本發(fā)明屬于靶向腫瘤相關(guān)基因的sirna分子的技術(shù)領(lǐng)域，涉及靶向ems1/cortactin的多靶位sirna分子及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

原發(fā)性肝癌(hcc)是一種多基因改變的復(fù)雜和異構(gòu)腫瘤，多數(shù)病人死于術(shù)后的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝癌細(xì)胞的侵襲性在hcc復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究表明，細(xì)胞膜下存在一層0.2-0.5微米厚的透明區(qū)域，稱為細(xì)胞皮層。該層結(jié)構(gòu)主要由肌動(dòng)蛋白微絲相互交聯(lián)構(gòu)成，與細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生理活動(dòng)密切相關(guān)^[1]。ems1基因定位于人類染色體11q13，其編碼蛋白具有與細(xì)胞皮質(zhì)區(qū)內(nèi)肌動(dòng)蛋白結(jié)合的能力，故稱之為皮動(dòng)蛋白(actin-bindingprotein，cortactin)。ems1/cortactin在肌動(dòng)蛋白聚合過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，并且調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)^[2-3]。有關(guān)ems1/cortactin與hcc遷移、侵襲密切相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但具體機(jī)制尚未研究清楚。

核酸干擾技術(shù)(rani)經(jīng)典作用在于特異性敲除或敲低某一特定基因片段，從而闡明該基因功能，并將其用于疾病治療。由于ems1/cortactinmrna基因全長3319bp，單一靶點(diǎn)sirna有時(shí)存在沉默效果不佳，性能不穩(wěn)定，脫靶效應(yīng)等問題，不利于下游實(shí)驗(yàn)開展，故本發(fā)明擬將rnai的作用靶點(diǎn)選擇在靶基因啟動(dòng)子下游75位堿基之后，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)rnai靶點(diǎn)的聯(lián)合抑制。通過多靶位sirna聯(lián)合作用，穩(wěn)定敲低hcc細(xì)胞中ems1/cortactin水平。

申請(qǐng)人擬將同時(shí)靶向ems1/cortactin多個(gè)位點(diǎn)的sirna聯(lián)合轉(zhuǎn)染入hcc細(xì)胞，通過rt-qpcr實(shí)驗(yàn)、人類全轉(zhuǎn)錄組cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)檢測等，研究ems1/cortactin水平下調(diào)后，hcc細(xì)胞中下游基因的具體變化，并將此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與使用單一靶點(diǎn)sirna的作用效果相對(duì)比，分析多靶位sirna在抑制率和穩(wěn)定性等方面是否具有有益效果。同時(shí)通過分析hcc細(xì)胞中ems1/cortactin水平下調(diào)后，細(xì)胞中變化基因?qū)?yīng)生物過程、分子功能等，進(jìn)一步闡述ems1/cortacitin表達(dá)與hcc遷移侵襲信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體關(guān)系，并明確其機(jī)制。研究結(jié)果為穩(wěn)定抑制人hccems1/cortacitin水平和研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉(zhuǎn)移的核酸藥物提供有益的探索，為探討hcc轉(zhuǎn)移機(jī)制和臨床控制hcc轉(zhuǎn)移提供更有針對(duì)性的思路。

[1]喻丹，張培軍.皮動(dòng)蛋白及微絲相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制[j].生命的化學(xué)2005，25(3)：226-228.

[2]urunot，liuj，zhangp，etal.activationofarp2/3complex-mediatedactinpolymerizationbycortactin[j].naturecellbiology2001，3：259-266.

[3]brycens，clarkes，leysathjl，etal.cortactinpromotescellmotilitybyenhancinglamellipodialpersistence[j].currentbiology2005，15：1276-1285.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)ems1mrna(genbank基本信息：nm_005231,3319bp,homosapienscortactin,transcriptvariant1,mrna)及南通麥杰生物有限公司提供的設(shè)計(jì)原則，篩選出3條特異性sirna靶序列：sirna-5、sirna-6和sirna-7，分別靶向ems1mrna基因序列ccaacatcgagatgattga(序列13，1765bp-1783bp)、cggtatcgacaaggacaaa(序列14，804bp-1783bp)和gaatatcagtcgaaacttt(序列15，514bp-532bp)。設(shè)計(jì)并制備的特異性靶向序列如下：

ems1/cortactinsirna-5的正義鏈：5’-ccaacaucgagaugauugadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-5的反義鏈：5’-ucaaucaucucgauguuggdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的正義鏈：5’-cgguaucgacaaggacaaadtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-6的反義鏈：5’-uuuguccuugucgauaccgdtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的正義鏈：5’-gaauaucagucgaaacuuudtdt-3’；

ems1/cortactinsirna-7的反義鏈：5’-aaaguuucgacugauauucdtdt-3’；

陰性對(duì)照序列如下：

sirna-nc的正義鏈：5’-uucuccgaacgugucacgudtdt-3’；

sirna-nc的反義鏈：5’-acgugacacguucggagaadtdt-3’。

通過將sirna-5、sirna-6和sirna-7轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系smmc-7721，通過rt-qpcr方法測定其基因水平變化，通過ws方法和免疫熒光方法檢測其蛋白水平變化予以驗(yàn)證。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多靶位聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721細(xì)胞內(nèi)ems1/cortactin在基因水平明顯沉默，沉默效率為83.97％(區(qū)間范圍81.14％-84.94％)，轉(zhuǎn)染sirna-nc未見ems1/cortacin明顯下降。蛋白水平westernblot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光檢測支持以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

將提取同批次轉(zhuǎn)染后smmc-7721之mrna并送人類全轉(zhuǎn)錄組cdna基因芯片(affymetrixhumanprimeview)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲低ems1/cortactin水平后，細(xì)胞內(nèi)改變基因591種，其中上調(diào)389種，下調(diào)202種(見表1)。通過go分析和kegg分析，發(fā)現(xiàn)變化基因涉及的主要細(xì)胞組分為細(xì)胞質(zhì)、胞漿基質(zhì)等部位，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中關(guān)于ems1/cortactin細(xì)胞膜下皮質(zhì)區(qū)定位相符合，實(shí)驗(yàn)中檢測出多個(gè)經(jīng)典家族或分子，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，這些家族或分子被報(bào)道與細(xì)胞間黏附、侵襲和遷移密切相關(guān)，本次實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)沉默hcc細(xì)胞中ems1/cortactin后，這些家族或分子變化明顯，fold值大于2，說明ems1/cortactin發(fā)揮作用主要與其相關(guān)，除經(jīng)典通路外，本次實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)沉默ems1/cortactin后，細(xì)胞內(nèi)變化的基因還與erk1和erk2負(fù)反饋調(diào)節(jié)，nf-kappab信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，tnf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，與heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物過程相關(guān)，ems1/cortactin與這些家族通路或生物過程的相關(guān)性為本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，其他文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。

表1細(xì)胞內(nèi)全基因水平變化

*按fold值>2計(jì)算

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了ems1/cortactin在hcc遷移侵襲過程中的作用通路，拓展了對(duì)ems1/cortactin功能的理解和認(rèn)識(shí)，同時(shí)為臨床控制hcc轉(zhuǎn)移提供更有針對(duì)性的思路。

為對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，在變化基因中隨機(jī)選取8種，設(shè)計(jì)合成引物，通過rt-qpcr方法檢測sirna轉(zhuǎn)染后其變化水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中7種基因rt-qpcr結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致，符合度為85.00％。

僅將sirna5轉(zhuǎn)染smmc-7721，下調(diào)水平在36.86％(區(qū)間范圍31.95％-41.41％)，采取與上文同樣的方法進(jìn)行affymetrixhumanprimeview檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變基因1336種，上調(diào)基因1273種，下調(diào)63種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合一般規(guī)律。在變化基因中隨機(jī)選取8種，設(shè)計(jì)合成引物，通過rt-qpcr方法檢測sirna轉(zhuǎn)染后其變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中4種與rt-qpcr結(jié)果一致，符合度為50.00％。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：本次合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于同時(shí)轉(zhuǎn)染人hcc細(xì)胞株smmc-7721，在基因水平下調(diào)效率約為80％，反復(fù)驗(yàn)證后下調(diào)水平較為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。單一使用sirna-5，下調(diào)水平較低，僅為40％左右。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合應(yīng)用于基因芯片檢測實(shí)驗(yàn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和pcr驗(yàn)證，效果準(zhǔn)確，為研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉(zhuǎn)移的核酸藥物提供依據(jù)。

多靶位sirna聯(lián)合使用，可有效解決單一靶點(diǎn)sirna沉默效果不佳，性能不穩(wěn)定，脫靶效應(yīng)等問題，利于下游實(shí)驗(yàn)開展，穩(wěn)定性和沉默效果好。

附圖說明

圖1為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，rt-qpcr方法檢測ems1/cortactin基因水平下調(diào)效果示意圖；

圖2為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，wb分析時(shí)上層濃縮膠的配方示意圖(a)、蛋白定量檢測的吸光度結(jié)果示意圖(b)和一體式化學(xué)發(fā)光儀拍攝照片(c)；

圖3為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，免疫熒光檢測ems1/cortactin蛋白水平沉默示意圖；

圖4為聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7，affymetrixhumanprimeview基因芯片檢測go數(shù)據(jù)庫-細(xì)胞組成(cellularcomponent)(a)、go數(shù)據(jù)庫-生物過程(biologicalprocess)(b)和go數(shù)據(jù)庫-分子功能(molecularfunction)(c)和kegg數(shù)據(jù)庫通路分析示意圖(d)；

圖5為單獨(dú)使用sirna-5，rt-qpcr方法檢測ems1/cortactin基因水平下調(diào)效果。

具體實(shí)施方式

為方便起見，在下文中，術(shù)語“sirna”、“sirna序列”或“sirna分子”可以互換，它們表示的意思和范圍相同。其中，sirna是正義鏈和反義鏈退火形成的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的sirna分子來源于針對(duì)ems1/cortactin基因開放閱讀框的功能保守區(qū)而設(shè)計(jì)。sirna的制備可采用多種方法，比如：化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長鏈dsrna、載體表達(dá)sirna、pcr合成sirna表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。

本發(fā)明采取化學(xué)合成法制備sirna分子，該分子可用于hcc基因芯片檢測、ems1/cortactin表達(dá)對(duì)hcc轉(zhuǎn)移調(diào)控分子機(jī)制研究，也可作為制備調(diào)節(jié)細(xì)胞中ems1/cortactin基因功能藥物的有效成分，下面通過實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。

第一部分：聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7

一、通過rt-qpcr檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7同時(shí)轉(zhuǎn)染后ems1/cortactin基因的表達(dá)

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株

肝癌smmc-7721細(xì)胞株，保存于南通麥杰生物技術(shù)有限公司。

1.2主要設(shè)備和耗材

二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱美國thermofisher公司、real-time檢測儀(abi-7500)美國abi公司、倒置顯微鏡日本olympus公司、細(xì)胞培養(yǎng)板美國corning公司、dmem培養(yǎng)基美國lifetechnologies公司、美國lifetechnologies公司、trizolrna提取試劑美國lifetechnologies公司、sybrgreenpcr試劑盒f-415xl美國thermo公司，其他生化試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞株smmc-7721生長于含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基中，37℃、5％co2加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2引物設(shè)計(jì)

在ncbigenbank檢索各基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物序列，化學(xué)合成sirna序列，使得對(duì)應(yīng)的正義鏈和反義鏈退火形成相應(yīng)的sirna。見表2。

表2sirna序列

2.3實(shí)驗(yàn)分組

(1)提前一天鋪板，第二天轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分為3組：

1)sirna-5#6#7#組(同時(shí)轉(zhuǎn)染sirna-5#6#7#，靶向組)

2)sirna-nc組(轉(zhuǎn)染sirna-nc，陰性對(duì)照組)

3)normal組(細(xì)胞不做任何處理，空白對(duì)照組)

(2)轉(zhuǎn)染48hrs后收集樣品。

取培養(yǎng)得到的處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，96孔板的接種密度為5×10⁴/孔、24孔板按1.5×10⁵/孔、6孔板為1×10⁶/孔接種細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組采用相應(yīng)的sirna按操作說明用脂質(zhì)體(lipofectamine)2000(invitrogen公司)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使sirna終濃度為50nm，37℃培養(yǎng)4h后，培養(yǎng)液換成含10％fbs的dmem培養(yǎng)基。

2.4rt-qpcr檢測ems1/cortactin基因的mrna水平

(1)提取細(xì)胞總rna：

1)用冷的pbs洗滌細(xì)胞數(shù)次，并加入1mlrisotmrna提取試劑，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來。

2)將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3)12,000g，4℃離心10min，然后小心吸取上清液，移入新的離心管中。

4)向上述步驟得到的勻漿液中加入0.2ml氯仿(每使用1mlriso加0.2ml氯仿)，蓋緊管蓋，用手上下振蕩15sec，得渾濁液，無分層現(xiàn)象，室溫靜置2-3min。

5)12,000g，4℃離心15min。離心后，樣品分為三層：無色上清水相、中間蛋白層及下層有機(jī)相，水相的體積約為所用riso試劑的60％。小心吸取無色上清液至另一離心管。

6)加入0.5ml異丙醇(每使用1mlriso加0.5ml異丙醇)，輕輕混勻，室溫靜置10min。

7)12,000g，4℃離心10min。棄去上清，加1ml70％乙醇(每使用1mlriso試劑至少加1ml70％乙醇)，渦旋振蕩混勻。

8)7,500g，4℃離心5min。棄盡上清，超凈工作臺(tái)干燥沉淀或真空離心干燥(不可太干，否則rna將會(huì)難以溶解)，加入適量depc-h2o溶解rna沉淀，在55-60℃促溶10min。

9)取1μl的rna樣品，進(jìn)行1.0％甲醛變性瓊脂糖電泳檢測。

(2)rt-qpcr檢測：

用rt-qpcr檢測靶基因mrna表達(dá)水平，看家基因gapdh為內(nèi)參，引物序列見表3：

表3rt-qpcr引物序列

f：forwardprimer，正向引物；r：reverseprimer，反向引物。

1)總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna：反轉(zhuǎn)錄前rna，70℃熱變性5min，后立即置于冰上；建立以下反應(yīng)體系，以oligod(t)n反轉(zhuǎn)錄cdna：rna～2μg，m-mlv酶1μl，5×m-mlv反應(yīng)緩沖液4μl，rnase抑制劑0.5μl，dntp(濃度：2.5mm)4μl，oligod(t)151μl，depc處理h2o至20μl，反應(yīng)程序：42℃反應(yīng)1h后；70℃滅活10min，反應(yīng)結(jié)束后：稀釋cdna至100μl后，保存于-80度備用；

2)pcr：以上述2對(duì)引物做qpcr，其中g(shù)apdh基因作為內(nèi)參對(duì)照；建立以下qpcr反應(yīng)體系：cdna4.0μl，2×sybrgreenqpcrmix12.5μl，f或f’(10μm)1.0μl，r或r’(10μm)1.0μl，ddh2o，至25μl，反應(yīng)程序：95℃5min預(yù)變性。95℃30s，55℃30s，72℃30sec，45循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，分析rt-qpcr的擴(kuò)增曲線，同時(shí)觀察熔解曲線，按每個(gè)反應(yīng)的ct值，用2-^δδct法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并作柱形圖。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

檢測各基因mrna水平的表達(dá)，如圖1，由結(jié)果可知：ems1/cortactin沉默效率為83.97％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多靶位聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7可使smmc-7721細(xì)胞內(nèi)ems1/cortactin在基因水平明顯沉默，沉默效率為83.97％(區(qū)間范圍81.14％-84.94％)。

二、檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7同時(shí)轉(zhuǎn)染后對(duì)ems1/cortactin蛋白水平沉默

(一)westernblot實(shí)驗(yàn)

1.實(shí)驗(yàn)材料

表4wb實(shí)驗(yàn)材料

2.實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)取凍存的smmc-7721細(xì)胞系，37℃快速解凍后，1000r/min離心5min，用dmem培養(yǎng)基清洗1-2次(因?yàn)樵诶鋬龅倪^程中加入了對(duì)細(xì)胞繁殖生長有害的物質(zhì))，用dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后再離心。

(2)加入dmem完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每天換一次培養(yǎng)基。

(3)觀察細(xì)胞生長狀況，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁴cells/ml，將細(xì)胞分盤鋪于6孔板，共9個(gè)孔，37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。

(4)制備sirna-lipofectamine2000復(fù)合物。

(5)將上清液吸掉，pbs清洗細(xì)胞。

(6)每孔加入600μlsirna-lipofectamine2000復(fù)合物到6孔培養(yǎng)板中，輕輕前后搖勻。

(7)37℃，5％co2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4-6h后，吸掉上清液，用pbs清洗兩次，加入2ml的dmem完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞。

(8)每組分別加入500μl的ripa裂解液，并加入適量的pmsf，置于冰上裂解2h；12000rpm，4℃，離心10min；移上清于新的ep管中，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-20℃冰箱。(9)蛋白定量

1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取一塊酶標(biāo)板，按照下表加入試劑

表5蛋白定量試劑

2)將bca試劑a與試劑b按體積比為50:1配制適量bca工作液，充分混勻；各孔加入200μlbca工作液。

3)把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30min，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標(biāo)，蛋白濃度(μg/μl)為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

4)在酶標(biāo)板中加入2μl待測蛋白和8μl去離子水，加入200μlbca工作液，把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30min，然后在562nm下測定吸光度。

5)根據(jù)所測樣品的吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可計(jì)算出相應(yīng)的蛋白濃度(μg/μl)，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度(單位：μg/μl)。如圖2所示，根據(jù)樣品濃度確定上樣量。

表6吸光度測定結(jié)果

(10)page膠的制備

1)下層分離膠的制備根據(jù)目的蛋白的分子量選用12％的膠。不同濃度的分離膠按常規(guī)進(jìn)行配制，待下層膠凝固后進(jìn)行上次濃縮膠的配制。

2)上層濃縮膠的配制

根據(jù)需要按圖2配制濃縮膠，并插好梳子。

(11)上樣及電泳

根據(jù)蛋白定量的結(jié)果相對(duì)應(yīng)的加入200μlep管中，再在每管中加入染液3μl。每孔蛋白上樣量為20μl。電泳濃縮膠80v20min，分離膠100v1h。

(12)轉(zhuǎn)膜

將膠小心的移入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，剪下同樣大小的pvdf膜，以甲醇浸泡3min，然后水洗2min，剪下同樣大小的6塊濾紙與pvdf膜，在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。在轉(zhuǎn)膜裝置上從負(fù)極到正極放置墊片、濾紙、膠、膜、濾紙、墊片，除去氣泡。電壓100v，1.5h左右。

(13)膜的封閉及抗體孵育

1)封閉：5％脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用bsa)室溫封閉1h或4℃過夜。

2)一抗：根據(jù)說明書稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜孵育2h或4℃孵育過夜。二抗：孵育一抗的膜用tbst洗滌3次，每次10min。隨后根據(jù)用量，稀釋相對(duì)應(yīng)的二抗，與膜37℃孵育1h。用tbst洗滌3次，每次10min。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

一體式化學(xué)發(fā)光儀拍攝照片如圖2，與normal組相比，sirna-nc轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ems1/cortactin蛋白表達(dá)水平有沒有差異；與nc組相比，sirna-5#6#7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ems1/cortactin蛋白的表達(dá)水平有顯著的下降。

(二)免疫熒光

1.實(shí)驗(yàn)材料及儀器：

1.1實(shí)驗(yàn)材料

fbs、dmem培養(yǎng)基均購自hyclone，smmc-7721細(xì)胞來源于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(thermoscientific8000)，光學(xué)顯微鏡(xds-1a)，低速離心機(jī)(上海盧湘儀tdz4b-ws)，熒光顯微鏡(leicaix71)。

2.實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期時(shí)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10⁴cells/ml，分別接種至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔300μl，每個(gè)濃度梯度3個(gè)復(fù)孔，37℃，5％co2培養(yǎng)24h。

(2)按照前述步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1)固定：取出孔板，加入pbs300μl，靜置5min，用手甩去板中液體，在吸水紙上輕輕拍干，每孔加入150μl4％多聚甲醛固定液，室溫固定30min。

2)通透：每孔加入150μl0.1％tritonx-100，室溫靜置15min。

3)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復(fù)3次，在吸水紙上輕輕拍干。

4)封閉：每孔加入200μl5％bsa封閉液，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱1h。吸出液體，在吸水紙上輕輕拍干。

5)一抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀釋的nse(稀釋比例參照說明書)，4℃過夜孵育。

6)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復(fù)5次，在吸水紙上輕輕拍干。

7)封閉：每孔加入200μl1％bsa封閉液，室溫封閉15min。

8)二抗：每孔加入150μl采用1％bsa稀釋的對(duì)應(yīng)二抗(稀釋比例參照說明書)，37℃孵育1h。

(3)洗滌：每孔加入300μl的pbs，靜置5min，吸出液體，重復(fù)5次。

(4)染核：每孔加入150μl的hoechst33258染液，室溫避光孵育30min。

(5)拍照：洗滌完畢每孔加入300μlpbs，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3，由上圖免疫熒光可知，與normal組相比，sirna-nc轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ems1/cortactin表達(dá)水平?jīng)]有差異；與nc組相比，sirna-5#6#7轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，ems1/cortactin的表達(dá)水平有明顯下降。

三、affymetrixhumanprimeview方法檢測sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合轉(zhuǎn)染沉默ems1/cortactin后細(xì)胞內(nèi)全基因組變化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成的sirna-5、sirna-6和sirna-7，經(jīng)rt-qpcr檢測，基因水平下調(diào)效率在80％左右，ws和免疫熒光實(shí)驗(yàn)支持以上結(jié)果，下調(diào)效率高，效果穩(wěn)定。發(fā)明人將其用于大通量基因芯片檢測，研究當(dāng)沉默hcc細(xì)胞中ems1/cortactin基因后，細(xì)胞內(nèi)全基因水平變化情況。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，提取細(xì)胞rna，送基因芯片affymetrixhumanprimeview檢測，具體步驟為：

樣品總rna利用nanodropnd-2100(thermoscientific)定量并經(jīng)agilentbioanalyzer2100(agilenttechnologies)檢測rna完整性。rna質(zhì)檢合格后，樣本的標(biāo)記、芯片的雜交以及洗脫參照芯片標(biāo)準(zhǔn)流程。首先，總rna反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cdna，再進(jìn)一步合成用生物素標(biāo)記的crna。標(biāo)記好的crna和芯片雜交，洗脫和染色后利用affymetrixscanner3000(affymetrix)掃描得到原始圖像。

原始圖像采用affymetrixgenechipcommandconsole軟件(version4.0,affymetrix)處理提取原始數(shù)據(jù)。接著利用genespring軟件(version12.5；agilenttechnologies)進(jìn)行rma標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。差異基因利用foldchange的倍數(shù)變化值進(jìn)行篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值>＝2.0。接著，對(duì)差異基因進(jìn)行g(shù)o和kegg富集分析，以判定差異基因主要影響的生物學(xué)功能或者通路。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)改變基因591種，其中上調(diào)389種，下調(diào)202種。通過go分析和kegg分析，發(fā)現(xiàn)變化基因涉及的主要細(xì)胞組分為細(xì)胞質(zhì)、胞漿基質(zhì)等部位，實(shí)驗(yàn)中檢測出多個(gè)經(jīng)典家族或分子變化(取fold值>2)，如interleukin家族il6，il1a，mapk家族map2k6和egr1，fgf2等，這些家族或分子被報(bào)道與細(xì)胞間黏附、侵襲和遷移密切相關(guān)。除經(jīng)典通路外，本次實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)沉默ems1/cortactin后，細(xì)胞內(nèi)變化的基因還與erk1和erk2負(fù)反饋調(diào)節(jié)，nf-kappab信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，tnf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，與heparinbinding，cholesterolbiosyntheticprocess，proteinhomodimerizationactivity等生物過程相關(guān)，ems1/cortactin與這些家族通路或生物過程的相關(guān)性為本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，其他文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。

第二部分：單獨(dú)使用sirna-5

一、rt-qpcr檢測ems1/cortactin基因的mrna水平

1分組：

(1)sirna-5組(僅轉(zhuǎn)染sirna-5，靶向組)

(2)sirna-nc組(轉(zhuǎn)染sirna-nc，陰性對(duì)照組)

(3)normal組(細(xì)胞不做任何處理，空白對(duì)照組)

2引物設(shè)計(jì)及具體實(shí)驗(yàn)方法同上，rt-qpcr檢測ems1/cortactinmrna水平的表達(dá)，如圖5，由結(jié)果可知：ems1/cortactin沉默效率為36.86％，區(qū)間范圍(31.95％-41.41％)。

二、affymetrixhumanprimeview方法檢測sirna-5沉默ems1/cortactin后細(xì)胞內(nèi)全基因組變化

采取與上文同樣的方法進(jìn)行affymetrixhumanprimeview檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變基因1336種，上調(diào)基因1273種，下調(diào)63種，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符合一般規(guī)律(表1)。

第三部分：聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7及單獨(dú)使用sirna-5，基因芯片結(jié)果與pcr結(jié)果對(duì)比

一、根據(jù)affymetrixhumanprimeview基因芯片結(jié)果，在上調(diào)基因和下調(diào)基因中各選擇4

種，設(shè)計(jì)引物并將sirna-5、sirna-6和sirna-7轉(zhuǎn)染smmc-7721細(xì)胞，通過rt-qpcr方法檢測這些基因的變化情況，并與基因芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)?；蛞锪斜硪姳?，比對(duì)結(jié)果見表8。

表7基因引物列表

表8聯(lián)合使用sirna-5、sirna-6和sirna-7基因芯片結(jié)果與rt-qpcr結(jié)果對(duì)比

二、根據(jù)affymetrixhumanprimeview基因芯片結(jié)果，在上調(diào)基因和下調(diào)基因中各選擇4種，設(shè)計(jì)引物(如表9)并將sirna-5轉(zhuǎn)染smmc-7721細(xì)胞，通過rt-qpcr方法檢測這些基因的變化情況，并與基因芯片結(jié)果進(jìn)行比對(duì)(表10)。

表9通過rt-qpcr方法檢測變化基因引物列表

表10單獨(dú)使用sirna-5，基因芯片結(jié)果與rt-qpcr結(jié)果對(duì)比

本發(fā)明合成靶向ems1/cortactin的sirna-5、sirna-6和sirna-7，用于轉(zhuǎn)染人hcc細(xì)胞株smmc-7721，在基因水平下調(diào)效率約為80％，反復(fù)驗(yàn)證后下調(diào)水平較為穩(wěn)定和準(zhǔn)確。單一使用sirna-5，下調(diào)水平較低，僅為40％左右。將sirna-5、sirna-6和sirna-7聯(lián)合應(yīng)用于基因芯片檢測實(shí)驗(yàn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析和pcr驗(yàn)證，效果準(zhǔn)確，為研發(fā)靶向ems1/cortactin抗轉(zhuǎn)移的核酸藥物提供依據(jù)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和等同形式的替換，這些改進(jìn)和等同替換得到的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110>南通大學(xué)杏林學(xué)院南通大學(xué)南通麥杰生物科技有限公司

<120>靶向ems1cortactin的多靶位sirna分子及應(yīng)用

<160>12

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<213>ems1/cortactinsirna-5的正義鏈

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<213>ems1/cortactinsirna-6的反義鏈

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<213>ems1/cortactinsirna-7的正義鏈

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<213>對(duì)應(yīng)于sirna-5的ems1mrna基因序列

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<213>對(duì)應(yīng)于sirna-6的ems1mrna基因序列

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