本發(fā)明涉一種脂肪酶的產(chǎn)業(yè)化制備方法及其應(yīng)用，具體涉及一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木瓜乳中具有木瓜蛋白酶，木瓜肽酶b，木瓜凝乳蛋白酶a，木瓜凝乳蛋白酶b等豐富的酶類，其中木瓜蛋白酶已被廣泛的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)。1991年giordani等首先報道了木瓜乳具有水解甘油三脂的功能，并且發(fā)現(xiàn)其具有水解功能的主要成份是番木瓜乳中的水不溶的成分即木瓜脂肪酶(caricapapayalipase，cpl)。因為它與木瓜中的水不溶的類似于橡膠的物質(zhì)以矩陣的形式嵌和，人們稱之為“天然固定化酶”。

目前，cpl是木瓜蛋白酶生產(chǎn)的副產(chǎn)物，cpl以固體形式存在降低了木瓜蛋白酶的純度。cpl不僅存在于木瓜乳中，也存在于番木瓜樹的枝和葉中。由于病毒和細菌等疾病，番木瓜樹必須在1到2年間翻新種植，造成世界范圍類的7百萬噸的廢棄物，嚴(yán)重的影響環(huán)境，因此，對這些廢棄物進行深度開發(fā)、產(chǎn)業(yè)化回收提取木瓜酶制劑，特別是木瓜脂肪酶，并積極拓展其應(yīng)用，具有重要的經(jīng)濟價值和環(huán)保價值。

目前較為常用的cpl的提取方法，主要是通過緩沖液反復(fù)洗滌去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶類，離心回收cpl，cpl的得率為木瓜乳重量的2.50％左右，脂肪酶酶活為350u/g左右。該方法雖然可以完全去除木瓜乳中的水溶性的酶類，但是需要耗費大量的水電，且處理量小，一般僅適用于實驗室及樣品試制，難以適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化制備的要求。同時，該方法將水溶性蛋白酶類有效成分作為廢棄物，造成較大的資源浪費。

奶味香基是具有奶香氣的添加劑，是食品工業(yè)中使用最為廣泛的食用香精之一，主要用于糖果、蜜餞、飲料、冰淇淋及焙烤食品等的增香。此外，奶味香基還可用于飼料工業(yè)中。cpl目前已經(jīng)被報道應(yīng)用于催化合成人造母乳替代物，結(jié)構(gòu)酯，芳香酯，生物柴油和藥物中間體的手性拆分等，但是尚未有將cpl應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化制備奶味香基的報道。

酶法制備奶味香基主要是指以稀奶油、牛奶等為原料，通過脂肪酶的作用將甘油三酯酶解成飽和及不飽和脂肪酸、酮酸和羥酸，形成多種風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，經(jīng)過自然的氧化、斷裂、內(nèi)酯化等反應(yīng)生成一系列風(fēng)味物質(zhì)。因此以奶油為原料，通過脂肪酶水解作用得到酶解奶油，再加以適當(dāng)修飾，即可得到天然奶味香精。脂肪酶已被報道應(yīng)用于制備奶味香基，尤其是諾維信生產(chǎn)的商品酶palatase20000l。同時，脂肪酶，蛋白酶和其它酶復(fù)配的復(fù)合酶制劑對提高奶味香基的香氣豐度具有重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，而提供一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法及其應(yīng)用，實現(xiàn)木瓜脂肪酶的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝緊湊、過程易控、綜合能耗低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以使用同一批原材料得到的木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，且大幅提高酶制劑的得率和酶活。

本發(fā)明還提供了木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶味香基制作的方法，將木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶基的制備中，實現(xiàn)具有獨特香味的天然香精的制備。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)置無油空氣壓縮機、彈簧式安全閥ts、帶壓力傳感器和玻璃轉(zhuǎn)子流量計的儲罐、壓力表、板框壓濾機、80目濾布、回流管、第一噴霧干燥機、與第二噴霧干燥機；所述彈簧式安全閥分別連接無油空氣壓縮機與板框壓濾機，所述壓力表分別連接儲罐以及板框壓濾機，儲罐還通過回流管與板框過濾機相連接，所述80目濾布設(shè)置于板框壓濾機中，所述第一噴霧干燥機與板框壓濾機相連接；

(2)新鮮木瓜乳乳液倒入儲罐中，加壓通入板框壓濾機中；

(3)無油空氣壓縮機對板框過濾機加壓，木瓜乳通過板框過濾機，固體成分留在板框過濾機中，逐漸形成濾餅，濾液通過回流管回收至儲罐中，所述濾餅即為木瓜脂肪酶；

(4)重復(fù)步驟(3)，直至濾液變?yōu)椴缓榘咨绦挝锏臏\黃色液體，收集濾液；

(5)將濾液加入第一噴霧干燥機中，出料溫度控制在68℃至72℃之間，直接對濾液進行噴霧干燥，得到的固體粉末即為木瓜蛋白酶；

(6)將濾餅與等體積的水混合，加入第二噴霧干燥機中干燥，得到的固體粉末即為木瓜脂肪酶。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(2)中新鮮木瓜乳乳液是由-20℃冷凍木瓜乳溶解而得的。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(2)與(3)中新鮮木瓜乳乳液進入板框過濾機的壓力分為若干階段，第一階段采用低壓，進料壓力為0.12mpa，運行時間2-3h，第二階段采用中壓，進料壓力為0.18mpa，運行時間3-4h。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(5)中濾液的入口溫度為115℃-135℃，優(yōu)選為135℃。

一種將采用上述方法制備的木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步驟：

(1)將一定比例的稀奶油與pbs緩沖液混合，加入單硬脂酸甘油酯，加熱至60-80℃攪拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降溫至30℃-60℃，往步驟(1)制得的第一混合液中添加一定量的木瓜脂肪酶，在空氣浴恒溫搖床中恒溫反應(yīng)4-16h；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物升溫至85-90℃滅酶30min，均質(zhì)乳化，所得即為木瓜脂肪酶制備的天然奶味香基。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述木瓜脂肪酶的添加量為稀奶油質(zhì)量的0.5％-10％；

作為本發(fā)明的進一步改進，所述稀奶油與pbs緩沖液的質(zhì)量比例為1:1-3:1，所述pbs緩沖液的ph值為8.0-9.0。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述稀奶油與單硬脂酸甘油酯之間的質(zhì)量比例為150:1-250:1。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明提供的木瓜酶制劑制備方法，通過板框過濾與噴霧干燥兩步法，分別分離制備木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，生產(chǎn)工藝緊湊、過程易控、綜合能耗低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，可以使用同一批原材料得到的木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，且大幅提高酶制劑的得率和酶活；與通過緩沖液反復(fù)洗滌去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶類的木瓜脂肪酶制備方法相比，產(chǎn)率高，酶活力回收率高，且可以同時制備木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，水電消耗大大減小，非常適合工業(yè)產(chǎn)業(yè)化制備；

(2)采用木瓜脂肪酶制得的天然奶味香基，具有獨特的香氣，與現(xiàn)有常用的palatase20000l相比，酸味更加突出，可以用于調(diào)制獨特風(fēng)味的奶味產(chǎn)品。

下面結(jié)合附圖與具體實施方式，對本發(fā)明進一步詳細說明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的工藝流程示意圖；

圖2為本發(fā)明采用實施例1制得的木瓜脂肪酶與palatase20000分別制得的奶味香基的香味評價圖；

圖3為本發(fā)明實施例1制得的木瓜脂肪酶酶解奶味香基、palatase20000l酶解奶味香基、與稀奶油原料的固相微萃取總離子圖。

其中，無油空氣壓縮機1、彈簧式安全閥2、壓力傳感器31、轉(zhuǎn)子流量計32、儲罐3、壓力表4、板框壓濾機5、回流管6、第一噴霧干燥機7、第二噴霧干燥機8。

具體實施方式

實施例1

請參照圖1，本實施例提供一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)置vw-0.42/7無油空氣壓縮機1(排氣壓力0.7mpa，容積流量0.42m3/min)、a27w-10t彈簧式安全閥(ts)2、帶3251.072.090壓力傳感器31和lzj玻璃轉(zhuǎn)子流量計32的50l儲罐3、壓力表4、bms0.5/290-ub增強聚丙烯板框壓濾機5(過濾面積0.5m²，濾室總?cè)莘e7.5l)、80目濾布、回流管6、第一噴霧干燥機7、與第二噴霧干燥機8；所述彈簧式安全閥2分別連接無油空氣壓縮機1與板框壓濾機5，所述壓力表4分別連接儲罐3以及板框壓濾機5，儲罐3還通過回流管6與板框過濾機5相連接，所述80目濾布設(shè)置于板框壓濾機中，所述第一噴霧干燥機7與板框壓濾機5相連接；

(2)將-20℃冷凍木瓜乳溶解，得到新鮮木瓜乳乳液，將其倒入儲罐3中，加壓通入板框壓濾機5中；

(3)無油空氣壓縮機1對板框過濾機5加壓，木瓜乳通過板框過濾機5，第一階段采用低壓，進料壓力為0.12mpa，運行時間3h，第二階段采用中壓，進料壓力為0.18mpa，運行時間3h，6h共處理30kg的木瓜乳，固體成分留在板框過濾機5中，逐漸形成濾餅，濾液通過回流管回收至儲罐3中，所述濾餅即為木瓜脂肪酶；

(4)重復(fù)步驟(3)，直至濾液變?yōu)椴缓榘咨绦挝锏臏\黃色液體，收集濾液；

(5)將濾液加入第一噴霧干燥機中，入口溫度為135℃，出料溫度控制在68℃至72℃之間，直接對濾液進行噴霧干燥，得到的固體粉末即為木瓜蛋白酶；

(6)將濾餅與等體積的水混合，加入第二噴霧干燥機中干燥，得到的固體粉末即為木瓜脂肪酶。

本實施例還提供一種將采用上述方法制備的木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步驟：

(1)將50g稀奶油與ph值為9.0的pbs緩沖液混合，稀奶油與pbs緩沖液比例為2:1，加入250mg的單硬脂酸甘油酯，加熱至60℃攪拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降溫至45℃，往步驟(1)制得的第一混合液中添加稀奶油質(zhì)量的1.5％的木瓜脂肪酶，在空氣浴恒溫搖床中恒溫反應(yīng)6h；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物升溫至85℃滅酶30min，均質(zhì)乳化，所得即為木瓜脂肪酶制備的天然奶味香基。

實施例2

本實施例與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：所述木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法步驟(5)中的入口溫度為125℃，其他步驟與實施例1相同，在此不再贅述。

實施例3

本實施例與實施例1基本相同，其區(qū)別在于：所述木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法步驟(5)中的入口溫度為115℃，其他步驟與實施例1相同，在此不再贅述。

將實施例1-3制得的木瓜脂肪酶進行對比，比較不同的物料入口溫度對木瓜脂肪酶制備的影響，計算得率、比酶活、脂肪酶回收率與含水量，其中，得率(％)＝噴干木瓜脂肪酶重量/木瓜乳的重量×100％，酶活回收率(％)＝(噴干木瓜脂肪酶重量*比酶活)/(木瓜乳的重量*比酶活)×100％，將結(jié)果列表如下：

由上表可見，物料入口溫度越高，cpl的得率越高，脂肪酶的總回收率也越高。入口溫度越高，料液在噴霧干燥時霧化的液滴與熱空氣充分接觸后，霧滴干燥速度越快，水分蒸發(fā)速度越快，水分含量越低，越不易黏壁，所以得率就會越高。同時，入口溫度越高蒸干的時間就越短，高溫對cpl的酶活力影響就越小，總脂肪酶回收率就越高，最優(yōu)的物料入口溫度條件為135℃。在最優(yōu)物料入口溫度條件下，木瓜脂肪酶的得率為木瓜乳總重的4.12％，木瓜脂肪酶的比酶活為167.60u/g，木瓜脂肪酶的酶活力回收率為88.53％，同時測得噴干的木瓜脂肪酶中有蛋白酶酶活，為1.59×10⁶u/g，蛋白酶酶活力回收率為27.52％。同樣的工藝噴霧干燥濾液，木瓜蛋白酶的得率為木瓜乳總重量的8.02％。木瓜蛋白酶的比酶活為2.01×10⁶u/g，蛋白酶酶活力回收率為54.34％。

實施例4

本實施例提供一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)置vw-0.42/7無油空氣壓縮機(排氣壓力0.7mpa，容積流量0.42m3/min)、a27w-10t彈簧式安全閥(ts)、帶3251.072.090壓力傳感器31和lzj玻璃轉(zhuǎn)子流量計32的50l儲罐、壓力表、bms0.5/290-ub增強聚丙烯板框壓濾機(過濾面積0.5m²，濾室總?cè)莘e7.5l)、80目濾布、回流管、第一噴霧干燥機、與第二噴霧干燥機；所述彈簧式安全閥分別連接無油空氣壓縮機與板框壓濾機，所述壓力表分別連接儲罐以及板框壓濾機，儲罐還通過回流管與板框過濾機相連接，所述80目濾布設(shè)置于板框壓濾機中，所述第一噴霧干燥機與板框壓濾機相連接；所述第二噴霧干燥機與第一噴霧干燥機相連接；

(2)將-20℃冷凍木瓜乳溶解，得到新鮮木瓜乳乳液，將其倒入儲罐中，加壓通入板框壓濾機中；

(3)無油空氣壓縮機1對板框過濾機加壓，木瓜乳通過板框過濾機，第一階段采用低壓，進料壓力為0.12mpa，運行時間2h，第二階段采用中壓，進料壓力為0.18mpa，運行時間4h，6h共處理30kg的木瓜乳，固體成分留在板框過濾機中，逐漸形成濾餅，濾液通過回流管回收至儲罐中，所述濾餅即為木瓜脂肪酶；

(4)重復(fù)步驟(3)，直至濾液變?yōu)椴缓榘咨绦挝锏臏\黃色液體，收集濾液；

(5)將濾液加入第一噴霧干燥機中，入口溫度為135℃，出料溫度控制在68℃至72℃之間，直接對濾液進行噴霧干燥，得到的固體粉末即為木瓜蛋白酶；

(6)將濾餅與等體積的水混合，加入第二噴霧干燥機中干燥，得到的固體粉末即為木瓜脂肪酶。

本實施例還提供一種將采用上述方法制備的木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步驟：

(1)將50g稀奶油與ph值為8.0的pbs緩沖液混合，稀奶油與pbs緩沖液比例為1:1，加入330mg的單硬脂酸甘油酯，加熱至80℃攪拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降溫至60℃，往步驟(1)制得的第一混合液中添加稀奶油質(zhì)量的0.5％的木瓜脂肪酶，在空氣浴恒溫搖床中恒溫反應(yīng)4h；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物升溫至90℃滅酶30min，均質(zhì)乳化，所得即為木瓜脂肪酶制備的天然奶味香基。

實施例5

本實施例提供一種木瓜酶制劑的產(chǎn)業(yè)化制備方法，包括以下步驟：

(1)設(shè)置vw-0.42/7無油空氣壓縮機(排氣壓力0.7mpa，容積流量0.42m3/min)、a27w-10t彈簧式安全閥(ts)、帶3251.072.090壓力傳感器31和lzj玻璃轉(zhuǎn)子流量計32的50l儲罐、壓力表、bms0.5/290-ub增強聚丙烯板框壓濾機(過濾面積0.5m²，濾室總?cè)莘e7.5l)、80目濾布、回流管、第一噴霧干燥機、與第二噴霧干燥機；所述彈簧式安全閥分別連接無油空氣壓縮機與板框壓濾機，所述壓力表分別連接儲罐以及板框壓濾機，儲罐還通過回流管與板框過濾機相連接，所述80目濾布設(shè)置于板框壓濾機中，所述第一噴霧干燥機與板框壓濾機相連接；所述第二噴霧干燥機與第一噴霧干燥機相連接；

(2)將-20℃冷凍木瓜乳溶解，得到新鮮木瓜乳乳液，將其倒入儲罐中，加壓通入板框壓濾機中；

(3)無油空氣壓縮機1對板框過濾機加壓，木瓜乳通過板框過濾機，第一階段采用低壓，進料壓力為0.12mpa，運行時間3h，第二階段采用中壓，進料壓力為0.18mpa，運行時間4h，固體成分留在板框過濾機中，逐漸形成濾餅，濾液通過回流管回收至儲罐中，所述濾餅即為木瓜脂肪酶；

(4)重復(fù)步驟(3)，直至濾液變?yōu)椴缓榘咨绦挝锏臏\黃色液體，收集濾液；

(5)將濾液加入第一噴霧干燥機中，入口溫度為135℃，出料溫度控制在68℃至72℃之間，直接對濾液進行噴霧干燥，得到濾渣；

(6)將濾渣與等體積的水混合，加入第二噴霧干燥機中干燥，得到的固體粉末即為木瓜脂肪酶。

本實施例還提供一種將采用上述方法制備的木瓜脂肪酶應(yīng)用于天然奶味香基制作的方法，包括以下步驟：

(1)將50g稀奶油與ph值為8.0的pbs緩沖液混合，稀奶油與pbs緩沖液比例為3:1，加入200mg的單硬脂酸甘油酯，加熱至60℃攪拌，充分乳化后形成第一混合液；

(2)降溫至30℃，往步驟(1)制得的第一混合液中添加稀奶油質(zhì)量的10％的木瓜脂肪酶，在空氣浴恒溫搖床中恒溫反應(yīng)16h；

(3)將步驟(2)所得產(chǎn)物升溫至85℃滅酶30min，均質(zhì)乳化，所得即為木瓜脂肪酶制備的天然奶味香基。

實施例6

本實施例提供一種測定實施例1制得的木瓜脂肪酶酸價方法，包括以下步驟：

(1)將乙醚與95％乙醇溶劑按體積比1:1混合，使用前每100ml混合溶劑中，加入0.3ml酚酞指示劑，用氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液中和；

(2)取實施例1制得的木瓜脂肪酶0.5g，用50～150ml步驟(1)所得乙醚-乙醇混合液溶解；

(3)用0.1mol/l氫氧化鉀溶液進行滴定，直至指示劑到達終點，

測得木瓜脂肪酶的酸價為29.36±1.17mgkoh/g，采用相同方法測量palatase20000，酸價為17.86±0.83mgkoh/g。

實施例7

本實施例提供一種對實施例1制得的木瓜脂肪酶進行香氣評價的方法，包括以下步驟：酶解樣品室溫放置24h平衡香氣，之后稱取10.0g的樣品于50ml樣品瓶中，在40℃水浴鍋中放置15min使其溶解進行感官評價。評價小組由10人組成，男性5人，女性5人，采用6分法即1-6分從氣味由弱到強的方法對酶解奶油的奶味、干酪味、酸味、酸敗味分別進行感官評價。以沒有添加酶的原材料為陰性對照，palatase20000l酶解制備的奶味香基為對照，并將得到的結(jié)果進行風(fēng)味剖面分析。

如圖2所示，木瓜脂肪酶酶解制備的奶味香基具有獨特的香氣，其中酸味，干酪味較重。而palatase20000l酶解制備的奶味香基酸味不突出，奶味中有香甜味。

實施例8

本實施例提供一種對實施例1制得的木瓜脂肪酶進行揮發(fā)性成分分析的方法，包括以下步驟：以原材料稀奶油作為對照樣品a，商品酶palatase20000l酶解制備的奶味香基為對照樣品b。cpl酶解制備的樣品c，全部樣品室溫放置3天平衡香氣后分析其揮發(fā)性成份。

如圖3所示，a為稀奶油原料、b為cpl酶解奶味香基、c為palatase20000l酶解奶味香基，相對于原材料稀奶油，cpl酶解制備的奶味香基和palatase20000l酶解制備的奶味香基，其揮發(fā)性成份的強度都有很大的提升。酶解奶味香基中，偶數(shù)碳的脂肪酸對香氣貢獻較大，尤其是丁酸。

請參見下表，下表為cpl和palatase20000l酶解制備奶味香基的主要揮發(fā)性成份對比。

由上表可見，cpl酶解產(chǎn)物揮發(fā)性成份中酸的含量較高，占總揮發(fā)性物質(zhì)的73.28％，其中丁酸含量占總揮發(fā)性物質(zhì)的23.52％，己酸含量占36.73％。palatase20000l酶解產(chǎn)物揮發(fā)性成份中酸的含量較少，僅為總揮發(fā)性物質(zhì)的20.0％，酯的含量較高，為總揮發(fā)性物質(zhì)的18.48％且種類更加豐富。己酸乙酯的含量達到了14.42％，更有癸酸乙酯，辛酸乙酯，庚酸乙酯，戊酸乙酯等cpl酶解奶油中未檢測出的酯類。這與cpl的酶解奶油酸味較重，palatase20000l酶解奶油奶味中有香甜味的香氣感官評價相符。

本發(fā)明的重點在于，通過板框過濾與噴霧干燥兩步法分離制備木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，工藝簡單易行，與通過緩沖液反復(fù)洗滌去除木瓜乳中的水溶性蛋白酶類的木瓜脂肪酶制備方法相比，產(chǎn)率高，酶活力回收率高，且可以同時制備木瓜脂肪酶和木瓜蛋白酶，水電消耗大大減小，非常適合工業(yè)產(chǎn)業(yè)化制備。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，故采用與本發(fā)明上述實施例相同或近似的技術(shù)特征，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。