本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、其制備方法、重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化子。
背景技術(shù)：
：干旱是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因子，嚴(yán)重的干旱災(zāi)害會(huì)造成農(nóng)作物大面積的受損及減產(chǎn)。隨著全球水資源日益匱乏和自然災(zāi)害的日趨嚴(yán)重，農(nóng)作物的抗旱性研究顯得愈來(lái)愈重要。近年來(lái)水資源短缺嚴(yán)重制約著我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展，因此培育對(duì)干旱脅迫耐受性較高的農(nóng)作物新品種顯得越發(fā)緊迫。干旱可誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的主要機(jī)制之一是與逆境脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因上游啟動(dòng)子中關(guān)鍵的順式調(diào)控元件特異結(jié)合，從而增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，提高目的基因的表達(dá)。啟動(dòng)子是控制基因表達(dá)的重要調(diào)控元件，控制著外源基因表達(dá)的起始、表達(dá)部位及表達(dá)強(qiáng)度。在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題：現(xiàn)有的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子雖然能夠只在植株受到合適的誘導(dǎo)信號(hào)時(shí)才會(huì)表達(dá)，從而將外源基因的表達(dá)對(duì)植株的負(fù)面影響降至最小，但是現(xiàn)有的適用于干旱脅迫的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子甚少，這限制了農(nóng)作物抗旱育種基因資源的選擇。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中適用于干旱脅迫的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子甚少的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、其制備方法、重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化子。所述技術(shù)方案如下：一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列如序列表中seqidno.1所示。另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種制備上述的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的方法，所述方法包括：提取植物的基因組dna；將所述基因組dna通過(guò)如序列表中seqidno:2所示的上游引物和seqidno:3所示的下游引物進(jìn)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，即所述干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。具體地，所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系包括：4.8μlddh2o、10μl2×primestargcbuffer、2μl濃度為2.5mm的dntpmix、1μl濃度為10μm的所述上游引物、1μl濃度為10μm的所述下游引物、0.2μltakaraprimestartaq酶和1μl所述基因組dna。具體地，所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸85s，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束后退火溫度均增加0.5℃；98℃變性30s，65℃退火90s，72℃延伸85s，擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min。又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種干旱誘導(dǎo)型植物重組表達(dá)載體，所述干旱誘導(dǎo)型植物重組表達(dá)載體包括報(bào)告基因和終止子，所述干旱誘導(dǎo)型植物的重組表達(dá)載體還包括：如序列表中seqidno.1所示的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。具體地，所述重組表達(dá)載體的選擇標(biāo)記為潮霉素抗性。具體地，所述終止子為胭脂堿合成酶終止子。優(yōu)選地，所述表達(dá)載體以pcambia1381為骨架載體。具體地，所述報(bào)告基因?yàn)棣?葡萄糖苷酸酶基因。又一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子包括上述的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的啟動(dòng)子命名為pbddreb啟動(dòng)子，該pbddreb啟動(dòng)子具有高效干旱誘導(dǎo)活性，可用于植物耐旱轉(zhuǎn)基因，且該pbddreb啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因只有在植株受到合適的誘導(dǎo)信號(hào)時(shí)才會(huì)表達(dá)，從而將外源基因的表達(dá)對(duì)植株的負(fù)面影響降至最小，且pbddreb啟動(dòng)子能夠避免打破植物原有的代謝水平，避免增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，本發(fā)明實(shí)施例提供的pbddreb啟動(dòng)子增加了農(nóng)作物抗旱育種基因資源的選擇，本發(fā)明實(shí)施例提供的制備方法能夠高效快速地制備干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；同時(shí)，含有pbddreb啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子均可用于植物耐旱基因工程的育種改良。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是本發(fā)明實(shí)施例一提供的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例二提供的植物表達(dá)載體后酶切鑒定電泳圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例二提供的重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例二提供的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后的陽(yáng)性檢測(cè)電泳圖，圖中，m為dnamarkerⅲ，1至3為3個(gè)單克隆，4為陽(yáng)性對(duì)照pcambia1381-pbddreb-gus重組表達(dá)載體；圖5是本發(fā)明實(shí)施例二提供的轉(zhuǎn)基因煙草的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，圖中，marker為dnamarkerⅲ，1為野生型煙草，2為陽(yáng)性對(duì)照pcambia1381-pbddreb-gus重組表達(dá)載體，3至8為轉(zhuǎn)基因煙草t0代單株；圖6是本發(fā)明實(shí)施例二提供的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的幼苗在干旱脅迫下gus活性檢測(cè)結(jié)果，其中，wt表示野生型，pbddreb表示轉(zhuǎn)基因煙草；圖7是本發(fā)明實(shí)施例二提供的野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉片在干旱脅迫下gus活性檢測(cè)結(jié)果，其中，wt表示野生型，pbddreb表示轉(zhuǎn)基因煙草。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例一本發(fā)明實(shí)施例提供了一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列如序列表中seqidno.1所示，命名為pbddreb啟動(dòng)子。下面簡(jiǎn)單介紹一下制備pbddreb啟動(dòng)子的方法，具體如下：提取二穗短柄草的基因組dna，利用ctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)法(具體操作方法見(jiàn)murray&thompson,1980)提取正常生長(zhǎng)的二穗短柄草葉片的基因組dna，并用超微量核酸蛋白測(cè)定儀q5000檢測(cè)提取的基因組dna的質(zhì)量與濃度，并將提取的基因組dna的濃度稀釋至50～100ng/μl作為pbddreb啟動(dòng)子的模板。將模板通過(guò)如序列表中seqidno:2所示的上游引物和序列表中seqidno:3所示的下游引物進(jìn)行pcr(polymerasechainreaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)簡(jiǎn)稱)擴(kuò)增。表1為pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系試劑體積(μl)ddh2o4.82×primestargcbuffer10dntpmix(2.5mm)2上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1takaraprimestartaq酶0.2模板1pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系共20μl。將表1中的pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系按照如下pcr反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸85s，擴(kuò)增20個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束后退火溫度增加0.5℃；98℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸85s，擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)；72℃延伸6min。pcr擴(kuò)增結(jié)束后，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物(即pbddreb啟動(dòng)子)，吸取10μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。將和目標(biāo)條帶大小一致的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與t載體連接，在本實(shí)施例中，t載體為peasy-bluntcloningvector(購(gòu)置于北京全式金生物技術(shù)有限公司)。由于本實(shí)施例中pcr反應(yīng)體系使用的酶為takaraprimestartaq酶，使得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端，因此，用平末端的t載體與pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連接，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與t載體的體積比可以為4:1，具體地，在本實(shí)施例中取4μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物和1μlt載體，連接pcr擴(kuò)增產(chǎn)物和t載體的具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，得到連接產(chǎn)物。利用peasy-bluntcloningvector試劑盒(購(gòu)置北京全式金生物技術(shù)有限公司)，該試劑盒包括大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans1-t1，將連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans1-t1中，具體操作方法見(jiàn)peasy-bluntcloningvector試劑盒的說(shuō)明書，將轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞trans1-t1的連接產(chǎn)物涂布于含有100mg/l卡那霉素的lb(luria-bertani)平板培養(yǎng)基上，其中1l的lb平板培養(yǎng)基含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化鈉和15g瓊脂(ph值：7.4)，挑取lb平板培養(yǎng)基上的8個(gè)單克隆分別進(jìn)行菌落pcr檢測(cè)，該pcr檢測(cè)的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系與制備pbddreb啟動(dòng)子的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系完全一致，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1％的瓊脂糖電泳檢測(cè)，并選取與預(yù)期大小一致的3個(gè)陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示擴(kuò)增序列均與seqidno:1完全吻合。將測(cè)序的3個(gè)陽(yáng)性單克隆分別進(jìn)行擴(kuò)繁，以獲得大量的啟動(dòng)子產(chǎn)物，然后用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)于天根生化科技有限公司)對(duì)這些單克隆進(jìn)行提取，其提取過(guò)程按照質(zhì)粒小提試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，用超微量核酸蛋白測(cè)定儀q5000進(jìn)行質(zhì)粒濃度測(cè)定，測(cè)得3個(gè)陽(yáng)性單克隆質(zhì)粒的濃度分別為256ng/ul，330ng/ul和280ng/ul，將其命名為pbddreb-t重組質(zhì)粒。實(shí)施例二本發(fā)明實(shí)施例提供了一種干旱誘導(dǎo)型植物的重組表達(dá)載體，該干旱誘導(dǎo)型植物的重組表達(dá)載體包括目的基因、報(bào)告基因、表達(dá)載體和本發(fā)明實(shí)施例一中提供的干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其中，目的基因?yàn)楦珊嫡T導(dǎo)型啟動(dòng)子，表達(dá)載體為植物雙元表達(dá)載體，如選用pcambia1381、pbi121、pcambia1301或pcambia1304作為骨架載體，具體地，在本實(shí)施例中表達(dá)載體可以以pcambia1381為骨架載體。其中，pcambia1381表達(dá)載體包括胭脂堿合成酶終止子，其選擇標(biāo)記為潮霉素抗性。下面簡(jiǎn)單介紹一下干旱誘導(dǎo)型植物的重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，具體如下：將pbddreb-t重組質(zhì)粒經(jīng)ecorⅰ和hindⅲ進(jìn)行雙酶切，得到第一酶切產(chǎn)物，將表達(dá)載體pcambia1381經(jīng)ecorⅰ和hindⅲ進(jìn)行雙酶切，得到第二酶切產(chǎn)物，其中ecorⅰ和hindⅲ均購(gòu)置于neb公司，將第一酶切產(chǎn)物進(jìn)行濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳，得到帶有啟動(dòng)子片段的凝膠，通過(guò)凝膠回收試劑盒回收啟動(dòng)子片段，將第二酶切產(chǎn)物進(jìn)行濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳，得到含有g(shù)us基因的pcambia1381表達(dá)載體的片段的凝膠，通過(guò)凝膠回收試劑盒回收含有g(shù)us基因的pcambia1381表達(dá)載體的片段，采用t4dna連接酶(購(gòu)置于neb公司)將回收的啟動(dòng)子片段和含有g(shù)us基因的pcambia1381表達(dá)載體的片段進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，即pcambia1381:pbddreb重組質(zhì)粒，再次采用peasy-bluntcloningvector試劑盒中的大腸桿菌受態(tài)細(xì)胞trans1-t1，然后將pcambia1381:pbddreb重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌受態(tài)細(xì)胞trans1-t1內(nèi)，具體操作按照peasy-bluntcloningvector試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物培養(yǎng)于含有100mg/l卡那霉素(kan)的lb平板培養(yǎng)基中，在lb平板培養(yǎng)基上挑取單克隆進(jìn)行pcr陽(yáng)性檢測(cè)，該pcr陽(yáng)性檢測(cè)的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系與制備pbddreb啟動(dòng)子的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系完全一致，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為1％的瓊脂糖電泳檢測(cè)，然后挑取條帶大小符合預(yù)期的一個(gè)單克隆利用質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取，質(zhì)粒提取步驟見(jiàn)質(zhì)粒小提中量試劑盒說(shuō)明書，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，雙酶切反應(yīng)體系見(jiàn)表2，并于37℃的pcr儀器上酶切半個(gè)小時(shí)，然后進(jìn)行濃度為1％的瓊脂糖電泳鑒定，電泳鑒定結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切出了與預(yù)期大小一致的兩條帶，由此可見(jiàn)，該克隆的質(zhì)粒即為構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pcambia1381-pbddreb-gus，其重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖3所示。將構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體pcambia1381-pbddreb-gus采用凍融法轉(zhuǎn)入eha105chemicallycompetentcell(上海士峰生物科技有限公司)提供的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞eha105中，具體操作見(jiàn)eha105chemicallycompetentcell的說(shuō)明書，得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物培養(yǎng)于含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的lb平板培養(yǎng)基中，在lb平板培養(yǎng)基上挑取單克隆進(jìn)行pcr陽(yáng)性檢測(cè)，該pcr陽(yáng)性檢測(cè)的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系與制備pbddreb啟動(dòng)子的擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系完全一致，同時(shí)，采用pcambia1381-pbddreb-gus重組表達(dá)載體作為陽(yáng)性對(duì)照，并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳陽(yáng)性檢測(cè)，其陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，每個(gè)單克隆均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的目標(biāo)條帶，證明該單克隆為正確的陽(yáng)性菌株，即農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子將用于后續(xù)植物材料的轉(zhuǎn)化。表2為pcambia1381-pbddreb-gus重組表達(dá)載體雙酶切反應(yīng)體系利用pbddreb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus報(bào)告基因在煙草中表達(dá)，具體方法如下：轉(zhuǎn)基因受體材料的準(zhǔn)備：在本實(shí)施例中選擇的受體材料為煙草，將本氏煙草的種子均勻撒播于含有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，置于25℃培養(yǎng)室(培養(yǎng)條件：12h光照和12h黑暗交替培養(yǎng))中進(jìn)行種子萌發(fā)，同時(shí)覆蓋保鮮膜以保持營(yíng)養(yǎng)土的濕度，待幼苗出土一周后逐步去掉保鮮膜，對(duì)于長(zhǎng)勢(shì)好的幼苗可以先去掉保鮮膜，兩周后可將幼苗進(jìn)行移栽。煙草葉片的消毒與預(yù)培養(yǎng)：待幼苗長(zhǎng)至2個(gè)月大時(shí)，選取生長(zhǎng)狀況良好的煙草幼苗的嫩葉片，將其置于超凈臺(tái)上干凈的燒杯中，先用濃度為75％的乙醇浸泡葉片45s，再用濃度為2.5％的次氯酸鈉溶液浸泡葉片8～10min，期間不斷晃動(dòng)燒杯使葉片充分消毒，然后將葉片用無(wú)菌水清洗5次，每次清洗3min左右。最后用無(wú)菌濾紙吸去葉片表面上的水分，并用無(wú)菌刀片將葉片切成約0.5×0.5cm2的小塊，切塊時(shí)注意要避開(kāi)葉脈，將切好的葉片塊平鋪于煙草共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3天。其中，煙草共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括：ms(murashigeandskoog)基本培養(yǎng)基(購(gòu)置于sigma公司，且購(gòu)買時(shí)為固體粉末，1l煙草共培養(yǎng)培養(yǎng)基加入4.4gms基本培養(yǎng)基的固體粉末)、濃度為2mg/l的6-芐氨基腺嘌呤(6-ba)、濃度為0.2mg/l的萘乙酸(naa)、濃度為8g/l的瓊脂(agar)和濃度為30g/l的蔗糖，且ph值為5.8。農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉片：將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)化子在lb固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，其中，固體平板培養(yǎng)基含有濃度為50mg/l的卡那霉素，于28℃黑暗條件下培養(yǎng)1天，得到劃線菌落，取適量菌落重懸于50mlms液體培養(yǎng)基中，使菌液濃度達(dá)到0.6od以用于轉(zhuǎn)化，然后在超凈臺(tái)上用鑷子把預(yù)培養(yǎng)3天的葉片放于農(nóng)桿菌菌液中浸泡10min，用于侵染，期間不斷晃動(dòng)。在侵染完成后將葉片取出放在無(wú)菌濾紙上，以便充分吸干葉片上殘留的農(nóng)桿菌菌液，然后再將侵染后的葉片均勻平鋪于含有一層無(wú)菌濾紙的煙草共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，于25℃黑暗條件下培養(yǎng)3天。將黑暗條件下培養(yǎng)3天的葉片轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基包括：ms基本培養(yǎng)基(1l分化培養(yǎng)基加入4.4gms基本培養(yǎng)基的固體粉末)、濃度為2mg/l的6-ba、濃度為0.2mg/l的naa、濃度為500mg/l的羧芐青霉素(carbenicillin，cb)、濃度為40mg/l的潮霉素(hygromycin)、濃度為8g/l的agar和濃度為30g/l的蔗糖，ph值為5.8)上進(jìn)行分化，待分化幼芽長(zhǎng)到1cm左右時(shí)，將其切下轉(zhuǎn)入含有10mg/l潮霉素和250mg/l羧芐青霉素的ms基本培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。一般培養(yǎng)2周后外植體可生根，待外植體根系發(fā)達(dá)后移栽至營(yíng)養(yǎng)小缽中，提取其基因組dna，并利用如序列表中seqidno:4所示的上游引物和seqidno:5所示的下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，用于陽(yáng)性苗檢測(cè)，同時(shí)，采用pcambia1381-pbddreb-gus重組表達(dá)載體作為陽(yáng)性對(duì)照，其檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增出的目標(biāo)條帶大小為535bp，與實(shí)際相符，即轉(zhuǎn)基因后的煙草葉片中含有pbddreb啟動(dòng)子。其中，pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系如表1所示；pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性5min；98℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。活性鑒定：取適量轉(zhuǎn)基因煙草t0代種子(由t0代植株培育而成)和野生型種子分別置于2ml離心管中(本實(shí)施例中分別選取150顆種子左右)，用自來(lái)水浸泡1～2h使種子全部沉于離心管的底部，并用自來(lái)水洗滌2～3次以去除種子中的雜質(zhì)。然后在超凈臺(tái)上將浸泡后種子轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的2ml離心管中，并用濃度為70％的乙醇消毒50s，再用濃度為1％的次氯酸鈉溶液消毒6～8min，然后用無(wú)菌水洗滌3～5次(注意在整個(gè)消毒與洗滌的過(guò)程中要不斷晃動(dòng)離心管)。由于pcambia1381:pbddreb重組質(zhì)粒上含有潮霉素選擇標(biāo)記的基因，所以，本實(shí)施例通過(guò)潮霉素選擇具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)基因植株。將消毒后的t0代轉(zhuǎn)基因種子播種于含有50mg/l潮霉素的ms基本培養(yǎng)基上，將野生型煙草種子播種于ms基本培養(yǎng)基上，于25℃條件下12h光照與12h黑暗交替生長(zhǎng)。約6-10天種子萌發(fā)。繼續(xù)培養(yǎng)至兩周大時(shí)，將一部分轉(zhuǎn)基因幼苗與野生型幼苗分別放到含有300mm的甘露醇ms基本培養(yǎng)基中處理6天，用于模擬干旱環(huán)境，然后將未處理的煙草幼苗與經(jīng)過(guò)干旱處理的煙草幼苗分別進(jìn)行g(shù)us活性檢測(cè)；將另一部分轉(zhuǎn)基因幼苗與野生型幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)小缽中培養(yǎng)一個(gè)月后，進(jìn)行控水干旱處理，同樣對(duì)處理前和相應(yīng)處理時(shí)間點(diǎn)的材料(大苗)進(jìn)行g(shù)us活性檢測(cè)，以確定pbddreb啟動(dòng)子是否具有干旱誘導(dǎo)活性。gus活性檢測(cè)按照以下操作步驟進(jìn)行：分別取干旱處理好的植物材料和未經(jīng)干旱處理的植物材料，本發(fā)明實(shí)施例選擇的植物材料為葉片和植株幼苗，使gus染液(購(gòu)自于武漢華納漢慶生物科技有限公司)充分浸沒(méi)植物材料，然后抽真空10min，使gus染液充分滲透植物材料后，再于37℃染色24小時(shí)。在37℃條件下用濃度為95％的乙醇進(jìn)行脫色處理。參見(jiàn)圖6和圖7，結(jié)果顯示：野生型煙草的葉片和植株幼苗在干旱脅迫前后均不能被gus染液染成藍(lán)色，轉(zhuǎn)入pbddreb啟動(dòng)子后的轉(zhuǎn)基因煙草的葉片和植株幼苗在處理前，gus染色沒(méi)有變藍(lán)；而干旱處理6d后經(jīng)gus染色使葉片和植株幼苗均明顯變藍(lán)，其中，圖6和圖7均為調(diào)整成灰白底色后的圖片，深色部位為gus染色部位。這表明pbddreb啟動(dòng)子是受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的，且pbddreb啟動(dòng)子具有高效干旱誘導(dǎo)活性，可用于植物耐旱轉(zhuǎn)基因研究中。本發(fā)明實(shí)施例提供的啟動(dòng)子命名為pbddreb啟動(dòng)子，該pbddreb啟動(dòng)子具有高效干旱誘導(dǎo)活性，可用于植物耐旱轉(zhuǎn)基因，且該pbddreb啟動(dòng)子為誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目標(biāo)基因只有在植株受到合適的誘導(dǎo)信號(hào)時(shí)才會(huì)表達(dá)，從而將外源基因的表達(dá)對(duì)植株的負(fù)面影響降至最小，且pbddreb啟動(dòng)子能夠避免打破植物原有的代謝水平，避免增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，本發(fā)明實(shí)施例提供的pbddreb啟動(dòng)子增加了農(nóng)作物抗旱育種基因資源的選擇，本發(fā)明實(shí)施例提供的制備方法能夠高效快速地制備干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；同時(shí)，含有pbddreb啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子均可用于植物耐旱基因工程的育種改良。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>江漢大學(xué)<120>一種干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、其制備方法、重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化子<160>5<170>patentinversion3.4<210>1<211>1510<212>dna<213>人工序列<400>1cagccttgttgtctccgttagttgccgcatgtgctttttccatttacactctcctttggg60ccaaaaccatccttctactggagatgatttcattaatagtactctctctctgatcatgtc120acttcatcgcttttctccacggccaccacgggctataaccttccttgctttggtgaattt180gcacttccatatgtgtgtgatcattgagcttaatcttctccccggtcctccgttctcacc240acaaccaccggattctccttctggttttgagggctcgacggctataggggacgatgattg300tgcggttatttgatggaaataattgcagccgtgttgcttgttggtctctggagttgctat360gagctgatcaaatgttgtgtcctggagtcatttctgtgctgtcctaaggcatttgtgcgg420ccatcatcagcaccctcctttgctcgttgcctgattcgtttgataataccacgaccggtg480ctgcacattgagcctccttgcggcagcttagcctatgtatgcattggattgctttctcgt540tgttgtatagtaaccatgtacttaggttttatgttttttcttgtgttcttgctccggcga600gatgtactttgaggaatatatattcaggtggggagactccccgagactcccccccccccc660caccccaccttcccaccttcccagagtagacgagggtttgtgtgtttgactcctggaggc720atttggagggggggaaaacatgccctcgctcattttatcaacccacctcaccttaccatg780cgatgcctgcatgtcgtgtttcgtaatcaagccgggctcagacttcttggtatttggttc840tgttaatcaggataagttgttagcggtcaaagaaattttttggatggtttcccaagcatt900aatcgtctcgcgtcctgcacaagtgtctgtatataccgaagaggtgtgccgtcaacctga960agaagcatattctgccctataccgaaacacacaaggagaactttatatttaatctatttt1020tatcagggaatacaaccatcatccaatgattcacttcagagctttggttgtgtacattca1080acacctgcatgacgcatatgttcttgcttctctatagtggagttttctttgcctccgccg1140gagaggagaaagcaaactcgaaaaaaagaaaacatccgtcccttacttcctttgggggcc1200cctctccagtccaggggctgggcgagtggagcccaaaggccacgcctagaagccgccttt1260gctcaacgctgcatttcctcacgcgtcgcttatcaccacctgtccttccctggttggccc1320ttacaccgccccaacctctctctccgcgttacccaaagctataaaagagcacactccaca1380caccagagttactgaactcctcggctcaaactcaaatttcctcgcaaagtcgcaatccgg1440cctccaccgcactccagctcaagctaaaccaaacaaagccagcagcaaccccaaattaaa1500cttcatggcc1510<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2cggaattccagccttgttgtctccgttag29<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列<400>3cccaagcttggccatgaagtttaatttgg29<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4tgattgatgaaactgctgctg21<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5acatatccagccatgcacact21當(dāng)前第1頁(yè)12