本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因非同源性末端接合(Non-homologous end joining，簡稱NHEJ)效率的方法。

背景技術(shù)：

CRISPR/Cas系統(tǒng)是從細菌和古生菌對抗外來病毒或質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)展而來，包括三種不同的類型，其中 Type Ⅱ型的 CRISPR/Cas系統(tǒng)的 DNA 內(nèi)切酶Cas9 只有一個亞基，結(jié)構(gòu)最為簡單，所以應(yīng)用也最廣泛。除了Cas9 蛋白外，該系統(tǒng)還包括兩條短的 CRISPR RNAs（crRNAs）和 trans-activating crRNAs（tracrRNA）。成熟的crRNA-tracrRNA復(fù)合體可以通過堿基互補配對指導(dǎo)Cas9 蛋白到靶序列上，并在 PAM（protospacer adjacent motif）附近特異性剪切 DNA 雙鏈，形成 DSB（double strand break）。DSB 可以通過兩種途徑被修復(fù)，一種是非同源性末端接合（Non-Homologous End Joining NHEJ）DNA修復(fù)方式，另一種是同源重組修復(fù)（ Homology Directed Repair HDR) 方式。NHEJ 修復(fù)方式可能產(chǎn)生堿基的插入或缺失，從而產(chǎn)生移碼突變，或者也可能突變成終止密碼子，這些突變形式都可以改變目的基因的開放閱讀框；HDR 方式需要一段與被剪切片段同源的模板片段來修復(fù)DSB，這種修復(fù)方式可以將被用來作為模板的同源片段的序列復(fù)制到目的基因中，所以可以利用這種修復(fù)方式將特定的基因片段引入到目的基因中。

Cas9有時較差的切割效率可能與DNA是如何修復(fù)的相關(guān)聯(lián)，這是因為DNA修復(fù)機制---基本的管家酶修復(fù)DNA中的任何可能導(dǎo)致致命性突變的斷裂或缺失---在不同細胞之間存在差異。他推斷與人基因組不存在同源性的寡核苷酸可能干擾這種修復(fù)過程，從而提高基因敲除成功率。

CRISPR-Cas9基因編輯可以認為是切割和DNA修復(fù)之間的競爭：一旦Cas9進行切割，細胞精確地替換受到切割的DNA，隨后Cas9再次切割這種受到替換的DNA，從而陷入一種無盡的切割和修復(fù)的循環(huán)，直到這些修復(fù)酶發(fā)生錯誤，這些基因最終都失去功能。這些寡核苷酸可能會降低這種修復(fù)過程的保真度，或者說讓細胞切換到一種更加容易發(fā)生的修復(fù)過程，從而允許Cas9更容易讓基因發(fā)生斷裂。本發(fā)明可以極大的提高了CRISPR/Cas9敲除效率，同時使該技術(shù)更加的簡單、易操作。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因NHEJ效率的方法。具體來說，本發(fā)明設(shè)計篩選出高效干擾pten基因表達的小分子干擾RNA，使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向敲除基因時，共轉(zhuǎn)染該小分子RNA，可以有效的提高靶基因的NHEJ效率。在細胞多個靶點驗證，均有明顯提高，該方法成本低、操作簡單、效率高。對于CRISPR/Cas9技術(shù)的效率和應(yīng)用具有很好的促進作用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

1、高效干擾人pten基因表達的小分子干擾RNA，設(shè)計、合成以及篩選；

2、 設(shè)計、構(gòu)建敲除人pten基因的CRIPSR/Cas9載體，并共轉(zhuǎn)染篩選得到的小分子干擾RNA，通過檢測靶位點產(chǎn)生的NHEJ效率，確認CRISPR/Cas9載體共轉(zhuǎn)染小分子干擾RNA是否可以提高NHEJ效率；

3、 將小分子干擾RNA應(yīng)用于多個CRISPR/Cas9靶位點編輯驗證，確認小分子干擾RNA提高NHEJ效率的準確性。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1 為反轉(zhuǎn)錄PCR檢測pten基因的表達量（其中M為DL2000，1為pten-RNAi-1，2為pten-RNAi-1， 3為pten-RNAi-3，4為pten-RNAi-4，5為pten-RNAi-5，PCR擴增264bp大小片段）；

圖2為Lin28a兩個靶點區(qū)域PCR產(chǎn)物T7 Endonuclease I酶切產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果（其中A組為小干擾RNA+ PX458-Lin28A-T1 ，B組為小干擾RNA+ PX458-Lin28A-T5，C組為PX458-Lin28A-T1，D組為PX458-Lin28A-T5，E組為小干擾RNA，F(xiàn)組為PBS）。

具體實施方式

下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J. 薩姆布魯克等著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)基因PTEN的CDS區(qū)域，并結(jié)合NCBI Primer-BLAST設(shè)計引物序列，同時根據(jù)專利（201611252179.5）合成lin28a基因靶位點區(qū)域擴增引物，序列如下：

通過在線軟件設(shè)計出5條針對PTEN基因的小干擾RNA序列，并合成，其對應(yīng)的RNA序列如SEQ ID NO .1 --SEQ ID NO .5所示。

實驗具體步驟

轉(zhuǎn)染前3天，復(fù)蘇人胚胎腎細胞（293T細胞株，中科院上海細胞庫），將細胞放入加有10%的FBS+DMEM培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1天，傳代培養(yǎng)復(fù)蘇細胞；

將培養(yǎng)293T細胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2 mL 4℃冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37℃培養(yǎng)箱中3~5 min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3 mL 37℃水浴中預(yù)熱的10％FBS+DMEM培養(yǎng)基，用10 mL移液管進行吹打，將細胞懸浮液收集、離心；

轉(zhuǎn)染前1天，接種2×10⁴個293T細胞至48孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度達到80％；

實驗分組為pten-RNAi-1轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-2轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-3轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-4轉(zhuǎn)染組，pten-RNAi-5轉(zhuǎn)染組，PBS轉(zhuǎn)染組（對照組）每組6個復(fù)孔；

小干擾RNA與轉(zhuǎn)染試劑：每孔加入小干擾RNA 20pmol：轉(zhuǎn)染試劑1.0μL：用50μL Opti-MEM稀釋，輕輕吹吸3~5 次混勻，室溫下靜置20 min，隨后加入培養(yǎng)皿中進行細胞轉(zhuǎn)染（詳細步驟參見Lipofectamine 2000使用說明書），轉(zhuǎn)染操作完成后，經(jīng)過37℃培養(yǎng)4h后，用10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)；

1.將細胞培養(yǎng)至24 h，使用PBS清洗一次細胞，加Beyozol Reagent 裂解細胞，室溫放置5 min；

2.每管加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩離心管15 s，室溫放置3 min，離心12000g，4℃ 15 min。

3.離心后取上清，加入等體積的異丙醇，冰浴10 min，離心12000g，4℃ 10 min；

4.離心后移去上清，用1mL75%的乙醇洗滌，然后離心7400g，4℃ 5分鐘；

5.移去乙醇溶液，自然晾干5分鐘，再加入DEPC水溶解RNA；

6.檢測RNA質(zhì)量；

7.將提好的Total RNA作為模板，用Takara PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit貨號6210A/B合成cDNA；

逆轉(zhuǎn)錄操作步驟：

（1）準備混合體系如下：

（2）65℃孵育5min；立刻放置冰上冷卻；

（3）準備反應(yīng)體系如下：

（4）輕輕混勻；

（5）在42℃孵育60 min；

（6）95℃孵育5 min是逆轉(zhuǎn)錄酶失活并終止反應(yīng)。

8.根據(jù)目的基因Strn設(shè)計1對引物進行PCR，反應(yīng)體系如下：

9.電泳，取5 μL PCR產(chǎn)物，1.0% agrose regular，100V 1X TAE buffer，20 min；

10.根據(jù)電泳結(jié)果判斷5個小干擾RNA轉(zhuǎn)染處理的細胞中pten基因的表達量，如附圖1所示，

從PCR條帶亮度可以看出：2、4、5號條帶較弱，具有明顯的干擾效率。

根據(jù)專利（201611252179.5）中篩選到的敲除Lin28a基因CRISPR/Cas9 兩個靶位點序列，分別構(gòu)建出對應(yīng)的CRIPSR/Cas9載體，根據(jù)專利（201611252179.5）中名稱為PX458-Lin28A-T1和PX458-Llin28A-T5，構(gòu)建載體詳細步驟參照專利（201611252179.5）。

共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1天，接種2×10⁴個293T細胞至48孔培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時的細胞密度達到80％。pten基因小干擾RNA分別與CRISPR/Cas9載體PX458-lin28A-T1和PX458-lin28A-T5共轉(zhuǎn)染人293T細胞株，具體實驗分組：A組為小干擾RNA+ PX458-Lin28A-T1 ，B組為小干擾RNA+ PX458-Lin28A-T5，C組為PX458-Lin28A-T1，D組為PX458-Lin28A-T5，E組為小干擾RNA，F(xiàn)組為PBS。

配置RNA與轉(zhuǎn)染試劑：每孔加入小干擾RNA 20 pmol：轉(zhuǎn)染試劑=1.0 μL：用50 μL Opti-MEM稀釋，輕輕吹吸3~5 次混勻，室溫下靜置20 min。

PX458-Lin28A-T1/ PX458-Lin28A-T5：轉(zhuǎn)染試劑=0.8 μg：2μL用50 μLOpti-MEM稀釋，輕輕吹吸混勻，室溫下靜置20 min。

根據(jù)實驗分組，采用上述配制方法將小干擾RNA與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞。

轉(zhuǎn)染操作完成后，經(jīng)過37℃培養(yǎng)4 h后，用10%FBS+DMEM培養(yǎng)基的完全培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)。待將細胞培養(yǎng)至24 h生效率。

以提取的DNA為模板，擴增靶點序列，采用T7 Endonuclease I酶切鑒定，驗證靶點序列突變情況。

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)后72℃延伸5 min，最后4℃保溫。

PCR產(chǎn)物用T7 Endonuclease I 37℃水浴酶切1h，酶切體系如下：

酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，果圖2顯示各組（A組、 B組、C組、D組、E組和F組）靶位點NHEJ效率，軟件分析條帶的灰度值 InDel(%)：A組7.8%、B組8.6%、C組為2.3%、D組為1.1%，小干擾RNA對于CRISPR/Cas9靶向敲除Lin28a基因的兩個靶位點的形成NHEJ效率分別提高了3.39倍和7.8倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶高圣生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司

<120> 一種提高CRIPSR/Cas9靶向敲除基因產(chǎn)生非同源性末端接合效率的方法

<130> 2017

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaucuugacc aauggcuaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uuagccauug gucaagauc 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcuaaguga agaugacaa 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uugucaucuu cacuuagcc 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcuaagugaa gaugacaau 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

auugucaucu ucacuuagc 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gguguaauga uaugugcau 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

augcacauau cauuacacc 19

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<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcacaagagg cccuagauu 19

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<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaucuagggc cucuugugc 19