)蛋白酶剪切的活化。參見(jiàn)例如,osterudetal.,biochem.11:2853(1972)；thomas,美國(guó)專利no.4,456,591；和hedneretal.,j.clin.invest.71:1836(1983)?；蛘?，可以將因子vii多肽通過(guò)離子交換層析柱，例如(pharmacia)等而使其活化。

本發(fā)明的方法對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)工藝特別有用。術(shù)語(yǔ)“大規(guī)模”通常指的是其中液體因子vii多肽組合物的體積至少是100l，例如至少500l，如至少1000l或者至少5000l的方法。這不以任何方式構(gòu)成限制，因?yàn)楸景l(fā)明也可以用于小于100l的液體因子vii多肽組合物。

現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，甚至在批量因子vii多肽被部分或者完全活化之后也可以進(jìn)行納濾。

這樣，本發(fā)明的方法適合作為因子vii多肽整體純化工藝步驟中的一步，通常是純化工藝最后步驟中的一步。

更為具體地，由從發(fā)酵培養(yǎng)液(或從人或者哺乳動(dòng)物的血漿)中收獲的材料開(kāi)始的典型純化工藝可以概括如下：

純化步驟病毒過(guò)濾的可能階段

收獲

↓1

捕獲

↓2

中間物純化

↓3

精制

↓4

藥物物質(zhì)

活化形式的因子vii多肽的含量最初(即從收獲步驟開(kāi)始)通常是大約2％，在純化過(guò)程中提高到90％或者更多，直至多肽作為藥物物質(zhì)獲得。

進(jìn)行納濾的液體因子vii組合物包含在適宜溶劑中的一種或者多種因子vii多肽。溶劑通常是水或者水性混合物/溶液如純水，水性緩沖液、水/乙醇混合物、水/dmso混合物或者鹽的水溶液例如鹽水、尿素溶液或者胍溶液。適宜的水性溶液還可以包含去污劑(表面活性劑)。

在有趣的實(shí)施方案中，液體因子vii組合物從細(xì)胞培養(yǎng)上清液(例如如wo02/29084中公開(kāi)的所獲得的細(xì)胞培養(yǎng)上清液)中獲得或者來(lái)源于此。在一個(gè)實(shí)施方案中，液體因子vii組合物是無(wú)血清的，即不含動(dòng)物來(lái)源的組分。這樣，細(xì)胞培養(yǎng)物可以在沒(méi)有動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

一種吸引人的變化形式是在cho細(xì)胞(例如沒(méi)有任何動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基或者沒(méi)有動(dòng)物來(lái)源組分以及沒(méi)有蛋白質(zhì)(“無(wú)蛋白的”)的培養(yǎng)基中的cho細(xì)胞)中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的因子vii多肽。

用于cho細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何可商購(gòu)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分的無(wú)蛋白的cho培養(yǎng)基或者內(nèi)部生產(chǎn)的用于cho細(xì)胞的培養(yǎng)基。

在一些實(shí)施方案中，使實(shí)施本發(fā)明使用的細(xì)胞適合于在無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基(例如無(wú)血清培養(yǎng)基)中懸浮培養(yǎng)。這種適應(yīng)的步驟在例如scharfenberg,etal.,animalcelltechnologydevelopmentstowardsthe21stcentury,e.c.beuveryetal.(eds.),kluweracademicpublishers,pp.619-623,1995(bhk和cho細(xì)胞)；cruz,biotechnol.tech.11:117-120,1997(昆蟲(chóng)細(xì)胞)；keen,cytotechnol.17:203-211,1995(骨髓瘤細(xì)胞)；bergetal.,biotechniques14:972-978,1993(人腎293細(xì)胞)中描述。在特定的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是已經(jīng)被工程化加工而表達(dá)人因子vii或者因子vii多肽，并且已經(jīng)適合于在沒(méi)有血清或者動(dòng)物來(lái)源組分的條件下生長(zhǎng)的bhk21或者cho細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，因子vii多肽在有牛血清或胎牛血清存在的情況下通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，一個(gè)特點(diǎn)是顯著比例(即至少5％，如至少7％，例如至少10％)的所述一種或者多種因子vii多肽以活化形式(即因子vii多肽的生物活性的、切割的形式(即因子viia多肽))存在。在另外的實(shí)施方案中，因子viia多肽占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的5-70％，如7-40％，例如10-30％。在其他實(shí)施方案中，因子viia多肽占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的50-100％，如70-100％，例如80-100％。在其他實(shí)施方案中，因子viia多肽占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的20-80％，如30-70％，例如30-60％。

在大多數(shù)實(shí)施方案中，所述溶液包含無(wú)活性形式的因子vii多肽以及生物活性的因子viia多肽，即因子viia多肽占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的100％以下。在最典型的實(shí)施方案中，組合物中包含(活化的)因子viia多肽，它對(duì)應(yīng)于(無(wú)活性的)因子vii多肽，即因子viia多肽是因子vii多肽的活化形式。在其他實(shí)施方案中，因子viia多肽與未活化的因子vii多肽的活化形式有些不同。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，在特定實(shí)施方案中，組合物可能包含一種以上的因子vii多肽和一種以上的因子viia多肽。

術(shù)語(yǔ)“一種或多種因子vii多肽”包括野生型因子vii(即具有美國(guó)專利no.4,784,950中公開(kāi)的氨基酸序列的多肽)以及與野生型因子vii相比表現(xiàn)基本相同或者具有提高的生物活性的因子vii變體。術(shù)語(yǔ)“因子vii”旨在包括未切割(酶原)形式的因子vii多肽，以及那些已經(jīng)經(jīng)過(guò)蛋白水解處理、產(chǎn)生其相應(yīng)的生物活性形式的因子vii多肽，它們可以被命名為因子viia。通常因子vii在152和153位殘基之間被切割，產(chǎn)生因子viia。術(shù)語(yǔ)“因子viia”特別地指活化的(即生物活性的，切割的)因子vii多肽。因此，相對(duì)于“因子vii”而言，“因子viia”是一個(gè)亞組。術(shù)語(yǔ)“無(wú)活性的因子vii”特別地指不是因子viia的因子vii。

術(shù)語(yǔ)“因子vii多肽”還包括其中因子viia的生物活性與野生型因子viia的活性相比被實(shí)質(zhì)性改變或者略有降低的多肽，包括變體，以及因子vii衍生物和因子vii偶聯(lián)物。這些多肽包括，但是不限于其中已經(jīng)引入了改變或者破壞所述多肽的生物活性的特定氨基酸序列改變的因子vii或者因子viia。如這里使用的，術(shù)語(yǔ)“因子vii衍生物”指的是野生型因子vii，與野生型因子vii和因子vii相關(guān)多肽相比表現(xiàn)出基本相同或者提高的生物活性的因子vii變體，其中親本多肽中一個(gè)或者多個(gè)氨基酸已經(jīng)過(guò)化學(xué)和/或酶學(xué)修飾，例如烷基化、糖基化、peg化、?；⑿纬甚セ蛘咝纬甚０返鹊?。這包括但是不限于peg化的人因子viia、半胱氨酸peg化的人因子viia及其變體。因子vii衍生物的非限制性的實(shí)例包括wo03/31464和美國(guó)專利申請(qǐng)us20040043446,us20040063911,us20040142856,us20040137557,和us20040132640(neosetechnologies,inc.)中公開(kāi)的糖基peg化的fvii衍生物；如wo01/04287,美國(guó)專利申請(qǐng)20030165996,wo01/58935,wo03/93465(maxygenaps)和wo02/02764,美國(guó)專利申請(qǐng)20030211094(universityofminnesota)中公開(kāi)的fvii偶聯(lián)物。

術(shù)語(yǔ)“peg化的人因子viia”指的是具有與人因子viia多肽偶聯(lián)的peg分子的人因子viia。應(yīng)當(dāng)理解peg分子可以連接在因子viia多肽的任何部分處，包括因子viia多肽的任何氨基酸殘基或者糖部分上。術(shù)語(yǔ)“半胱氨酸peg化的人因子viia”指的是具有與導(dǎo)入到人因子viia中的半胱氨酸上的巰基偶聯(lián)的peg分子的因子viia。

在血液凝固中因子viia的生物活性來(lái)自其(i)與組織因子(tf)結(jié)合以及(ii)催化因子ix或者因子x的蛋白酶剪切產(chǎn)生活化的因子ix或x(分別是因子ixa或xa)的能力。

對(duì)于本發(fā)明的目的，因子vii多肽的生物活性(“因子vii的生物活性”)可以通過(guò)使用缺少因子vii的血漿和促凝血酶原激酶測(cè)量制劑促進(jìn)血液凝固的能力來(lái)進(jìn)行定量，如美國(guó)專利no.5,997,864或wo92/15686中所述。在這個(gè)檢測(cè)中，生物活性表示為凝血時(shí)間相對(duì)于對(duì)照樣品的縮減，并通過(guò)與含有1單位/毫升因子vii活性的合并人血清標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較將其轉(zhuǎn)化為“因子vii單位”?；蛘呖梢酝ㄟ^(guò)(i)測(cè)定因子viia(或者因子vii多肽)在包含包埋于脂膜內(nèi)的tf和因子x的系統(tǒng)中產(chǎn)生活化的因子x(因子xa)的能力(perssonetal.,j.biol.chem.272:19919-19924,1997))；(ii)測(cè)定在水性系統(tǒng)中的因子x水解(“體外蛋白水解檢測(cè)”，參見(jiàn)下面)；(iii)使用基于表面等離子共振的儀器測(cè)定因子viia(或者因子vii多肽)與tf的物理結(jié)合(persson,febsletts.413:359-363,1997)；(iv)測(cè)定合成底物被因子viia(或者因子vii多肽)的水解(“體外水解檢測(cè)”，參見(jiàn)下面)；或者(v)在不依賴于tf的體外系統(tǒng)中測(cè)定凝血酶的產(chǎn)生，對(duì)因子viia的生物活性進(jìn)行定量。

具有相對(duì)于野生型因子viia而言基本相同或者提高的生物活性的因子vii變體包括在如上描述的凝血檢測(cè)、蛋白水解檢測(cè)或者tf結(jié)合檢測(cè)中的一種或多種檢測(cè)法中檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出在相同細(xì)胞類型中產(chǎn)生的因子viia比活性的至少大約25％，如至少大約50％，如至少大約75％，如至少大約90％的那些因子vii變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，其生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的80％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的90％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的100％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的120％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的200％以上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該生物活性是重組野生型人因子viia生物活性的400％以上。

具有相對(duì)于野生型因子viia而言顯著降低的生物活性的vii變體包括在如上描述的凝血檢測(cè)、蛋白水解檢測(cè)或者tf結(jié)合檢測(cè)中一種或多種檢測(cè)法中檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)出在相同細(xì)胞類型中產(chǎn)生的野生型因子viia比活性的大約25％以下，如大約10％以下，如大約5％以下，如大約1％以下的那些因子vii變體。具有相對(duì)于野生型因子vii而言實(shí)質(zhì)性改變的生物活性的因子vii變體包括、但不限于表現(xiàn)出不依賴于tf的因子x蛋白水解活性的因子vii變體以及那些結(jié)合tf但是不切割因子x的因子vii變體。

因子vii的變體，不論是表現(xiàn)出與野生型因子vii相比基本上相同或者更好的生物活性，還是表現(xiàn)出與野生型因子vii相比實(shí)質(zhì)性改變或者降低的生物活性，均包括、但不限于具有通過(guò)插入、缺失或者取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸而與野生型因子vii的氨基酸序列不同的氨基酸序列的多肽。

與野生型因子vii具有基本相同的生物活性的非限制性的因子vii變體實(shí)例包括s52a-fviia,s60a-fviia(linoetal.,arch.biochem.biophys.352:182-192,1998)；如美國(guó)專利no.5,580,560中公開(kāi)的表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性的因子viia變體；在290和291位殘基之間或者在315和316位殘基之間已被蛋白酶剪切的因子viia(mollerupetal.,biotechnol.bioeng.48:501-505,1995)；因子viia的氧化形式(kornfeltetal.,arch.biochem.biophys.363:43-54,1999)；如pct/dk02/00189中公開(kāi)的因子vii變體；以及如wo02/38162(scrippsresearchinstitute)中公開(kāi)的表現(xiàn)出增強(qiáng)的蛋白水解穩(wěn)定性的因子vii變體；如wo99/20767,美國(guó)專利us6017882和us6747003,美國(guó)專利申請(qǐng)20030100506(universityofminnesota)和wo00/66753,美國(guó)專利申請(qǐng)us20010018414,us2004220106,和us200131005,美國(guó)專利us6762286和us6693075(universityofminnesota)中公開(kāi)的具有修飾的gla結(jié)構(gòu)域并表現(xiàn)出膜結(jié)合增強(qiáng)的因子vii變體；以及如wo01/58935,美國(guó)專利us6806063,美國(guó)專利申請(qǐng)20030096338(maxygenaps),wo03/93465(maxygenaps)和wo04/029091(maxygenaps)中公開(kāi)的因子vii變體。

與野生型因子viia相比其生物活性提高的因子vii變體的非限制性實(shí)例包括，如wo01/83725，wo02/22776，wo02/077218，wo03/27147，wo03/37932；wo02/38162(scrippsresearchinstitute)中公開(kāi)的因子vii變體；以及如jp2001061479(chemo-sero-therapeuticresinst.)中公開(kāi)的具有提高活性的因子viia變體。

與野生型因子vii相比其生物活性顯著降低或者改變了的因子vii變體的非限制性實(shí)例包括r152e-fviia(wildgooseetal.，biochem29：3413-3420，1990)，s344a-fviia(kazamaetal.，j.biol.chem.270：66-72，1995)，ffr-fviia(holstetal.，eur.j.vasc.endovasc.surg.15：515-520，1998)，以及缺少gla結(jié)構(gòu)域的因子viia(nicolaisenetal.，febsletts.317：245-249，1993)。

因子vii多肽的明確實(shí)例包括、但不限于野生型因子vii，

l305v-fvii，l305v/m306d/d309s-fvii，l305i-fvii，l305t-fvii，f374p-fvii，v158t/m298q-fvii，v158d/e296v/m298q-fvii，k337a-fvii，m298q-fvii，v158d/m298q-fvii，l305v/k337a-fvii，v158d/e296v/m298q/l305v-fvii，v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，v158d/e296v/m298q/l305v/k337a-fvii，k157a-fvii，f296v-fvii，e296v/m298q-fvii，v158d/e296v-fvii，v158d/m298k-fvii，ands336g-fvii，l305v/k337a-fvii，l305v/v158d-fvii，l305v/e296v-fvii，l305v/m298q-fvii，l305v/v158t-fvii，l305v/k337a/v158t-fvii，l305v/k337a/m298q-fvii，l305v/k337a/e296v-fvii，l305v/k337a/v158d-fvii，l305v/v158d/m298q-fvii，l305v/v158d/e296v-fvii，l305v/v158t/m298q-fvii，l305v/v158t/e296v-fvii，l305v/e296v/m298q-fvii，l305v/v158d/e296v/m298q-fvii，l305v/v158t/e296v/m298q-fvii，l305v/v158t/k337a/m298q-fvii，l305v/v158t/e296v/k337a-fvii，l305v/v158d/k337a/m298q-fvii，l305v/v158d/e296v/k337a-fvii，l305v/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，l305v/v158t/e296v/m298q/k337a-fvii，s314e/k316h-fvii，s314e/k316q-fvii，s314e/l305v-fvii，s314e/k337a-fvii，s314e/v158d-fvii，s314e/e296v-fvii，s314e/m298q-fvii，s314e/v158t-fvii，k316h/l305v-fvii，k316h/k337a-fvii，k316h/v158d-fvii，k316h/e296v-fvii，k316h/m298q-fvii，k316h/v158t-fvii，k316q/l305v-fvii，k316q/k337a-fvii，k316q/v158d-fvii，k316q/e296v-fvii，k316q/m298q-fvii，k316q/v158t-fvii，s314e/l305v/k337a-fvii，s314e/l305v/v158d-fvii，s314e/l305v/e296v-fvii，s314e/l305v/m298q-fvii，s314e/l305v/v158t-fvii，s314e/l305v/k337a/v158t-fvii，s314e/l305v/k337a/m298q-fvii，s314e/l305v/k337a/e296v-fvii，s314e/l305v/k337a/v158d-fvii，s314e/l305v/v158d/m298q-fvii，s314e/l305v/v158d/e296v-fvii，s314e/l305v/v158t/m298q-fvii，s314e/l305v/v158t/e296v-fvii，s314e/l305v/e296v/m298q-fvii，s314e/l305v/v158d/e296v/m298q-fvii，s314e/l305v/v158t/e296v/m298q-fvii，s314e/l305v/v158t/k337a/m298q-fvii，s314e/l305v/v158t/e296v/k337a-fvii，s314e/l305v/v158d/k337a/m298q-fvii，s314e/l305v/v158d/e296v/k337a-fvii，s314e/l305v/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，s314e/l305v/v158t/e296v/m298q/k337a-fvii，k316h/l305v/k337a-fvii，k316h/l305v/v158d-fvii，k316h/l305v/e296v-fvii，k316h/l305v/m298q-fvii，k316h/l305v/v158t-fvii，k316h/l305v/k337a/v158t-fvii，k316h/l305v/k337a/m298q-fvii，k316h/l305v/k337a/e296v-fvii，k316h/l305v/k337a/v158d-fvii，k316h/l305v/v158d/m298q-fvii，k316h/l305v/v158d/e296v-fvii，k316h/l305v/v158t/m298q-fvii，k316h/l305v/v158t/e296v-fvii，k316h/l305v/e296v/m298q-fvii，k316h/l305v/v158d/e296v/m298q-fvii，k316h/l305v/v158t/e296v/m298q-fvii，k316h/l305v/v158t/k337a/m298q-fvii，k316h/l305v/v158t/e296v/k337a-fvii，k316h/l305v/v158d/k337a/m298q-fvii，k316h/l305v/v158d/e296v/k337a-fvii，k316h/l305v/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，k316h/l305v/v158t/e296v/m298q/k337a-fvii，k316q/l305v/k337a-fvii，k316q/l305v/v158d-fvii，k316q/l305v/e296v-fvii，k316q/l305v/m298q-fvii，k316q/l305v/v158t-fvii，k316q/l305v/k337a/v158t-fvii，k316q/l305v//k337a/m298q-fvii，k316q/l305v/k337a/e296v-fvii，k316q/l305v/k337a/v158d-fvii，.k316q/l305v/v158d/m298q-fvii，k316q/l305v/v158d/e296v-fvii，k316q/l305v/v158t/m298q-fvii，k316q/l305v/v158t/e296v-fvii，k316q/l305v/e296v/m298q-fvii，k316q/l305v/v158d/e296v/m298q-fvii，k316q/l305v/v158t/e296v/m298q-fvii，k316q/l305v/v158t/k337a/m298q-fvii，k316q/l305v/v158t/e296v/k337a-fvii，k316q/l305v/v158d/k337a/m298q-fvii，k316q/l305v/v158d/e296v/k337a-fvii，k316q/l305v/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，k316q/l305v/v158t/e296v/m298q/k337a-fvii，f374y/k337a-fvii，f374y/v158d-fvii，f374y/e296v-fvii，f374y/m298q-fvii，f374y/v158t-fvii，f374y/s314e-fvii，f374y/l305v-fvii，f374y/l305v/k337a-fvii，f374y/l305v/v158d-fvii，f374y/l305v/e296v-fvii，f374y/l305v/m298q-fvii，f374y/l305v/v158t-fvii，f374y/l305v/s314e-fvii，f374y/k337a/s314e-fvii，f374y/k337a/v158t-fvii，f374y/k337a/m298q-fvii，f374y/k337a/e296v-fvii，f374y/k337a/v158d-fvii，f374y/v158d/s314e-fvii，f374y/v158d/m298q-fvii，f374y/v158d/e296v-fvii，f374y/v158t/s314e-fvii，f374y/v158t/m298q-fvii，f374y/v158t/e296v-fvii，f374y/e296v/s314e-fvii，f374y/s314e/m298q-fvii，f374y/e296v/m298q-fvii，f374y/l305v/k337a/v158d-fvii，f374y/l305v/k337a/e296v-fvii，f374y/l305v/k337a/m298q-fvii，f374y/l305v/k337a/v158t-fvii，f374y/l305v/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v-fvii，f374y/l305v/v158d/m298q-fvii，f374y/l305v/v158d/s314e-fvii，f374y/l305v/e296v/m298q-fvii，f374y/l305v/e296v/v158t-fvii，f374y/l305v/e296v/s314e-fvii，f374y/l305v/m298q/v158t-fvii，f374y/l305v/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/v158t/s314e-fvii，f374y/k337a/s314e/v158t-fvii，f374y/k337a/s314e/m298q-fvii，f374y/k337a/s314e/e296v-fvii，f374y/k337a/s314e/v158d-fvii，f374y/k337a/v158t/m298q-fvii，f374y/k337a/v158t/e296v-fvii，f374y/k337a/m298q/e296v-fvii，f374y/k337a/m298q/v158d-fvii，f374y/k337a/e296v/v158d-fvii，f374y/v158d/s314e/m298q-fvii，f374y/v158d/s314e/e296v-fvii，f374y/v158d/m298q/e296v-fvii，f374y/v158t/s314e/e296v-fvii，f374y/v158t/s314e/m298q-fvii，f374y/v158t/m298q/e296v-fvii，f374y/e296v/s314e/m298q-fvii，f374y/l305v/m298q/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/e296v/k337a/s314e-fvii，f374y/e296v/m298q/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/e296v/m298q/k337a-fvii，f374y/l305v/e296v/m298q/s314e-fvii，f374y/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，f374y/v158d/e296v/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/k337a/s314e-fvii，f374y/v158d/m298q/k337a/s314e-fvii，f374y/v158d/e296v/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/m298q-fvii，f374y/l305v/v158d/m298q/k337a-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/k337a-fvii，f374y/l305v/v158d/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/s314e-fvii，f374y/v158t/e296v/m298q/k337a-fvii，f374y/v158t/e296v/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/v158t/k337a/s314e-fvii，f374y/v158t/m298q/k337a/s314e-fvii，f374y/v158t/e296v/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/v158t/e296v/m298q-fvii，f374y/l305v/v158t/m298q/k337a-fvii，f374y/l305v/v158t/e296v/k337a-fvii，f374y/l305v/v158t/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/v158t/e296v/s314e-fvii，f374y/e296v/m298q/k337a/v158t/s314e-fvii，f374y/v158d/e296v/m298q/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/m298q/s314e-fvii，f374y/l305v/e296v/m298q/v158t/s314e-fvii，f374y/l305v/e296v/m298q/k337a/v158t-fvii，f374y/l305v/e296v/k337a/v158t/s314e-fvii，f374y/l305v/m298q/k337a/v158t/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/m298q/k337a-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/k337a/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/m298q/k337a/s314e-fvii，，f374y/l305v/e296v/m298q/k337a/v158t/s314e-fvii，f374y/l305v/v158d/e296v/m298q/k337a/s314e-fvii，s52a-因子vii，s60a-因子vii；

r152e-因子vii，s344a-因子vii，缺少gla結(jié)構(gòu)域的因子viia；以及p11q/k33e-fvii,t106n-fvii,k143n/n145t-fvii,v253n-fvii,r290n/a292t-fvii,g291n-fvii,r315n/v317t-fvii,k143n/n145t/r315n/v317t-fvii；以及在氨基酸序列233thr到240asn中具有取代、添加或者缺失的因子vii，在氨基酸序列304arg到329cys中具有取代、添加或者缺失的因子vii。

在一些實(shí)施方案中，因子viia多肽是人因子viia(hfviia)，例如重組制備的人因子viia(rhfviia)。在其他實(shí)施方案中，所述一種或多種因子vii多肽包含因子vii序列變體。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種因子vii多肽具有與野生型因子vii不同的糖基化。

納濾

使用孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)液體因子vii組合物進(jìn)行納濾。更特別地，納濾器的孔徑大小至多為50nm，例如至多30nm，如在10-30nm的范圍內(nèi)。

術(shù)語(yǔ)“孔徑大小”通常指的是被濾器所截住的最小病毒的大小。

適宜的可商購(gòu)的納濾器實(shí)例是asahiplanove15n,asahiplanove20n,asahiplanova35n,和asahiplanova75n(全部來(lái)自asahichemical,tokyo,japan)；milliporenfr,milliporenfp,milliporeviresolve70,和milliporeviresolve180(全部來(lái)自millipore)；以及palldv20,palldv50,pallomegavr100k；和bembergmicroporousmembrane-15nm(bmm-15)。

納濾器的膜可以例如由選自下列的一種或者多種材料制成：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf、聚醚砜以及類似的材料。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述材料選自基于聚偏二氟乙烯的材料和基于聚醚砜的材料。

可以使用切向流過(guò)濾的方式或者死端過(guò)濾的方式進(jìn)行納濾，技術(shù)人員可以理解這一點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用死端過(guò)濾的方式進(jìn)行納濾。

不認(rèn)為進(jìn)行納濾的液體因子vii組合物的ph值是非常關(guān)鍵的。因此，通?？紤]到緊挨在納濾步驟之前的工藝步驟中應(yīng)用的條件給出ph值。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)ph值以使液體組合物具有的ph在5.5-10的范圍，例如在7.0-9.5的范圍，如在7.6-9.4的范圍；例如在7.7-9.3的范圍，如在8.0-9.0的范圍或者在8.3-8.7的范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，該ph在5-7的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該ph高于9.5，例如在9.5-10的范圍。

此外，在液體組合物中因子vii多肽的濃度通常也由前面的工藝步驟給出，但是通常在0.01-5mg/ml的范圍內(nèi)，例如在0.05-2.0mg/ml的范圍內(nèi)。

可以使用如圖1說(shuō)明的過(guò)濾系統(tǒng)進(jìn)行納濾過(guò)程。

可以如以下說(shuō)明性實(shí)例中所示進(jìn)行該過(guò)程：向壓力罐(1)中充滿注射用水(wfi)，將病毒濾器(3)之前的罐中的壓力升高到3.5巴，沖洗濾器10分鐘。將壓力降到2巴，再?zèng)_洗病毒濾器(3)10分鐘。將壓力罐(1)中的注射用水排掉，將液體因子vii組合物充入壓力罐(1)之前，可選地用緩沖液重復(fù)沖洗過(guò)程。將壓力提高到2巴，在過(guò)濾中保持基本恒定。隨后可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的步驟檢測(cè)病毒濾器(3)的完整性。

將濾過(guò)物收集于混合罐內(nèi)，可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步處理以獲得包含因子viia多肽作為藥物物質(zhì)的藥物組合物。

據(jù)說(shuō)，通常有利的是在納濾步驟之前進(jìn)行預(yù)過(guò)濾步驟，以去除可能導(dǎo)致納濾器堵塞的較大顆粒、聚集物等等。這種預(yù)過(guò)濾器通常具有的孔徑大小范圍是0.05-0.5μm。在一個(gè)實(shí)施方案中，該預(yù)過(guò)濾器是milliporenfr濾器。

使用空氣壓力的一種替代方式是，置于壓力罐后面的液體泵可以提供過(guò)濾所需的壓力。

如果納濾后的液體因子vii組合物包含無(wú)活性的因子vii多肽，則隨后可以對(duì)該組合物進(jìn)行活化步驟，例如s.&thim,l.res.disclosures(1986)269,564-565,pedersen,a.h.&al.,biochemistry(1989),28,9331-9336,和tomokiyo,k.&al.,voxsang.84,54-64(2003)中描述的。

可以如jurlander,b.&al.,seminarsinthrombosisandhemostasis27,4,373-383(2001)中所公開(kāi)的方式對(duì)組合物進(jìn)一步處理和最后配制為藥物產(chǎn)品。

無(wú)血清的液體因子vii多肽組合物的納濾

本發(fā)明的一個(gè)不同的方面可能包括以上特性中的一些或者全部，其中涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的液體組合物基本上沒(méi)有血清，所述的方法包括使用孔徑大小最大為80nm的納濾器對(duì)所述溶液進(jìn)行納濾。

一種吸引人的變通方式是其中所述因子vii多肽是使用cho細(xì)胞，例如在沒(méi)有任何動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中的cho細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)所生產(chǎn)的形式。

本發(fā)明的這個(gè)方面并不特別限于其中一定量的因子vii多肽呈活化形式的液體因子vii組合物。但是，以上針對(duì)本發(fā)明的第一方面所提及的條件也適于這一點(diǎn)，即本發(fā)明的第二方面，其中可作必要的修正。

通過(guò)特殊的濾器對(duì)液體因子vii多肽組合物進(jìn)行納濾

本發(fā)明的另一個(gè)不同的方面可能包括以上特征中的一些或者全部，其中涉及從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的方法包含使用孔徑大小最大為80nm的納濾器對(duì)所述的溶液進(jìn)行納濾，所述的納濾器具有由選自下列的一種或者多種材料制成的膜：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf和聚醚砜。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述材料選自基于聚偏二氟乙烯的材料和基于聚醚砜的材料。

本發(fā)明的這個(gè)方面并不特別限于其中一定量的因子vii多肽呈活化形式的液體因子vii組合物。但是，以上針對(duì)本發(fā)明的第一方面所提及的條件也適于這一點(diǎn)，即本發(fā)明的第三方面，其中可作必要的修正。

通過(guò)加入去污劑使病毒失活

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及使液體因子vii組合物中的病毒失活的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，該方法包括將去污劑與所述組合物相組合的步驟。

在一些實(shí)施方案中，所述去污劑選自非離子型去污劑，例如那些選自辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚山梨酸酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚、聚乙烯/聚丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇(peg)、聚氧乙烯硬脂酸酯以及聚氧乙烯蓖麻油的去污劑。其說(shuō)明性的實(shí)例是非離子型去污劑，例如tritonx-100,聚山梨酸酯20,聚山梨酸酯60,聚山梨酸酯80,brij-35(聚氧乙烯十二烷基醚),泊洛沙姆188,泊洛沙姆407,peg8000,多元醇,聚氧基-23-月桂基醚,myrj49,和cremophora。

特別有用的去污劑是具有化學(xué)式p-((ch3)3ch2c(ch2)2)-c6h4-o-(ch2ch2o)n-h的辛基苯氧基聚乙氧乙醇，其中n的范圍是5-15，特別是其中n為9-10的化合物，如去污劑tritonx-100。

在一個(gè)實(shí)施方案中，去污劑與液體因子vii組合物組合，使去污劑在組合物中的濃度在0.01-0.5％(重量)范圍內(nèi)，例如在0.05-0.4％(重量)范圍內(nèi)，例如在0.05-0.3％(重量)范圍內(nèi)，例如在0.05-0.2％(重量)范圍內(nèi)，例如在0.05-0.1％(重量)范圍內(nèi)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在溫度范圍為2-12℃、例如2-9℃范圍內(nèi)將去污劑與組合物組合。

對(duì)于大多數(shù)的目的，發(fā)現(xiàn)包括磷酸三烷基酯去污劑是不合意的，因此所述去污劑可以基本沒(méi)有磷酸三烷基酯溶劑，例如磷酸三(正丁基)酯。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述方法包括在2-9℃的溫度范圍內(nèi)將因子vii多肽組合物與tritonx-100相組合至濃度為0.05-0.2％(重量)的步驟，前提條件是所述去污劑基本沒(méi)有磷酸三烷基酯溶劑，例如磷酸三(正丁基)酯。

本發(fā)明的這個(gè)方面并不特別限于其中一定量的因子vii多肽呈活化形式的液體因子vii組合物。但是，以上針對(duì)本發(fā)明的第一方面所提及的條件也適于這一點(diǎn)，即本發(fā)明的第四方面，其中可作必要的修正。

病毒滅活步驟的組合

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及從液體因子vii組合物中高水平地消除活性病毒存在的方法，該方法包括如下步驟：(i)使用“通過(guò)加入去污劑使病毒失活”標(biāo)題下的方法滅活病毒，和(ii)使用在“納濾”標(biāo)題下定義的任何方法除去病毒的步驟，這些步驟可以是任何順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，滅活病毒的步驟在去除病毒的步驟之前。

即使認(rèn)為單個(gè)步驟對(duì)于去除活性病毒的存在這個(gè)目的是足夠的，但可以認(rèn)為這兩種方法至少部分地“不相關(guān)”，因?yàn)槟承┎《究赡苁褂闷渲幸环N方法較難去除，而相同的這些病毒使用另外一種方法可以更容易地去除，反之亦然。因此，這兩種方法的組合會(huì)為旨在應(yīng)用因子vii多肽的患者提供更加高水平的安全性，而絕非為了開(kāi)具因子vii多肽藥物處方的醫(yī)生以及批準(zhǔn)該藥物的監(jiān)管當(dāng)局。因此，這兩種方法的組合可能具有較高的商業(yè)價(jià)值。

如上所述，本發(fā)明涉及去除病毒顆?；蛘呤蛊涫Щ?。在特定的工藝步驟中病毒顆粒量的減少通常以log單位描述(log10對(duì)數(shù)，或者log10)，其中減少系數(shù)以該步驟之后病毒顆粒的量與該步驟之前病毒顆粒的量之比計(jì)算。

例如，如果在該步驟前病毒顆粒是10⁶，而在該步驟后是10²，則減少系數(shù)是10⁴，或者4log10。

從整個(gè)工藝中病毒顆粒的總減少量以相同的方式描述，并且可以通過(guò)將該工藝中每一步驟的病毒清除加在一起進(jìn)行計(jì)算，詞語(yǔ)“清除”指的是病毒的去除以及病毒的滅活二者。

對(duì)于有效的特定病毒清除步驟而言，優(yōu)選地病毒減少至少4log10。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)濾步驟使病毒顆粒的量至少降低了大約4log10。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，過(guò)濾步驟使病毒顆粒的量至少降低了大約5log10。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述fvii組合物與去污劑相組合的步驟使至少大約4log10的病毒滅活。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述fvii組合物與去污劑相組合的步驟使至少大約5log10的病毒滅活。

病毒顆粒量的確定對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員是已知的，并且可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的tcid50檢測(cè)法(半數(shù)終點(diǎn)值的組織培養(yǎng)感染量每毫升(tissuecultureinfectiousdose50％endpointperml))、噬斑檢測(cè)法或者pcr檢測(cè)法進(jìn)行測(cè)定。tcid50檢測(cè)法和噬斑檢測(cè)法可以用于測(cè)定感染性顆粒的濃度，而pcr檢測(cè)法可以用于測(cè)定感染性和非感染性的被滅活病毒顆粒二者。

本發(fā)明的實(shí)施方案

1.從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述的一種或者多種因子vii多肽中至少5％是以活化形式存在的，所述方法包括使用孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述溶液進(jìn)行納濾。

2.根據(jù)實(shí)施方案1的方法，其中所述一種或者多種因子vii多肽中至少7％，例如至少10％是以活化形式存在的。

3.根據(jù)實(shí)施方案1的方法，其中因子vii多肽的活化形式占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的5-70％，例如7-40％，如10-30％。

4.根據(jù)實(shí)施方案1的方法，其中因子vii多肽的活化形式占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的50-100％，例如70-100％，如80-100％。

5.根據(jù)實(shí)施方案1的方法，其中因子vii多肽的活化形式占所述一種或者多種因子vii多肽質(zhì)量的20-80％，例如30-70％，如30-60％。

6.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述液體組合物的ph在7.0-9.5的范圍內(nèi)，如在7.6-9.4的范圍內(nèi)，例如在7.7-9.3的范圍內(nèi)，如在8.0-9.0的范圍內(nèi)或者在8.3-8.7的范圍內(nèi)。

7.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中在液體組合物中因子vii多肽的濃度在0.01-5mg/ml的范圍內(nèi)，例如在0.05-2.0mg/ml的范圍內(nèi)。

8.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述納濾器的孔徑大小至多是50nm，如至多30nm，例如在10-30nm范圍內(nèi)。

9.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述納濾器的膜由選自下列的一種或者多種材料制成：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf和聚醚砜。

10.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述液體因子vii組合物源自細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者從細(xì)胞培養(yǎng)上清液獲得。

11.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述液體組合物是基本上無(wú)血清的。

12.根據(jù)實(shí)施方案1-10中任何一項(xiàng)的方法，其中所述因子vii多肽是在牛血清或胎牛血清存在下通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

13.根據(jù)前面任何實(shí)施方案的方法，其中所述因子vii多肽是在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

14.根據(jù)實(shí)施方案13的方法，其中所述因子vii多肽是在沒(méi)有任何動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中，在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

15.從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述液體組合物基本沒(méi)有血清，所述方法包括使用孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述溶液進(jìn)行納濾。

16.根據(jù)實(shí)施方案15的方法，其中所述液體因子vii組合物源自細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者從細(xì)胞培養(yǎng)上清液獲得。

17.根據(jù)實(shí)施方案15或16的方法，其中所述因子vii多肽是在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

18.根據(jù)實(shí)施方案17的方法，其中所述因子vii多肽是在沒(méi)有任何動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中，在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

19.根據(jù)實(shí)施方案15-18中任何一項(xiàng)的方法，其中所述一種或者多種因子vii多肽中的至少5％是以活化形式存在的。

20.根據(jù)實(shí)施方案15-19中任何一項(xiàng)的方法，其中所述液體組合物的ph在7.0-9.5的范圍內(nèi)，如在7.6-9.4的范圍內(nèi)，例如在7.7-9.3的范圍內(nèi)，如在8.0-9.0的范圍內(nèi)或者在8.3-8.7的范圍內(nèi)。

21.根據(jù)實(shí)施方案15-20中任何一項(xiàng)的方法，其中在所述液體組合物中因子vii多肽的濃度在0.01-5mg/ml的范圍內(nèi)，例如0.05-2.0mg/ml的范圍內(nèi)。

22.根據(jù)實(shí)施方案15-21中任何一項(xiàng)的方法，其中所述納濾器的孔徑大小至多是50nm，如至多30nm，例如在10-30nm范圍內(nèi)。

23.根據(jù)實(shí)施方案15-22中任何一項(xiàng)的方法，其中所述納濾器的膜由選自下列的一種或者多種材料制成：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf和聚醚砜。

24.從液體因子vii組合物中去除病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，所述方法包括使用孔徑大小至多為80nm的納濾器對(duì)所述溶液進(jìn)行納濾，所述納濾器具有由選自下列的一種或者多種材料制成的膜：銅銨再生纖維素、親水性聚偏二氟乙烯(pvdf)、復(fù)合pvdf、表面改性pvdf和聚醚砜。

25.根據(jù)實(shí)施方案24的方法，其中所述材料選自基于聚偏二氟乙烯的材料和基于聚醚砜的材料。

26.根據(jù)實(shí)施方案24-25中任何一項(xiàng)的方法，其中所述一種或者多種因子vii多肽的至少5％是以活化形式存在的。

27.根據(jù)實(shí)施方案24-26中任何一項(xiàng)的方法，其中所述液體組合物的ph在7.0-9.5的范圍內(nèi)，如在7.6-9.4的范圍內(nèi)，例如在7.7-9.3的范圍內(nèi)，如在8.0-9.0的范圍內(nèi)或者在8.3-8.7的范圍內(nèi)。

28.根據(jù)實(shí)施方案24-27中任何一項(xiàng)的方法，其中在所述液體組合物中因子vii多肽的濃度在0.01-5mg/ml的范圍內(nèi)，例如在0.05-2.0mg/ml的范圍內(nèi)。

29.根據(jù)實(shí)施方案24-28中任何一項(xiàng)的方法，其中所述納濾器的孔徑大小至多是50nm，如至多30nm，例如在10-30nm范圍內(nèi)。

30.根據(jù)實(shí)施方案24-29中任何一項(xiàng)的方法，其中所述液體因子vii組合物源自細(xì)胞培養(yǎng)上清液或者從細(xì)胞培養(yǎng)上清液獲得。

31.根據(jù)實(shí)施方案24-30中任何一項(xiàng)的方法，其中所述液體組合物是基本上無(wú)血清的。

32.根據(jù)實(shí)施方案24-31中任何一項(xiàng)的方法，其中所述因子vii多肽是在牛血清或胎牛血清存在下通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

33.根據(jù)實(shí)施方案24-32中任何一項(xiàng)的方法，其中所述因子vii多肽是在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

34.根據(jù)實(shí)施方案33的方法，其中所述因子vii多肽是在沒(méi)有任何動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中，在cho細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的。

35.滅活液體因子vii組合物中的病毒的方法，所述的組合物包含一種或者多種因子vii多肽，該方法包括將所述組合物與去污劑相組合的步驟。

36.根據(jù)實(shí)施方案35的方法，其中所述去污劑是具有化學(xué)式p-((ch3)3ch2c(ch2)2)-c6h4-o-(ch2ch2o)n-h的辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，其中n在5-15的范圍內(nèi)。

37.根據(jù)實(shí)施方案36的方法，其中所述去污劑是n為9-10的化合物，例如tritonx-100。

38.根據(jù)實(shí)施方案35的方法，其中所述去污劑選自由下列各項(xiàng)組成的組：聚山梨酸酯20,聚山梨酸酯60，和聚山梨酸酯80。

39.根據(jù)實(shí)施方案35-38中任何一項(xiàng)的方法，其中所述去污劑與液體因子vii組合物相組合，使得組合物中去污劑的濃度在0.01-0.3％(重量)范圍內(nèi)，例如在0.05-0.2％(重量)范圍內(nèi)。

40.根據(jù)實(shí)施方案35-39中任何一項(xiàng)的方法，其中將所述去污劑在2-12℃的溫度范圍內(nèi)、例如2-9℃的范圍內(nèi)與所述組合物相組合。

41.根據(jù)實(shí)施方案35-40中任何一項(xiàng)的方法，其中所述去污劑基本沒(méi)有磷酸三烷基酯溶劑，例如磷酸三(正丁基)酯。

42.高水平地消除液體因子vii組合物中活性病毒的存在的方法，該方法包括如下步驟：(i)使用根據(jù)實(shí)施方案35-41中任何一項(xiàng)定義的方法滅活病毒，和(ii)使用根據(jù)實(shí)施方案1-35中任何一項(xiàng)定義的方法去除病毒，所述步驟可以是任何順序。

43.根據(jù)實(shí)施方案42的方法，其中滅活病毒的步驟在去除病毒的步驟之前。

實(shí)施例

實(shí)施例1：因子vii的無(wú)血清制備

進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，在較大的中試規(guī)模培養(yǎng)物中制備因子vii。

使被編碼因子vii的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的chok1細(xì)胞系適合于在無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)。將經(jīng)過(guò)適應(yīng)后的細(xì)胞庫(kù)冷凍起來(lái)。在轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)，在無(wú)動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基中通過(guò)懸浮培養(yǎng)增殖來(lái)自該細(xì)胞庫(kù)的細(xì)胞。隨著細(xì)胞數(shù)目的增加，通過(guò)加入新的培養(yǎng)基使體積逐漸增加。當(dāng)體積達(dá)到4l且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到大約0.8×10⁶/ml時(shí)，將轉(zhuǎn)瓶中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到50l的攪拌罐反應(yīng)器(種子反應(yīng)器)中。隨著細(xì)胞數(shù)目在該50l反應(yīng)器中的增加，通過(guò)加入新的培養(yǎng)基使體積逐漸增加。當(dāng)體積達(dá)到50l且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到大約1×10⁶/ml時(shí)，將50l反應(yīng)器中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到500l的攪拌罐反應(yīng)器(生產(chǎn)反應(yīng)器)中。該500l反應(yīng)器含有大孔的cytopore1載體(amershambiosciences)，細(xì)胞在接種后的24小時(shí)內(nèi)被固定在該載體內(nèi)。隨著細(xì)胞數(shù)目的增加，通過(guò)加入新的培養(yǎng)基使500l反應(yīng)器中的體積逐漸增加。當(dāng)體積達(dá)到450l且細(xì)胞數(shù)目達(dá)到大約2×10⁶/ml時(shí)，開(kāi)始生產(chǎn)階段，并且每24小時(shí)更換一次培養(yǎng)基：停止攪動(dòng)以使含有細(xì)胞的載體沉降，然后收獲80％的細(xì)胞上清液，并換入新的培養(yǎng)基。對(duì)收獲的培養(yǎng)上清液進(jìn)行過(guò)濾，以除去未捕獲的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，然后轉(zhuǎn)移進(jìn)行進(jìn)一步的處理。所述50l以及500l的生物反應(yīng)器都提供了儀器控制用于控制溫度、溶解氧(通過(guò)微型噴氣裝置噴射氧)、攪動(dòng)速率、頂部空間通氣速率和ph(通過(guò)在頂部空間加入co2向下控制ph)。此外，所述500l生物反應(yīng)器也提供了儀器控制用于控制溶解的co2。使用ysi8500co2-儀器進(jìn)行在線co2測(cè)定。根據(jù)co2信號(hào)通過(guò)導(dǎo)管向液體中噴射空氣，由此控制co2的水平。如果co2濃度處于或者低于設(shè)定點(diǎn)，則噴氣速率設(shè)置為0l/min每升培養(yǎng)液體；如果co2濃度高于設(shè)定點(diǎn)，則噴氣速率設(shè)置為0.01-0.05l/min每升培養(yǎng)液體。溶解co2的設(shè)定點(diǎn)是160mmhg。正如所提及的，不在生物反應(yīng)器中加入堿來(lái)控制ph的升高。在生產(chǎn)階段，細(xì)胞密度達(dá)到1-2×10⁷細(xì)胞/ml，且每天收獲物中因子vii的濃度是10-20mg/l。pco2保持在150-170mmhg的范圍。即使沒(méi)有加入堿，ph也保持在6.70以上。

實(shí)施例2：來(lái)自捕獲步驟的洗脫物的過(guò)濾

將要過(guò)濾的蛋白質(zhì)溶液：來(lái)自捕獲步驟的25lfvii溶液，具有以下性質(zhì)

fvii/fviia的濃度:630mg/l

fvii的氧化形式占1.7％

活化程度(即fviia的百分比)：未分析

降解:<2.2％

基本上如本文所述，并參考圖1進(jìn)行過(guò)濾：

濾器:milliporenfr,0.08m²

壓力:2巴

濾過(guò)物的性質(zhì):

fvii/fviia的濃度:610mg/l,即fvii的產(chǎn)率:96.8％

fvii的氧化形式占1.5％

活化程度(即fviia的百分比)：未分析

降解:<2.2％

實(shí)施例3：來(lái)自捕獲步驟的洗脫物的過(guò)濾

將要過(guò)濾的蛋白質(zhì)溶液：來(lái)自捕獲步驟的185mlfvii溶液，具有以下性質(zhì)

fvii/fviia的濃度:82mg/l

fvii的氧化形式占3.4％

活化程度(即fviia的百分比)：19％

降解:<3％

基本上如本文所述，并參考圖1進(jìn)行過(guò)濾：

濾器:palldv50,0.0017m²

壓力:2巴

濾過(guò)物的性質(zhì):

fvii/fviia的濃度:77,1mg/l,即fvii的產(chǎn)率:94％

fvii的氧化形式占4.1％

活化程度(即fviia的百分比)：20％

降解:<3％

實(shí)施例4：來(lái)自捕獲步驟的洗脫物的過(guò)濾

將要過(guò)濾的蛋白質(zhì)溶液：來(lái)自步驟1的108ml洗脫物，具有以下性質(zhì)

fvii/fviia的濃度:320mg/l

fvii的氧化形式占3.7％

活化程度(即fviia的百分比)：3.3％

降解:<0.5％

基本上如本文所述并參考圖1進(jìn)行過(guò)濾：

濾器:asahiplanova20n,0.001m²

壓力:0.8巴

濾過(guò)物的性質(zhì):

fvii/fviia的濃度:310mg/l,即fvii的產(chǎn)率:100％

fvii的氧化形式占3.7％

活化程度(即fviia的百分比)：未分析

降解:<0.5％

實(shí)施例5：fvii批量藥物物質(zhì)的過(guò)濾

將要過(guò)濾的蛋白質(zhì)溶液：98ml的fviia批量物質(zhì)，具有以下性質(zhì)

fvii/fviia的濃度:1460mg/l

fvii的氧化形式占2.1％

活化程度(即fviia的百分比)：>90％

降解:11.9％

基本上如本文所述并參考圖1進(jìn)行過(guò)濾：

濾器:milliporenfp,0.0017m²

壓力:2巴

濾過(guò)物的性質(zhì):

fvii/fviia的濃度:1320mg/l,即fvii的產(chǎn)率:90.4％

fvii的氧化形式占2.3％

活化程度(即fviia的百分比)：未分析，因?yàn)榇^(guò)濾的溶液中活化的程度是98％

降解:12.3％

實(shí)施例6病毒去除

來(lái)自捕獲步驟、包含小鼠白血病病毒、滴度為yy噬斑形成單位(pfu)的50ml因子vii多肽溶液(參見(jiàn)實(shí)施例1)

基本如本文所述并參考圖1進(jìn)行過(guò)濾：

濾器：milliporenfr,yycm²

壓力：yy巴

濾過(guò)物中的病毒滴度：xxpfu

計(jì)算出的清除系數(shù)：xx。