本發(fā)明涉及大麥轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建，特別涉及運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除HvHPT(MLOC_37476)基因的應用。
背景技術(shù)：
：維生素E(vitaminE，VE)是由光合生物合成的生育酚類化合物的總稱。根據(jù)側(cè)鏈是否飽和，VE可以分為生育酚(tocophero1)和生育三烯酚(tocotrieno1)兩大類。根據(jù)芳香環(huán)上甲基位置和數(shù)目的不同，每類又可分為α，β，γ，δ四種形式，其中，α-生育酚活性最高。近些年來，由于生育三烯酚在某些方面更優(yōu)越的生物學特性，備受人們關(guān)注。不僅表現(xiàn)在抗氧化活性，在降膽固醇、預防糖尿病、促進骨吸收、抗癌、神經(jīng)保護等方面也有一定的作用。大麥是世界上四大糧食作物之一，主要用于食品生產(chǎn)、動物飼養(yǎng)、啤酒制造等領域。另外，由于大麥含有豐富的生物活性物質(zhì)如β-葡聚糖、酚類物質(zhì)、維生素E等，也常被用作功能食品開發(fā)的原料。大麥谷粒，含有豐富的生育三烯酚，大概占VE總含量的70％，是研究生育三烯酚的好材料。因此利用基因工程手段調(diào)控大麥谷粒中的VE合成通路，可以提高大麥生育三烯酚的含量，從而起到增加大麥谷粒營養(yǎng)成分的作用。目前由于大麥突變體庫的缺乏，限制了大麥VE合成通路中相關(guān)基因的功能研究。近年來發(fā)展起來的以CRISPR-Cas9為代表的新一代基因組編輯技術(shù)，為植物基因工程帶來了新的革命，已成為基因功能研究和作物品質(zhì)改良的重要手段之一。運用基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)改造相關(guān)基因，并通過自交、分子鑒定和后代篩選，獲得“非轉(zhuǎn)基因”大麥新材料，可為今后將成果應用于生產(chǎn)實踐提供依據(jù)和技術(shù)支持。但是因為大麥基因轉(zhuǎn)化效率低，穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因材料的獲得周期長，目前運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)研究大麥基因的報導很少見。因此，應用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除大麥VE合成通路中的關(guān)鍵基因(HvHPT)而獲得的大麥突變體，可為HvHPT基因的功能研究提供可靠材料。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除大麥HPT基因的編輯方法，以獲得HPT基因突變的理想突變體。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：提供一種運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除大麥HPT基因的編輯方法，包括以下步驟：(1)gRNA靶位點的選擇由于HPT基因位于大麥基因組的七號染色體上，根據(jù)CRISPR-Cas9技術(shù)的靶位點設計原則，應盡量將gRNA靶位點設計在外顯子區(qū)并且要設計在基因的5’端(因該基因編碼的是蛋白質(zhì)，5’端編碼的正好是蛋白質(zhì)的功能區(qū)域)。(2)gRNA片段的克隆以質(zhì)粒pGTR為模板，用PCR方法克隆四個片段L1、L2、L3、L4部分重疊的片段，引物序列如下，其中F和R分別代表正、反向引物：L1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGGL1-R：CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGGL2-F：TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAAL2-R：CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGGL3-F：TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAAL3-R：CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGGL4-F：TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAAL4-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGPCR體系為：Phusion酶0.5μL；5×PhusionHFBuffer10μL；上下游引物各2.5μL；dNTPs4μL；pGTRplasmid0.5μL；三蒸水30μL，共50μL體系。PCR反應條件為：預變性95℃，5min；變性95℃，30s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s；共33個循環(huán)；最后72℃延伸10min；PCR反應后，取5-10μL產(chǎn)物，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收目的片段，測定四個PCR產(chǎn)物L1、L2、L3、L4的濃度；(3)GG(gRNA-gRNA)片段的連接根據(jù)測定的PCR產(chǎn)物濃度，將四個片段等量混合，T7酶連接反應與BsaI酶切反應同時進行；取L1、L2、L3、L4各2μL，與10μLT7ligasebuffer、1μLBsaI-HF、0.5μLT7ligase、0.5μL水混合；在PCR儀中進行如下反應：37℃，5min；20℃，10min；30-50個循環(huán)；(4)連接產(chǎn)物的PCR擴增；連接反應結(jié)束后，取連接產(chǎn)物1μL，加19μL水稀釋，將稀釋后的產(chǎn)物作為模板，進行PCR擴增；PCR結(jié)束后，取5μL產(chǎn)物進行電泳檢測，并將產(chǎn)物純化；產(chǎn)物大小為500bp；引物序列如下，其中F和R分別代表正、反向引物：S1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAS1-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC(5)純化產(chǎn)物和目標載體的酶切FokI酶切純化產(chǎn)物暴露黏性末端，同時BsaI酶切空載體pRGEB32；酶切體系為50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG純化產(chǎn)物和空載體pRGEB32；酶切時間3-4h，酶切溫度37℃；用2％瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物，并回收目標產(chǎn)物，測定濃度；(6)純化產(chǎn)物和目標載體的連接反應取酶切回收的GG純化產(chǎn)物與pRGEB32載體等量混合(50ng)，T4DNAligase1μL，10×T4DNAligaseBuffer1μL，加三蒸水至20μL，4℃連接過夜；(7)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)將連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂板，37℃過夜；挑取單菌落，搖菌6-8h，提取質(zhì)粒，PCR鑒定目標片段是否連入載體；鑒定正確的質(zhì)粒送去測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1；(8)農(nóng)桿菌介導的大麥轉(zhuǎn)基因以GoldenPromise野生型大麥的幼胚為外植體材料，以AGL1農(nóng)桿菌進行感染轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選，抗性愈傷組織分化再生獲得轉(zhuǎn)基因植株；(9)陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，在三個gRNA序列的兩側(cè)設計引物，對目的片段進行PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠電泳和垂直聚丙烯凝膠電泳檢測突變體；(10)突變體測序?qū)⒁陨贤蛔冎晗礟CR產(chǎn)物進行純化回收，連接T載體測序，確認獲得敲除了大麥HPT基因的突變材料。發(fā)明原理描述：VE的合成通路比較復雜，生育酚和生育三烯酚有共同的合成前體尿黑酸(homogentisate，HGA)。其中生育三烯酚合成的限速步驟是由尿黑酸牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶(homogentisategeranylgeranyltransferase，HGGT)催化HGA和牻牛兒焦磷酸(geranylgeranyldiphosphate，GGDP)的合成反應；而生育酚合成的限速步驟是由尿黑酸植基轉(zhuǎn)移酶(homogentisatephytyltransferase，HPT)催化HGA和植基二磷酸(phytyldiphosphate，PDP)的合成反應。HGGT、HPT分別是生育三烯酚、生育酚合成過程中的關(guān)鍵基因，因此可以通過敲除生育酚合成通路中的關(guān)鍵限速酶基因HPT來調(diào)節(jié)代謝流，從而起到提高或者分離生育三烯酚組分的作用。CRISPR-Cas系統(tǒng)可定點修飾(刪除、添加、激活、抑制)靶細胞中特定的基因序列，為靶向性編輯基因組序列提供行之有效的技術(shù)手段。但是，目前尚無運用該技術(shù)敲除大麥VE合成通路中的關(guān)鍵基因HPT的報道。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明利用先進的基因編輯技術(shù)-CRISPR-Cas9系統(tǒng)對大麥VE合成通路中的關(guān)鍵基因(HPT)進行靶向基因編輯，獲得有效的功能缺失突變體，為大麥中生物活性物質(zhì)的研究創(chuàng)造條件。附圖說明圖1為靶向大麥HPT基因的3個gRNA位點示意圖；圖2為瓊脂糖凝膠電泳檢測大片段缺失突變體；圖3為PAGE凝膠電泳檢測突變體；圖4為突變株系目的片段測序結(jié)果的比較(點狀虛線表示缺失堿基，單下劃線表示插入堿基)。具體實施方式實施例1大麥VE合成通路中的關(guān)鍵限速酶基因敲除株系HPT的獲得與鑒定。本發(fā)明所用大麥品種為HordeumvulgareL.,cv.Goldenpromise，申請人承諾：從本專利申請之日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放該大麥品種，以用于實現(xiàn)、利用本發(fā)明所述技術(shù)方案。1.gRNA靶位點的選擇由于HPT基因位于大麥基因組的七號染色體上，根據(jù)CRISPR-Cas9技術(shù)的靶位點設計原則，本發(fā)明將gRNA靶位點設計在外顯子區(qū)并且要設計在HPT基因的5’端(因該基因編碼的是蛋白質(zhì)，5’端編碼的正好是蛋白質(zhì)的功能區(qū)域)。如圖1所示。2.gRNA片段的克隆及載體構(gòu)建2.1以質(zhì)粒pGTR為模板，用PCR方法克隆四個片段L1、L2、L3、L4部分重疊的片段，引物序列如下：L1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG(如SEQIDNO：1所示)L1-R：CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG(如SEQIDNO：2所示)L2-F：TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQIDNO：3所示)L2-R：CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG(如SEQIDNO：4所示)L3-F：TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQIDNO：5所示)L3-R：CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG(如SEQIDNO：6所示)L4-F：TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA(如SEQIDNO：7所示)L4-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG(如SEQIDNO：8所示)PCR擴增L1片段體系如下：Phusion酶0.5μL5×Buffer10μLL1-F2.5μLL1-R2.5μL三蒸水30μLdNTPs4μL模板(pGTRplasmid)0.5μL總計50μLPCR擴增L2片段體系如下：Phusion酶0.5μL5×Buffer10μLL2-F2.5μLL2-R2.5μL三蒸水30μLdNTPs4μL模板(pGTRplasmid)0.5μL總計50μLPCR擴增L3片段體系如下：PCR擴增L4片段體系如下：Phusion酶0.5μL5×Buffer10μLL4-F2.5μLL4-R2.5μL三蒸水30μLdNTPs4μL模板(pGTRplasmid)0.5μL總計50μLPCR反應程序為：PCR反應后，取5-10μL產(chǎn)物，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化回收目的片段，測定產(chǎn)物濃度。L1，L2，L3，L4產(chǎn)物大小約為130bp，200bp，200bp，150bp。2.2GG(gRNA-gRNA)片段的連接。按照上步測定的產(chǎn)物濃度，將4個片段等量混合，T7酶連接。反應體系如下：試劑體積(μL)L12L22L32L422×T7ligasebuffer10BsaI-HF1T7ligase0.5三蒸水0.5總體積20以上連接反應在PCR儀中進行：37℃，5min；20℃，10min；30-50個循環(huán)。2.3連接產(chǎn)物的PCR擴增連接反應結(jié)束后，取連接產(chǎn)物1μL，加19μL水稀釋，將稀釋后的產(chǎn)物作為模板，以S1-F、S1-R為引物進行PCR擴增。S1-F：CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA(如SEQIDNO：9所示)S1-R：TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC(如SEQIDNO：10所示)PCR體系如下：試劑體積(μL)稀釋后的GG產(chǎn)物2.5S1-F2.5S1-R2.52×TaqMix25三蒸水17.5總體積50PCR反應程序為：取5-10μLPCR產(chǎn)物電泳檢測，產(chǎn)物大小約為500bp，并將產(chǎn)物純化。2.4將上一步純化的產(chǎn)物，F(xiàn)okI酶切暴露黏性末端，同時BsaI酶切空載體pRGEB32。酶切體系為50μL，包括底物5μL、FokI或BsaI酶5μL、Buffer(cutsmart)10μL；底物包括GG純化產(chǎn)物和空載體pRGEB32；酶切時間3-4h，作用溫度37℃；用2％瓊脂糖凝膠檢測酶切產(chǎn)物，并回收目標產(chǎn)物，測定濃度；2.5酶切后的GG連接產(chǎn)物與目標載體pRGEB32的連接。試劑體積(μL)酶切后的GG連接產(chǎn)物50ng酶切后的載體pRGEB3250ngT4DNAligase110×T4ligasebuffer1三蒸水補至10總體積103.將連接后的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂板，37℃過夜；挑取單菌落，搖菌6-8h，提取質(zhì)粒，PCR鑒定目標片段是否連入載體；鑒定正確的質(zhì)粒送去測序。PCR鑒定及測序引物為U3-F，UGW-gRNA-R。序列如下：U3-F：AGTACCACCTCGGCTATCCACA(如SEQIDNO：11所示)UGW-gRNA-R：CGCGCTAAAAACGGACTAGC(如SEQIDNO：12所示)4.將測序正確的質(zhì)粒，電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1。5.農(nóng)桿菌介導的大麥的遺傳轉(zhuǎn)化以野生型大麥(HordeumvulgareL.,cv.GoldenPromise)的幼胚為材料誘導愈傷組織，以AGL1農(nóng)桿菌進行感染轉(zhuǎn)化，經(jīng)潮霉素抗性篩選，抗性愈傷組織分化再生獲得轉(zhuǎn)基因植株；6.陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選6.1瓊脂糖凝膠電泳檢測大片段缺失突變體以葉片為材料，提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，在3個gRNA位點的兩側(cè)設計引物進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。(結(jié)果見圖2)引物序列如下所示：H1-F：ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT(如SEQIDNO：13所示)H2-R：ACCTCCAGCAATCCAGTAAG(如SEQIDNO：14所示)6.2PAGE膠檢測小片段變化的突變體以葉片為材料，提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA，在每個gRNA位點兩側(cè)設計引物進行PCR。在常規(guī)PCR反應結(jié)束后，再對PCR產(chǎn)物進行高溫變性、復性反應，PCR程序和變性復性步驟如下表：引物如下所示：H1-F：ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT(如SEQIDNO：13所示)H1-R：TTACAAGAGGCGTTGCTGGTTCATT(如SEQIDNO：15所示)H2-F：CCACAACAAATCTACCGTCTC(如SEQIDNO：16所示)H2-R：ACCTCCAGCAATCCAGTAAG(如SEQIDNO：14所示)結(jié)果見圖3。7.突變株系的基因測序?qū)⒁陨贤蛔冎晗礟CR產(chǎn)物進行純化回收。大片段缺失的突變體可直接割膠回收測序，小片段變化的突變體則需連接T載體進行測序。測序公司為杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。測序結(jié)果見圖4。測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)了15#株系存在746bp的大片段缺失，獲得了敲除大麥HPT基因的理想突變材料。<110>浙江大學<120>運用CRISPR-Cas9系統(tǒng)敲除大麥VE合成通路中的關(guān)鍵基因HPT的方法<160>16SEQIDNO：1<210>1<211>46<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L1的正向引物L1-F<400>1CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG46SEQIDNO：2<210>2<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L1的反向引物L1-R<400>2CGGGTCTCACCCCTACCCTATTGCACCAGCCGGG34SEQIDNO：3<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L2的正向引物L2-F<400>3TAGGTCTCCGGGGGTAGGGGTGTTTTAGAGCTAGAA36SEQIDNO：4<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L2的反向引物L2-R<400>4CGGGTCTCACATACTGTTCCTTGCACCAGCCGGG34SEQIDNO：5<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L3的正向引物L3-F<400>5TAGGTCTCCTATGCCGAAACGGTTTTAGAGCTAGAA36SEQIDNO：6<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L3的反向引物L3-R<400>6CGGGTCTCACAGTATCGTGTGTGCACCAGCCGGG34SEQIDNO：7<210>7<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L4的正向引物L4-F<400>7TAGGTCTCCACTGCAAGCTTCGTTTTAGAGCTAGAA36SEQIDNO：8<210>8<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR克隆片段L4的反向引物L4-R<400>8TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG52SEQIDNO：9<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于連接產(chǎn)物PCR擴增正向引物S1-F<400>9CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA31SEQIDNO：10<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于連接產(chǎn)物PCR擴增反向引物S1-R<400>10TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC31SEQIDNO：11<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR鑒定及測序的引物U3-F<400>11AGTACCACCTCGGCTATCCACA22SEQIDNO：12<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PCR鑒定及測序的引物UGW-gRNA-R<400>12CGCGCTAAAAACGGACTAGC20SEQIDNO：13<210>13<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于電泳檢測的PCR擴增引物H1-F<400>13ACCTTTCAGTCAGTGGCTTTGAACT25SEQIDNO：14<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于電泳檢測的PCR擴增引物H2-R<400>14ACCTCCAGCAATCCAGTAAG20SEQIDNO：15<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PAGE膠檢測的PCR擴增引物H1-R<400>15TTACAAGAGGCGTTGCTGGTTCATT25SEQIDNO：16<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于PAGE膠檢測的PCR擴增引物H2-F<400>16CCACAACAAATCTACCGTCTC21當前第1頁1 2 3