本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種副溶血性弧菌的核酸適配體及其應(yīng)用以及檢測副溶血性弧菌的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus,簡稱v.p.)是一種嗜鹽性的革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬，此菌適應(yīng)性強，可生長于溫度5～44℃，ph4.8～11.0，鹽度1～8％范圍的環(huán)境中。副溶血性弧菌廣泛分布于近海岸海水及生長其中的水產(chǎn)品中，例如蝦、蟹、扇貝等。目前常規(guī)的檢測方法已難以滿足對副溶血性弧菌現(xiàn)場快速檢測的實際需求。

最常用的是微生物培養(yǎng)法，根據(jù)副溶血性弧菌的生理生化特性進行鑒定，一般需要增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、生化實驗、血清學(xué)鑒定等步驟。這些方法結(jié)果穩(wěn)定性好且被認(rèn)可為檢測的國標(biāo)方法，但是實驗操作復(fù)雜、耗時長，從采樣到鑒定需要3～5天，而且靈敏度和特異性不高，難以用于現(xiàn)場分析。儀器分析法主要利用氣相色譜法、高效液相色譜法等，主要根據(jù)副溶血性弧菌的化學(xué)組成或產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的特征譜以進行檢測。此類方法結(jié)果可靠且靈敏度高，但需要繁瑣的樣品前處理過程、精密昂貴的儀器和經(jīng)驗豐富的操作人員，不利于在基層推廣。使用分子生物學(xué)方法進行檢測，包括最常用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)pcr、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增lamp等，通過擴增副溶血性弧菌的特異表達基因進行檢測。這種方法大大縮短了檢測時間和簡化了檢測程序，但是前期需要提取細菌總dna或rna，而且存在較高的假陽性率。免疫學(xué)方法是一種基于抗原和抗體之間特異性結(jié)合的原理實現(xiàn)檢測的，常用的有酶聯(lián)免疫吸附法elisa、酶聯(lián)熒光分析法elfa、電化學(xué)分析法等。免疫學(xué)檢測方法具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優(yōu)點，但制備抗體的周期長、成本高，且不適合長期穩(wěn)定保存，因而限制了他們的廣泛應(yīng)用。

核酸適配體(aptamer)是一段寡核苷酸，通過體外人工進化程序(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,selex)篩選得到，它可以高效、特異地結(jié)合各種配體，如蛋白、小分子化合物、細胞等，特異性如同抗體一樣。由于它的易合成、易儲存和易修飾等優(yōu)點，在醫(yī)學(xué)診斷治療、藥物分子設(shè)計及分析檢測中具有良好的應(yīng)用前景。但是，如何將核酸適配體更好的應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測之中，需要進一步的探索和研究。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供副溶血性弧菌的核酸適配體，本發(fā)明的第二個目的在于提供副溶血性弧菌的核酸適配體的應(yīng)用，本發(fā)明的第三個目的在于提供用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒，本發(fā)明的第四個目的在于提供檢測副溶血性弧菌的方法，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的副溶血性弧菌檢測靈敏度低、操作不便的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種副溶血性弧菌的核酸適配體，包括：所述核酸適配體具有如seqidno.1所示的序列：

gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca(seqidno.1)。

另外，本發(fā)明還提供了所述的核酸適配體在下述i或者ii中的應(yīng)用：

i、檢測副溶血性弧菌；

ii、制備用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒。

另外，本發(fā)明還提供了一種用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的核酸適配體、與所述核酸適配體不完全互補的cdna、能夠自組裝成長鏈的兩個發(fā)卡序列h1和h2以及高鐵血紅素；

所述cdna能夠觸發(fā)所述h1和h2的自組裝；

所述h1和h2的3’端和5’端分別具有能夠形成g-四聚體結(jié)構(gòu)的部分前體核苷酸序列。

進一步的，所述cdna與所述核酸適配體不互補的堿基個數(shù)為3-6個。

進一步的，所述cdna的具有如seqidno.2所示的序列：

tagacgccacccacacc(seqidno.2)。

進一步的，所述cdna與所述h1的5’端互補；所述h1的3’端與所述h2的5’端互補，所述h2的3’端與所述h1的5’端互補。

進一步的，

所述h1具有如seqidno.3所示的序列：

agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt(seqidno.3)；

所述h2具有如seqidno.4所示的序列：

tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg(seqidno.4)；

所述h1和h2自組裝成長鏈后，位于所述h13’端的部分前體核苷酸序列，和位于所述h25’端的部分前體核苷酸序列，能夠形成完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)；位于所述h23’端的部分前體核苷酸序列，和位于所述h15’端的部分前體核苷酸序列，能夠形成完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)；

所述完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)結(jié)合所述高鐵血紅素后，能夠形成具有催化活性的dnazyme。

進一步的，所述試劑盒還包括能夠被所述dnazyme催化的底物。

進一步的，所述底物為四甲基聯(lián)苯胺。

另外，本發(fā)明還提供了檢測一種檢測檢測副溶血性弧菌的方法，所述方法包括：

在不存在副溶血性弧菌時，核酸適配體與cdna不完全互補，所述cdna被封閉，h1為發(fā)卡結(jié)構(gòu)，h2為發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

當(dāng)有副溶血性弧菌存在的情況下，副溶血性弧菌與所述核酸適配體結(jié)合，所述cdna被暴露，被暴露的所述cdna與所述h1的5’端互補配對，所述h1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，3’端暴露；所述h1的3’端與所述h2的5’端互補配對，所述h2的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，3’端暴露；所述h2的3’端與所述h1的5’端互補配對，所述h1的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被打開，3’端暴露；依次自組裝成長鏈；

所述h1的3’端與所述h2的5’端互補配對后，位于所述h13’端的能夠形成g-四聚體結(jié)構(gòu)的部分前體核苷酸序列，和位于所述h25’端的能夠形成g-四聚體結(jié)構(gòu)的部分前體核苷酸序列，能夠形成完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)；位于所述h23’端的能夠形成g-四聚體結(jié)構(gòu)的部分前體核苷酸序列，和位于所述h15’端的能夠形成g-四聚體結(jié)構(gòu)的部分前體核苷酸序列，能夠形成完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)；

所述完整的g-四聚體結(jié)構(gòu)結(jié)合高鐵血紅素后，能夠形成具有催化活性的dnazyme，所述dnazyme能夠催化底物顏色的變化，以實現(xiàn)對所述副溶血性弧菌的檢測；

所述核酸適配體具有如seqidno.1所示的序列：

gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca(seqidno.1)；

所述cdna具有如seqidno.2所示的序列：

tagacgccacccacacc(seqidno.2)；

所述h1具有如seqidno.3所示的序列：

agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt(seqidno.3)；

所述h2具有如seqidno.4所示的序列：

tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg(seqidno.4)。

本發(fā)明提供的核酸適配體，能夠特異性的識別副溶血性弧菌，能夠用于副溶血性弧菌的檢測；本發(fā)明提供的試劑盒，具有很高的靈敏度與特異性，操作簡單，檢測快速，結(jié)果肉眼可見，適合所有實驗室進行推廣，無需專業(yè)培訓(xùn)即可實現(xiàn)對副溶血性弧菌的實時現(xiàn)場分析。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為實施例1提供的試劑盒的各序列及其結(jié)構(gòu)；

圖2為實施例2提供的檢測方法的原理圖；

圖3為實施例3中檢測實驗的結(jié)果圖；

圖4為實施例3中檢測實驗的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

除非特別說明，本發(fā)明涉及的“aptamer”即為“核酸適配體”。

本發(fā)明用核酸適配體aptamer作為分子識別元件，捕獲目標(biāo)菌后，通過構(gòu)建的dna自組裝非酶信號擴增系統(tǒng)，用于對副溶血性弧菌的超靈敏可視化檢測。本發(fā)明提供的方案的設(shè)計原理和思路具體如下：

(1)特異性識別副溶血性弧菌apatmer的篩選

本實驗中目標(biāo)菌富集和信號擴增都依賴于所選核酸適配體的親和力及特異性。通過應(yīng)用副溶血性弧菌為正篩菌，沙門氏菌、李斯特菌和大腸桿菌為負(fù)篩菌進行cell-selex篩選，從而篩選出能特異性識別副溶血性弧菌的特異性核酸適配體，為下一步的檢測奠定基礎(chǔ)。通過流式細胞儀分析計算出篩選出來的核酸適配體與目的菌體的解離常數(shù)kd值，從中選擇兩條結(jié)合力最強的核酸序列，則為所需aptamer。獲得的aptamer序列用于下一步內(nèi)容(2)的鏈置換反應(yīng)。

(2)副溶血性弧菌介導(dǎo)的aptamer鏈置換反應(yīng)

以副溶血性弧菌aptamer為識別分子，設(shè)計與aptamer互補的dna序列，分析副溶血性弧菌介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)。在aptamer和互補dna中的臨近末端修飾相應(yīng)的熒光基團和淬滅基團，當(dāng)目標(biāo)菌存在時，可以將aptamer從互補雙鏈中置換下來，通過分析熒光強度來評價鏈置換效果。當(dāng)副溶血性弧菌與aptamer特異性穩(wěn)定結(jié)合后，被封閉的互補dna則暴露出來，從而啟動下一步內(nèi)容(3)的dna自組裝信號放大過程。

(3)dna自組裝通用型信號擴增體系的構(gòu)建

基于莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpin)的dna自組裝，設(shè)計一種通用型的信號擴增體系。這部分需要分析hairpin的結(jié)構(gòu)，通過熒光法評價hairpin與cdna結(jié)合啟動自組裝過程，評價cdna在循環(huán)擴增中的作用。研究啟動鏈的長度對自組裝反應(yīng)的影響，可通過比色法觀察顏色變化強弱進行分析自組裝效率。通過對hairpin的莖環(huán)長度、序列進行改變，來比較信號擴增前后比色法中響應(yīng)值的變化，以優(yōu)化hairpin的自組裝效率。分析hairpin自組裝時間、反應(yīng)體系緩沖液以及反應(yīng)溫度對擴增體系的影響。這樣的自組裝可以將痕量的副溶血性弧菌信號高效放大，產(chǎn)生的大量自組裝dna產(chǎn)物將用于啟動下一步內(nèi)容(4)的可視化分析。

(4)可視化分析平臺的設(shè)計與實現(xiàn)

利用g-quadruplex的過氧化物酶活性特征，以g-quadruplex作為可視化分析的傳感元件，將g-四聚體序列設(shè)計在內(nèi)容(3)中的haripin莖部，使內(nèi)容(2)中產(chǎn)生的單鏈dna能打開hairpin的莖環(huán)結(jié)構(gòu)而激活g-四聚體。激活后的g-四聚體具有dnazyme催化活性，將無色底物氧化成藍色的可溶性產(chǎn)物，直接通過肉眼觀察實驗結(jié)果，適于現(xiàn)場快速檢測分析。對市面上購買的實際樣品進行分析，并將檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)方法、儀器分析方法等進行比較，驗證該核酸傳感平臺的準(zhǔn)確性，進行誤差分析，并進一步優(yōu)化實驗中的主要參數(shù)，穩(wěn)定核酸傳感。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測副溶血性弧菌的方案具有如下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明體系中無需加入聚合酶進行信號擴增，減少了背景信號。

(2)本發(fā)明體系中無需對靶標(biāo)序列進行任何修飾，而且當(dāng)副溶血性弧菌混在實際水產(chǎn)樣品中仍然可以檢測到信號，該方法可以用于實際樣品的定量檢測。

(3)本發(fā)明中用dna自組裝形成的雙鏈作為信號放大方式，反應(yīng)快速方便，縮短了操作時間。

(4)本發(fā)明所述的dna自組裝非酶檢測方法具有很高的靈敏度，檢測限為0.1fm，比已報道的方法高出10多倍，線性范圍0.1fm-1nm。檢測迅速方便，直接肉眼分析，節(jié)約了檢測成本。

(5)本發(fā)明所述的核酸適配體識別靶標(biāo)菌具有很高的特異性，其他物質(zhì)對檢測不產(chǎn)生影響。

(6)通過改變核酸序列，發(fā)明所述的方法可以用于檢測一系列不同的食源性病原微生物。

實施例1用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒

本實施例提供了一種用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒，試劑盒中包括以下物質(zhì)：

核酸適配體，具有如seqidno.1所示的序列：

5’-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3’(seqidno.1)；

cdna，具有如seqidno.2所示的序列：

5’-tagacgccacccacacc-3’(seqidno.2)；

h1，具有如seqidno.3所示的序列：

5’-agggcgggggtgtgggggcgtctaacccacaccttcttgttgggt-3’(seqidno.3)；

h2，具有如seqidno.4所示的序列：

5’-tgggtagacgccacccacaccaagaagacggtgtgggtgggtagggcggg-3’(seqidno.4)；

高鐵血紅素；

四甲基聯(lián)苯胺(tmb)。

其中，核酸適配體與cdna不完全互補結(jié)合，h1和h2各自形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

圖1所示為各序列及結(jié)構(gòu)。

實施例2檢測副溶血性弧菌的方法

本實施例提供了實施例1提供的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)將合成回來的含識別副溶血性弧菌aptamer發(fā)卡序列95℃水浴5min后，慢慢降溫至室溫，使發(fā)卡結(jié)構(gòu)閉合。

(2)向體系中加入2μl的pbs稀釋菌液，室溫反應(yīng)30min，使得副溶血性弧菌與發(fā)卡中的aptamer結(jié)合并打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

(3)打開的發(fā)卡結(jié)構(gòu)將cdna序列游離出來成單鏈狀態(tài)，體系中加入h1和h2發(fā)卡混合液，室溫反應(yīng)1小時，dna進行自組裝反應(yīng)。

(4)向體系中加入hemin，室溫反應(yīng)10min，讓hemin充分摻入自組裝雙鏈中。

(5)向體系中加入底物混合液a+b(其中，a為四甲基聯(lián)苯胺tmb，b為雙氧水)，室溫反應(yīng)5-10分鐘，可見顏色由無色變成藍色，當(dāng)顏色不再加深時，加入h2so4終止反應(yīng)。檢測原理如圖2所示。

實施例3不同濃度的靶標(biāo)副溶血性弧菌的檢測

本實施例針對不同濃度的靶標(biāo)副溶血性弧菌進行了檢測，具體包括以下內(nèi)容：

配制副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)溶液，終濃度分別為100cfu，1000cfu，10000cfu室溫保存。

將不同濃度的菌液分別加到實施例2中(2)所述的反應(yīng)體系中，充分反應(yīng)，檢測490nm處吸光強度和肉眼觀察顏色變化。

從圖3的檢測結(jié)果可以看出，當(dāng)存在副溶血性弧菌時，顏色由無色變成藍色(圖中未示出)，吸光值明顯增加；且隨著菌液濃度的增加，吸光值增加。其中，hemin空白組為只有hemin加磁珠，不加前期自組裝的dna產(chǎn)物，磁珠空白組為只有磁珠，不加前期自組裝的dna產(chǎn)物。

為了評估這個檢測方法的靈敏度，我們配置了不同濃度的副溶血性弧菌，從10cfu到到1015cfu，并測定檢測的吸光值。從圖4的檢測結(jié)果可以看出，當(dāng)10cfu的副溶血性弧菌存在時，吸光值是陰性對照讀數(shù)的三倍以上，說明該方法對副溶血性弧菌的檢測限10cfu，比傳統(tǒng)的檢測方法高出10多倍。并且，隨著菌液濃度的增加(從10cfu到10¹⁵cfu)，吸光值也隨著增加，菌體濃度的對數(shù)(log10)與吸光值呈很好的線性關(guān)系，其線性范圍是從10cfu到10⁹cfu。

其中，圖4的橫坐標(biāo)表示副溶血性弧菌濃度的對數(shù)(log10)，圖3和圖4的縱坐標(biāo)中的“abs”表示吸光值。

針對副溶血性弧菌污染范圍廣、爆發(fā)率高、危害大的特點，本發(fā)明用核酸適配體aptamer作為分子識別元件，捕獲目標(biāo)菌后通過構(gòu)建的dna自組裝非酶信號擴增系統(tǒng)，用于對副溶血性弧菌的超靈敏可視化檢測。該核酸傳感器可在常溫下使用、簡單易操作、檢測成本較低、結(jié)果肉眼可見，適用于現(xiàn)場快速分析海鮮中副溶血性弧菌的污染情況；該比色法分析體系在食品安全檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。而目前還沒有報道dna自組裝技術(shù)用于副溶血性弧菌的檢測，由于這個技術(shù)的優(yōu)勢我們認(rèn)為它是可以很好的符合現(xiàn)代副溶血性弧菌現(xiàn)場檢測的要求。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>青島大學(xué)

<120>副溶血性弧菌的核酸適配體及其應(yīng)用以及檢測副溶血性弧菌的試劑盒和方法

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