本發(fā)明公開了一種牡丹psdreb1啟動子derbp的克隆、載體構建及其功能分析的方法，屬于植物基因工程研究領域。
背景技術：
：牡丹(paeoniasuffruticosa)是我國的傳統(tǒng)名花。隨著我國園林花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,牡丹的美化價值和藥用價值等也日益受到重視。然而,環(huán)境因素使其種植和應用具有一定的局限性。為了能夠在江南和華南地區(qū)種植出雍容華貴的牡丹花，定向培育具有較強抗逆性的牡丹花品種已成為一項非常重要和緊迫的工作。前期，我們已經(jīng)獲得了牡丹抗逆轉(zhuǎn)錄因子psdreb1基因，并明確了該基因可以提高植物抗干旱和高鹽的能力。但其具體的作用機制尚未明確。啟動子是存在于基因上游、rna聚合酶能夠識別并與之結合、從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段核苷酸序列，該序列包含了大量的調(diào)控下游基因表達的順式作用元件。技術實現(xiàn)要素：針對目前牡丹psdreb1啟動子方面的研究在國內(nèi)仍為空白這一現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動子及其表達和應用。為達到上述目的，本發(fā)明采用的實施方案是：一種牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動子，所述啟動子drebp，核苷酸序列如seqidno：1所示，啟動子區(qū)域含有三個abre順式作用元件，能特異性地對aba進行應答反應，含有一個與干旱誘導相關的myb結合位點。一種采用所述的啟動子構建的表達載體，啟動子序列drebp構建到植物表達載體pbi121上，從而獲得重組載體pbi121-drebp-gus。一種根據(jù)所述的啟動子的應用，通過調(diào)控啟動子drebp的表達，從而調(diào)控牡丹抗干旱和高鹽的能力。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次從牡丹中克隆dreb1轉(zhuǎn)錄因子基因的啟動子drebp；本發(fā)明分析了drebp啟動子的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其含有典型的tatabox、caatbox以及與逆境脅迫響應相關聯(lián)的結構域；通過轉(zhuǎn)化擬南芥進行功能驗證，發(fā)現(xiàn)該啟動子屬于組成型啟動子，并受逆境如干旱、高鹽等脅迫的誘導。附圖說明圖1為重組載體pbi121-drebp-gus構建流程圖；圖2為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽性植株不同組織器官和不同發(fā)育時期的gus染色定性分析結果；其中，a部分組織器官:分別為a根、b莖、c葉、d花、e果莢、f種子；b部分5天幼苗的狀態(tài)；c部分10天幼苗的狀態(tài)；d部分25天幼苗的狀態(tài)；圖3為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽性植株在干旱、高鹽脅迫下的gus染色定性分析結果；圖4a為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽性植株根、莖、葉gus定量分析結果；圖4b為轉(zhuǎn)drebp擬南芥陽性植株干旱、高鹽gus定量分析結果。具體實施方式啟動子的克隆，對于研究植物基因表達調(diào)控和構建表達載體以及后續(xù)轉(zhuǎn)化模式植物進行功能驗證至關重要。對啟動子進行功能分析，能夠揭示植物響應逆境脅迫的作用機制。為了進一步揭示psdreb1基因提高植物抗干旱和高鹽能力的分子機制，我們試圖找到牡丹psdreb1相關的啟動子，并進行克隆、載體構建及功能分析。啟動子克隆的成功與否，與引物設計、克隆的方法等都有很大關系，如果引物設計不合理將不能成功地獲得啟動子序列；如果克隆的方法不當，可能獲得的啟動子序列不完全或者拿不到想要的啟動子序列。我們主要采用取以下的步驟：（1）啟動子克?。焊鶕?jù)牡丹psdreb1基因序列設計上游引物，采用染色體步移法克隆獲得其上游啟動子序列drebp，如seqidno：1所示；（2）載體構建：將上述獲得的啟動子序列drebp構建到植物表達載體pbi121上，從而獲得重組載體pbi121-drebp-gus；（3）遺傳轉(zhuǎn)化：將2構建的重組載體通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因后代；（4）功能驗證：將已轉(zhuǎn)入drebp-pbi121的擬南芥陽性植株進行gus染色的定性及定量分析，明確其表達模式。實施例1牡丹psdreb1啟動子序列drebp的克隆于2016年1月取3年生牡丹品種‘洛陽紅’的幼嫩葉片為材料，采用omega公司生產(chǎn)的trizol試劑盒提取總dna，以此為模板。根據(jù)psdreb1基因全長序列，設計反向引物sp1-caacagaaggggatcagcgaag（seqidno：2），sp2-ctttggttttacctcttgctcgt（seqidno：3），sp3-cggatttctcattttcccatttc（seqidno：4），使用takara公司的genomewalkingkit（codeno.6108），用上述模板進行反應。經(jīng)過pcr擴增獲得大小約2kb的產(chǎn)物。使用takara公司的minibestaragrosegeldnaextractionkitver4.0（codeno.9762）切膠回收上述pcr產(chǎn)物，命名為p1。使用takara公司的dnaligationkit(codeno.6022)中的solutioni，將p1產(chǎn)物與pmd19-tvector（codeno.6013）連接，熱轉(zhuǎn)化至e.colicompetentcellsjm109（codeno.9052）中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落植菌，提取陽性克隆質(zhì)粒。使用引物f1-ctgctgatttggtatttgga（seqidno：5），r1-ttcctggatctctattctga（seqidno：6）對獲得的質(zhì)粒進行測序。測序結果如seqidno：1所示，將測序獲得的序列與已知的psdreb1進行blast比對，結果表明獲得的序列是已知psdreb1基因的上游啟動子序列，該序列全長為2245bp，命名為drebp。啟動子序列分析：使用在線分析軟件plantcare和place程序分析所獲得的啟動子drebp序列的順式作用元件和調(diào)控元件，在線分析網(wǎng)址分別為：www.plantcare.com/encyclopedia和www.dna.affrc.go.jp/place。分析結果顯示：drebp啟動子序列含有65個與轉(zhuǎn)錄起始相關的tatabox結構，22個與組織特異性相關的caatbox結構，15個與環(huán)境脅迫相關的元件如光脅迫響應元件atct-motif、box4、boxi、g-box、gag-motif、gt1-motif、i-box、sp1、tct-motif和chs-cma，熱脅迫響應元件hse、干旱脅迫響應元件myb、真菌誘導響應元件box-w1等，另外還有一些植物激素感應元件如感應脫落酸aba的abre、感應茉莉酸甲酯meja的cgtca和tgacg結構、感應赤霉素ga的garemotif以及感應水楊酸sa的tcamotif等。具體如表1所示。表1牡丹psderb1啟動子drebp序列結構分析結果元件名稱數(shù)量序列功能abre3gacacgtacgt,tacgtg,gccacgtaca受干旱、aba、鹽脅迫的誘導are2tggttt厭氧菌誘導的調(diào)控元件atct-motif1aatctaatcc受光的誘導box41attaat受光的誘導boxi1tttcaaa受光的誘導box-w11ttgacc受真菌的誘導caat-box22caat,caaat啟動子增強區(qū)域cgtca-motif1cgtca茉莉酸甲酯響應的調(diào)控元件g-box3cacgta,gtacgtg,tacgtg光感應的調(diào)控元件gag-motif1agagagt受光的誘導gare-motif1tctgttg赤霉素響應的調(diào)控元件gt1-motif3ggttaa光感應的調(diào)控元件hse2aaaaaatttc受高溫脅迫誘導i-box1aagataaggct受光的誘導mbs1caactgmyb結合位點，干旱誘導相關mbsii1aaaagttagttamyb結合位點，類黃酮合成相關skn-1motif1gtcat胚乳特異性表達元件sp13cc(g/a)ccc光感應的調(diào)控元件tata-box65taata,taaaaataa,tacaaaa…轉(zhuǎn)錄起始tca-element1gagaagaata水楊酸響應元件tct-motif1tcttac受光的誘導tgacg-motiv1tgacg茉莉酸甲酯響應的調(diào)控元件chs-cma2ttacttaa,gcaattcc受光的誘導實施例2重組載體pbi121-drebp-gus的構建insertdna（目的dna）的制備：以上述獲得的啟動子drebp質(zhì)粒為模板，采用引物對f2（seqidno：7）/r2（seqidno：8）使用takara公司的primestar??hs（premix）（codeno.r040a）進行pcr擴增，擴增體系為：drebp質(zhì)粒（50倍稀釋液）1μl，f2（20pmol/μl）0.5μl，r2（20pmol/μl）0.5μl，primestarhs（premix）25μl，加dh2o至50μl；反應條件：98℃10s，55℃15s，72℃90s，共30個循環(huán)。取5μlpcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0（codeno.9762）切膠回收目的片段，命名為insertdna。vectordna（載體dna）的制備：以質(zhì)粒pbi121為模板，采用限制性內(nèi)切酶hindiii和xbai進行雙酶切，酶切反應體系為：pbi121質(zhì)粒dna30μl，10×buffer5μl，hindiii（10u/μl）1.5μl，xbair2（10u/μl）1.5μl，加dh2o至50μl；反應條件：37℃16h。取5μlpcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0（codeno.9762）切膠回收載體片段，命名為vectordna。重組質(zhì)粒的構建：使用in-fusion??hdcloningkit（clontechcodeno.639633），將insertdna和vectordna連接，連接反應體系如下：insertdna（約50ng/μl）1μl，vectordna（約80ng/μl）1μl，5×in-fusionhdenzymepremix2μl，加dh2o至10μl。反應條件：50℃，15min。將連接產(chǎn)物取1μl熱轉(zhuǎn)化至e.colicompetentcelljm109（codeno.9052）中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒并使用引物vp1（seqidno：9）/vp2（seqidno：10）對質(zhì)粒進行測序，測序獲得的結果經(jīng)blast比對，確認為成功構建的重組質(zhì)粒，并命名為pbi121-drebp-gus。構建流程如圖1所示。實施例3遺傳轉(zhuǎn)化將上述構建好的重組載體質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，然后采用clough和bent（1998）報道的蘸花法轉(zhuǎn)入擬南芥。采集擬南芥轉(zhuǎn)化苗的f1代種子，在含有40mg/l卡那霉素（kan）的1/2ms培養(yǎng)基上進行初步篩選培養(yǎng)，篩選出的陽性植株再使用引物對vp1/vp2進行pcr鑒定，鑒定為陽性的植株繼續(xù)種植從而收集f2代種子。延續(xù)上述方法，繼續(xù)獲得純合的f3代種子。實施例4功能分析無菌播種：將獲得的擬南芥轉(zhuǎn)化苗的f3代種子經(jīng)1%的naclo表面消毒10min，無菌水清洗6遍后，播種在1/2ms+蔗糖20g/l+瓊脂粉7.5g/l（ph5.8）的培養(yǎng)基上，先22℃暗培養(yǎng)48h后再進行光培養(yǎng)。不同組織器官的表達模式分析：將光培養(yǎng)40天的擬南芥轉(zhuǎn)化苗，使用中科瑞泰（北京）生物科技有限公司的gus染色試劑盒（貨號：rtu4032）進行染色。具體染色方法如下：gus染色液配制：將1mlx-gluc染色液加入到50mlgus染色緩沖液中，即配成gus染色溶液。染色步驟：1）將準備好的擬南芥轉(zhuǎn)化苗浸泡在gus染色液中，于25℃染色過夜；2）染過色的植株依次轉(zhuǎn)入25%、50%、75%、95%的乙醇中，分別在25℃搖床上120rpm振蕩脫色20min；3）顯微鏡下觀察擬南芥轉(zhuǎn)化苗根、莖、葉、花、果莢、種子等不同組織器官的gus染色結果。染色結果顯示：轉(zhuǎn)入drebp的擬南芥植株，在根、莖、葉、花、果莢中都有gus基因的表達，而在種子里無表達，其中根部表達量最高，其次是葉片和莖干，如圖2a所示。定量分析以25d轉(zhuǎn)化苗作為材料，使用上海江萊生物科技有限公司的植物guselisa試劑盒（cat.no.jl13690）進行測定，具體方法參照說明書，gus定量結果與染色結果吻合，即根部表達最強，其次是葉片和莖干，如圖4a所示。不同發(fā)育時期的表達模式分析：將無菌培養(yǎng)5d、10d和25d的擬南芥轉(zhuǎn)化苗，使用上述方法分別進行gus染色并在顯微鏡下觀察染色結果，結果顯示：擬南芥轉(zhuǎn)化苗在不同發(fā)育時期均有不同的表達模式，5d發(fā)芽期，只在主根的成熟區(qū)進行表達，其他部位不表達，如圖2b所示；10d幼苗期，在主根的成熟區(qū)和伸長區(qū)均有表達，葉片也有表達，莖干部分有輕微的染色，說明在莖部位表達很少，如圖2c所示；25d花苞期，gus染色布滿整個植株，根、莖、葉、花苞都有gus表達，其中又以根部表達最強、其次是葉片和花苞、莖干表達較其他部位稍弱，如圖2d所示。不同逆境脅迫下的表達模式分析：采集無菌播種25d的擬南芥轉(zhuǎn)化苗，分別將其根系浸泡在含有10%的聚乙二醇（peg6000）、300μm的nacl溶液中，以模擬干旱和高鹽脅迫，以蒸餾水作為對照，分別處理2h。取處理后的植株分別進行gus染色定性分析和gus定量分析。gus染色結果顯示：干旱和高鹽脅迫處理后，gus染色程度明顯高于對照，如圖3所示；gus定量分析結果顯示：與gus染色結果相吻合，即經(jīng)干旱和高鹽處理后gus表達量高于對照，且高鹽脅迫下的表達量最高，如圖4b所示。sequencelisting<110>浙江省蕭山棉麻研究所<120>牡丹psdreb1基因的抗干旱和高鹽啟動子及其表達和應用<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>2245<212>dna<213>paeoniasuffruticosa<400>1cgcgacgcatgcgcatccttttactcatttaccccaaacaaactaaccctagttaactga60actccgtttcactttcaccgacgttaaccatggttagttaaacccagcccttgatttgcg120taatgaaactctgttccccactcgagaatcgagggaatccaaacgtctctatctctcgct180acaattttttttctttctgggactggcgccgcaattgaagaagagaagcttttgtcctca240gtggccacttgattatggctctcaaccatggtttcgttaaaaactaaccatagttatcag300ttgatcattcagcaaactttcaaccaacgcactttcccacttaggcttattttaatcggg360ttttggtattggttttaataaataaaaaaggtctaatttagatgagattgtgtggataag420aatgatgccgttaaagattagtattatccattgtccaaccactactataaccatttcact480gtgatgatgtaacgtgcttatgtacggcgcacccatgtcaatcttaatcagtaaattaaa540aactatttttttttataaaatttaatctatttggttttttacccggtagttgttatttac600attatttcgctttcatccaattattcatttaaggtcctgtttgggatagcttctgcttat660gcttataaacagtaaaagtagagaagcagaagccagtgcagcttaaaactgctgatttgg720tatttggaaactgtttttggaagtgctttttagtaatatgttaaccagccttaaaaataa780attttgtataaaaactgcttatttttctgctttttgagaaaaagctatcccttaggtgct840tctgccaaaaaacactttttggcttttaagcactttttagtcaagtatgccaaacaccgt900aaaagcacttatatatgaaaataagtgcttataagcagcttataagcttagccaaacagg960gcctaagtctgactaacttttatattttcacacctacattctatggttatttattattat1020cgttcgagtttttaattcattgaattaaatttgaatttactagaatcttaaatcgagatg1080atgagtgcaccttacatctacacacctataatccatggctcttaactttctatgccagac1140tcttcaccactatagttcgagtctcgatctcatcgaactaagtttcaattcactcaaatc1200ctaaatcgagatgttgagtgcaccttaactttctaagtcagacttttcaccactagactt1260atcttagtagtttaatttaatatatttgtttacagtcatatttgtcgatacgatttttca1320accatctaatttattttttttataaaatcattgtccaaccctaattcataatactcaacc1380ttaattcaaaatactaaggtaagagaaaggacaaaaatgtattaaattctaaaggtaata1440tactcaatcagtcaatcacttacaaacaagtatgggtagtgtgaaggtaatatactcaat1500ccgtcaatcacttacaaacaagtatgggtagtgtgttatctccacccaaatgttggtggt1560caataaatatgaagttcatgtacgtgtcgctatagtattggatttgatttatgagtttag1620tttttaaaaaaaataaagaattaggtatctttcaagttgacaaaggttaaaaaaaaagaa1680gtgataactaagtaaaaagaaatatgaaaatagtgagaagaaagagagtaataattaagt1740aaagaaatgggaaaatgagaaatccgtgcgcctggaagtttatataagaggatgggtggg1800ggagggtacgagcaagaggtaaaaccaaagtgaggccacgaaaaaagagtgatacagttt1860ctctcactttctgcaactgcttttgatcatcatcttcttcttctcccccatccccacttc1920gctgatccccttctgttgtctcctgtctttcaattaattgttttgggtattgtttttttg1980tgatttttgtttgatatttgtgggttaaaaaaagcaattccagaaaggtgtttttgaaag2040tcaggtgattcagaatagagatccaggaaatatttttctttaatttgtagttttatcttt2100aattcaactacgagggcttctttttgtgtcctcaggttgtatttttgttttgtgcagata2160aagaaagtttttttcttttcctttttagcttgtatttccgtagatctttctctggttttt2220catatatatatttagtcgaggaagc2245<210>2<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>sp1<400>2caacagaaggggatcagcgaa21<210>3<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>sp2<400>3ctttggttttacctcttgctcgt23<210>4<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>sp3<400>4cggatttctcattttcccatttc23<210>5<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>f1<400>5ctgctgatttggtatttgga20<210>6<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>r1<400>6ttcctggatctctattctga20<210>7<211>54<212>dna<213>artificialsequence<220><223>f2<400>7tgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcccccgcgacgcatgcgcatcctt54<210>8<211>48<212>dna<213>artificialsequence<220><223>r2<400>8ccggggatcctctagagtccccgcttcctcgactaaatatatatatga48<210>9<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>vp1<400>9cgcaattaatgtgagttagc20<210>10<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>vp2<400>10ccaacgctgatcaattccac20當前第1頁12