本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及一種調(diào)控tgf-β1-smads通路的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

心肌梗死后心室重構(gòu)主要包括心肌細胞的壞死、凋亡、肥大和纖維化，其中心肌細胞間質(zhì)的纖維化是心肌梗死后重塑的主要病理改變，包括心肌成纖維細胞活性增加和心肌間細胞外基質(zhì)的增多等，最后導致心律失常和心力衰竭。

核受體是一類配體依賴型轉(zhuǎn)錄因子的超家族成員，視黃醇x受體(retinoidxreceptor,rxr)是核受體超家族重要成員，參與調(diào)節(jié)細胞的分化和增生、調(diào)控細胞能量代謝、脂質(zhì)合成及免疫功能，在調(diào)控心血管疾病的病理生理進程中發(fā)揮重要作用。rxr能與其他多種核受體發(fā)生交聯(lián)作用，如維生素d受體(vitamindreceptor)、甲狀腺激素受體(tr)、過氧化物酶體增生物受體(peroxisomeproliferatorsactivatedreceptorα,β,γ,pparα,β,γ)和肝臟x受體(liverxreceptor,lxr)等，都可與rxr形成異源二聚體(如vdr/rxr、tr/rxr、ppar/rxr、lxr/rxr等)，提高它們與dna結(jié)合的效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控tgf-β1-smads通路的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種rxrα受體激動劑的用途，用于制備藥物或試劑，所述藥物或試劑用于選自下組的一種或多種用途：

(1)降低tgf-β1、和/或p-smad3的水平；

(2)提高p-smad2、和/或smad7水平；

(3)抑制心?、　⒑?或ⅲ型膠原合成；

(4)抑制心肌細胞的凋亡；

(5)治療tgf-β1相關(guān)的疾病。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括抑制急性心肌梗死對象額心?、　⒑廷Ｐ湍z原合成。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括降低心肌梗死交界區(qū)tgf-β1、和/或p-smad3的水平。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括提高心肌梗死交界區(qū)p-smad2和/或smad7的水平。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括降低p-smad3水平，并且提高p-smad2的水平。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括抑制心肌梗死后膠原合成，從而改善心室重構(gòu)。

在另一優(yōu)選例中，所述用途包括改善心肌梗死后心肌細胞的凋亡。

在另一優(yōu)選例中，所述rxrα受體激動劑為蓓薩羅丁、其類似物、其衍生物或其藥學上可接受的鹽。

在另一優(yōu)選例中，所述“tgf-β1相關(guān)的疾病”為心肌梗死。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種體外非治療性地降低tgf-β1和/或p-smad3水平的方法，包括步驟：將rxrα受體激動劑與細胞接觸，從而降低細胞tgf-β1和/或p-smad3的水平。

在另一優(yōu)選例中，所述的接觸是在rxrα受體激動劑存在下，培養(yǎng)所述細胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的細胞包括心肌細胞。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還用于至少以下一種應(yīng)用：

體外非治療性地提高p-smad2、和/或smad7水平；

體外非治療性地抑制心?、　⒑?或ⅲ型膠原合成；和

體外非治療性地抑制心肌細胞的凋亡。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種預防和/或治療tgf-β1、和/或smads相關(guān)疾病的方法，其中所述疾病與tgf-β1和/或p-smad3的過表達或活性過高有關(guān)，所述方法包括步驟：給需要的對象施用rxrα受體激動劑，或施用含rxrα受體激動劑的藥物組合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的tgf-β1和/或smads相關(guān)疾病包括心肌梗死。

在另一優(yōu)選例中，所述的施用包括：靜脈注射、口服片劑、肌肉注射等。

在另一優(yōu)選例中，所述的對象為哺乳動物。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種方法，所述方法用于體內(nèi)或體外降低tgf-β1和/或p-smad3的水平、或者提高p-smad2、和/或smad7水平，所述方法包括步驟：給需要的對象施用rxrα受體激動劑。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了sd大鼠冠脈左前降支結(jié)扎后心電圖變化。10％水合氯醛腹腔麻醉，4-5肋間暴露心臟，左心耳下緣2-3mm處結(jié)扎左前降支。a.結(jié)扎前肢體導聯(lián)ii，紙速為50mm/s；b.結(jié)扎后；與結(jié)扎前相比，可見ii導聯(lián)st段明顯抬高。

圖2顯示了不同組別大鼠的心臟大體形態(tài)。

圖3顯示了各實驗組心臟超聲檢測圖像。

圖4顯示了各實驗組he染色圖像(×200倍)。control組和sham組心肌排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，偶見炎癥細胞；mi組心肌排列紊亂數(shù)量減少，炎性細胞浸潤，間質(zhì)可見大量增生組織；mi+bex10和mi+bex30治療組結(jié)構(gòu)較為完整，心肌細胞的排列相對整齊，間質(zhì)增生組織較少。

圖5顯示了各實驗組天狼猩紅染色圖像(×200倍)。control組和sham組心肌組織中可見少量紅染絲狀纖維；mi組紅染纖維明顯增多呈片狀彌漫性分布；mi+bex10和mi+bex30治療組膠原呈細束狀浸潤性分布。

圖6顯示了各實驗組i型、ⅲ型膠原免疫組化圖像(×200倍)。control組和sham組無明顯膠原蛋白表達；mi組可見ⅰ型、ⅲ型膠原蛋白表達明顯增加；mi+bex10和mi+bex30治療組ⅰ型、ⅲ型膠原蛋白表達減少。

圖7a-圖7d顯示了各組大鼠心肌組織tgf-β1、smad2、p-smad2、smad3、p-smad3及smad7蛋白表達的比較。各組凝膠電泳膠片曝光圖及對應(yīng)的曝光膠片光密度分析圖：圖7a：tgf-β1、β-actin；圖7b：smad7、β-actin；圖7c：p-smad2、smad2及β-actin；圖7d：p-smad3、smad3及β-actin。每個試驗重復3次，數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝3)?！鏿<0.05，vssham組；+p<0.05，vsmi組；#p<0.05，vsmi+bex10組。

圖8顯示了各組大鼠心肌tunel染色凋亡情況(×200倍)。control組、sham組、mi組、mi+bex10組及mi+bex30組大鼠心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)tunel染色凋亡圖像。

圖9顯示了不同組別心肌梗死邊緣區(qū)組織超微結(jié)構(gòu)圖像(×8k倍)。control組、sham組、mi組、mi+bex10組及mi+bex30組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織超微結(jié)構(gòu)圖像。

具體實施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)rxrα激動劑bex能夠抑制急性心肌梗死大鼠心肌ⅰ、ⅲ型膠原合成，并改善心功能；rxrα激動劑bex可以顯著降低心肌梗死交界區(qū)tgf-β1、p-smad3的水平，并提高p-smad2和smad7水平；rxrα激動劑bex可能通過tgf-β1/smads信號通路抑制心肌梗死后膠原合成，從而改善心室重構(gòu)；rxrα激動劑bex可改善心肌梗死后心肌細胞的凋亡。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。

轉(zhuǎn)化生長因子β1

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforminggrowthfactor-β,tgf-β)屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的tgf-β超家族。tgf-β是一個多功能的多效性生長因子對細胞增殖、遷移、分化和凋亡具有廣泛的影響。在哺乳動物中，tgf-β有三個亞型(tgf-β1，2和3)，由三個不同的基因編碼。tgf-β的生物學功能研究主要在炎癥、組織修復和胚胎發(fā)育等方面，近年來發(fā)現(xiàn)tgf-β對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用。tgf-β1、β2和β3功能相似，一般來說，tgf-β對間充質(zhì)起源的細胞起刺激作用，而對上皮或神經(jīng)外胚層來源的細胞起抑制作用。tgf-β的主要功能包括：(1)抑制免疫活性細胞的增殖；(2)對細胞表型的調(diào)節(jié)；(3)抑制淋巴細胞的分化；(4)抑制細胞因子產(chǎn)生等。

雖然tgf-β亞型的信號通過相同的細胞表面受體和共同的靶細胞，但它們具有不同的表達模式。tgf-β1是心血管系統(tǒng)中主要的亞型并且廣泛表達，而其他亞型在有限的細胞和組織的光譜發(fā)現(xiàn)。雖然三種亞型在體內(nèi)的功能可能不同，目前對其在心肌纖維化作用大部分知識僅限于tgf-β1。在心肌纖維化的分子機制中，tgf-β也許是最主要的致纖維化生長因子，tgf-β在心肌纖維化實驗動物模型和人心臟纖維化中能夠顯著而持續(xù)的被激活。

tgf-β1是以一種休眠復合物存在于正常心臟中，無法與它的受體聯(lián)系。心臟損傷后，細胞外聚集的休眠狀態(tài)的tgf-β被迅速轉(zhuǎn)化為活性形式；相對少量的休眠復合物tgf-β的激活足以引起巨大的細胞反應(yīng)。廣泛的介質(zhì)已被描述為tgf-β“激活”物，在激活過程的不同階段發(fā)揮作用。蛋白酶，如纖維蛋白溶酶，金屬蛋白酶2(mmp-2)和金屬蛋白酶9(mmp-9)，連接基質(zhì)降解的活化分子，保持基質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性。在心臟重構(gòu)中，細胞外基質(zhì)蛋白tsp-1對tgf-β活化具有重要作用。此外，活性氧的產(chǎn)生有助于心肌梗死tgf-β的活化和酸性環(huán)境也有助于心肌梗死tgf-β的活化。心臟纖維化中tgf-β活化的特異性信號可能依賴于初始的心肌損已通過tgf-β1基因過表達的小鼠得到證明，rosenkranz等證實心肌tgf傷的類型和強度。

tgf-β的促纖維化作用表達會加重膠原沉積和抑制間質(zhì)膠原酶引起心室纖維化。通過不同實驗使用功能缺失的方法表明tgf-β參與了心室重構(gòu)的纖維化。tgf-β1+/-雜合缺失的小鼠與野生型動物相比，表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的纖維化的減輕和左室順應(yīng)性的改善。此外，tgf-β阻滯劑能夠防止心臟壓力超負荷大鼠心肌的纖維化。

心臟膠原的合成主要是通過tgf-β的信號級聯(lián)放大效應(yīng)，該信號反應(yīng)由tgf-βi型和ii型亞基組成的異聚體發(fā)起。有大量證據(jù)表明smad是tgf-β1信號通路下游的效應(yīng)蛋白，在心臟損傷后導致膠原沉積增加，tgf-β和它受體的結(jié)合促進r-smad2和/r-smad3內(nèi)在絲氨酸蘇氨酸激酶活性引起磷酸化。磷酸化的r-smads和co-smad結(jié)合，形成smad2/3-smad4復合體異位到細胞核中作為轉(zhuǎn)錄因子，驅(qū)動目的基因的表達如i型膠原蛋白?；|(zhì)基因的表達需要smad3的誘導，當smad3基因缺失時，纖維化相關(guān)基因如i型膠原蛋白和結(jié)締組織生長因子(ctgf/ccn2)的表達中斷。抑制性smads，i-smad6和i-smad7通過競爭結(jié)合tgf-βi型受體和增加受體降解，從而阻斷smad2和smad3的活化。tgf-β下游信號在心肌纖維化中的作用已被廣泛證實。

心肌纖維化的機制包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，tgf-β1)、內(nèi)皮素-1和血管緊張素ii等的激活和心肌細胞外基質(zhì)蛋白的增多(如ⅰ型膠原、ⅲ型膠原等)。smads家族蛋白是tgf-β1細胞內(nèi)的一個關(guān)鍵效應(yīng)物，tgf-β1配體與tgf-β1ⅱ型ⅰ型受體結(jié)合，促使smad2/3磷酸化，磷酸化的smad2/3與smad4結(jié)合成復合體后進入核內(nèi)調(diào)節(jié)細胞核轉(zhuǎn)錄進而促進細胞外基質(zhì)的表達，如α-sma、ⅰ型膠原、ⅲ型膠原等表達增多，smad7是tgf-β1/smad典型信號通路的抑制蛋白，smad7能夠與smad2、smad3競爭性地結(jié)合活化的tgf-β1ⅰ型受體，阻斷smad2、smad3的磷酸化，并阻礙活化的smad2、smad3與smad4復合物的形成，從而對tgf-β/smad信號產(chǎn)生抑制作用。

蓓薩羅丁(bexarotene，bex)

蓓薩羅丁(bexarotene，bex)是一種視黃醇類x受體(rxr)激動劑，作為本發(fā)明的活性成分，其分子式為c24h28o2，化學名為4-[1-(5,6,7,8-四氫-3,5,5,8,8-五甲基-2-萘基)乙烯基]苯甲酸，其結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明活性成分還可以以由藥學上或生理學可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽：氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。其他鹽包括：與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式。

術(shù)語“治療”是指基于治愈、緩解、改善、減輕、影響治療對象疾病、癥狀、疾病體質(zhì)(predisposition)的目的而給予需要治療的對象本發(fā)明的paqr3、其激動劑或拮抗劑。

術(shù)語“對象”是指鼠、人及其他哺乳動物。

術(shù)語“治療有效量”是指能夠在治療對象體內(nèi)達到治療目的本發(fā)明活性成分(包括其藥學上可接受的鹽)的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述“治療有效量”可隨本發(fā)明活性成分的給藥途徑、所用藥物輔料以及與其他藥物聯(lián)合用藥情況的不同而有所不同。

藥物組合物和施用方法

本發(fā)明的藥物組合物包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明活性成分或其類似物及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴重的副作用。通常，藥物組合物含有0.001-1000mg的活性成分/劑，較佳地0.05-300mg的活性成分/劑，更佳地，含有0.5-200mg的活性成分/劑。

本發(fā)明的活性成分及其藥理上可接受的鹽可制成各種制劑，其中包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明的活性成分或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：活性成分的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴重的副作用。活性成分的安全、有效量根據(jù)治療對象的年齡、病情、療程等具體情況來確定。

“藥理上可以接受的賦形劑或載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性?！跋嗳菪浴痹诖酥傅氖墙M合物中各組份能與本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥理上可以接受的賦形劑或載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫)、潤濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無熱原水等。

施用本發(fā)明組合物時，可以口服、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、局部給藥。

本發(fā)明組合物可以單獨給藥，或者與其他藥學上可接受的化合物聯(lián)合給藥。

含有本發(fā)明的組合物的微膠囊可用于本發(fā)明的活性成分的緩釋給藥。重組蛋白的微囊緩釋給藥技術(shù)已成功應(yīng)用于重組人生長激素(rhgh)、重組人干擾素(rhifn)、白介素-2和mnrgp120(johnsonetal.,nat.med.,2:795-799(1996)；yasuda,biomed.ther27:1221-1223(1993)；wo97/03692,wo96/40072,wo96/07399；u.s.pat.no.5654010。

本發(fā)明的活性成分的緩釋制劑可用具有良好生物兼容性和寬泛生物可降解性的乳酸羥基乙酸高聚物(plga)制備。plga的降解產(chǎn)物，乳酸和羥基乙酸可被人體很快清除。而且，該高聚物的降解能力可隨其分子量和組成的不同，從幾個月延長到幾年(lewis,“controlledreleaseofbioactiveagentsformlactide/glycolidepolymer,”in:m.chasinandr.langer(eds.),biodegradablepolymersasdrugdeliverysystems(marceldekker:newyork,1990),pp.1-41))。

使用藥物組合物時，是將安全有效量的本發(fā)明的活性成分適用于需要治療的哺乳動物(如人)，其中施用時劑量為藥學上認為的有效給藥劑量，對于60kg體重的人而言，每次給藥劑量通常為0.01～300mg，優(yōu)選0.5～100mg。當然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明有益效果：

rxrα激動劑bex能夠顯著降低心肌梗死交界區(qū)tgf-β1、p-smad3(磷酸化的smad3)，提高p-smad2(磷酸化的smad2)和smad7水平，抑制急性心肌梗死大鼠心肌ⅰ、ⅲ型膠原合成，從而改善心室重構(gòu)，并改善心功能，而且可以改善心肌梗死后心肌細胞的凋亡。因此，可以用于治療心肌梗死等疾病。

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

材料

1.1動物

12周齡雄性sd大鼠，體重(250±10g)(上海斯萊克實驗動物有限公司)；

1.2主要試劑和試劑盒

10％水合氯醛、青霉素鈉(福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥制劑室)；rxrα受體激動劑bexarotene(bex)(eisai公司)；兔抗大鼠smad2多克隆抗體、兔抗大鼠p-smad2多克隆抗體、兔抗大鼠smad3多克隆抗體、兔抗大鼠p-smad3多克隆抗體、兔抗大鼠smad7多克隆抗體(sigma公司)；兔抗大鼠β-actin單克隆抗體(santacruz公司)；免疫組化二抗試劑盒、dab顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；大鼠tgf-β1、ⅰ型膠原、ⅲ型膠原elisa試劑盒(南京建成生物工程有限公司)；小鼠抗大鼠ⅲ型膠原單克隆抗體(abcam公司)；兔抗大鼠ⅰ型膠原多克隆抗體(sigma公司)；x線膠片(日本柯達公司)；proteinmolecularweightmarker(10wer)(thermo公司)；pvdf膜(millipore公司)。

1.3主要設(shè)備及器械

1.3.1一次性注射器、固定繃帶、小動物手術(shù)臺、手術(shù)剪、手術(shù)刀片、7號帶鞘靜脈留置針、血管鉗、眼科鑷、開瞼器、棉簽、美容縫合針線；

1.3.2tkr－200小動物呼吸機(特力麻醉呼吸機設(shè)備有限公司，江西)；

1.3.3bs110s精密電子天平(sartorius公司，德國)；

1.3.44℃冰箱sc-278a(海爾公司，青島)；

1.3.5-20℃冰箱bcd-208k(海爾公司，青島)；

1.3.6-70℃超低溫冰箱dw-86l386(海爾公司，青島)；

1.3.7不銹鋼立式電熱蒸汽壓力滅菌鍋(三申醫(yī)療器械有限公司，上海)；

1.3.8dyy-iii-6b型電泳儀(北京六一儀器廠)；

1.3.9powerlab大鼠生理記錄儀(埃德公司，澳大利亞)

1.3.10脫色搖床(ts-100型)(其林貝爾儀器制造有限公司，江蘇)；

1.3.11510型ph測定儀(cyberscan公司，德國)；

1.3.12imageproplusversion4.5圖象分析系統(tǒng)；

1.3.13gevivide9超聲系統(tǒng)(ge公司日本)；

1.3.14光學顯微鏡olympuscx31；

1.3.15philipem208型透射電子顯微鏡

1.4各種緩沖液及其他溶液的配制

1.4.1l×pbs：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.38g，kh2po40.2g，溶于1l雙蒸水中，調(diào)定ph至7.2～7.3。

1.4.55×tris-甘氨酸電泳緩沖液：tris堿l5.1g，甘氨酸94g，sds5g，調(diào)整ph至8.3，加雙蒸水至1000ml，室溫保存。

1.4.810×tbs緩沖液：nacl80g，tris30g，kcl2g，加入雙蒸水充分溶解后，35％鹽酸調(diào)整ph值至7.2～7.3，雙蒸水定容至1000ml，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.91×tbst洗膜緩沖液：l0×tbs緩沖液100ml，tween-201ml，雙蒸水定容至1000ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.103％脫脂奶粉封閉液：l×tbst緩沖液20ml，脫脂奶粉0.6g。

1.4.1130％丙烯酰胺/n，n’-亞甲雙丙烯酰胺凝膠溶液：丙烯酰胺29g，n，n’-亞甲雙丙烯酰胺1g，雙蒸水定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.121％麗春紅溶液：冰乙酸5ml，麗春紅粉末1g，雙蒸水定容至100ml，完全溶解后濾紙過濾室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1310％過硫酸銨溶液：過硫酸銨1g，去離子水完全溶解后定容至10ml，棕色瓶4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.146×dna瓊脂糖凝膠電泳上樣緩沖液：0.25％溴酚蘭，30％甘油水溶液。

1.4.1550×tae：2.0mtris，1.0mnaac，50mmedta，ph8.0。

1.4.165×tbe：tris54.45g，硼酸27.9g，edta3.72g，用1000ml雙蒸水完全溶解后調(diào)ph值至8.3，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.17ripa組織裂解緩沖液：50mmtris-hcl(ph6.8)，150mmnacl，1％tritonx-100，l％sodiumdeoxycholate，1mmedta，0.1％sds，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.18組織蛋白裂解液：h2o800μl，5×dtt200μl，100×pmsf10μl，蛋白酶抑制劑10μl。

1.4.1910％分離膠10ml：h2o4ml，30％丙烯酰胺溶液3.3ml，1.5mol/ltris(ph8.8)2.5ml，10％sds0.1ml，10％過硫酸銨0.1ml，temed0.004ml。

1.4.205％移層膠5ml：h2o3.4ml，30％丙烯酰胺溶液0.83ml，1.0mol/ltris(ph6.8)0.63ml，10％sds0.05ml，10％過硫酸銨0.05ml，temed0.005ml。

方法

2.1實驗動物及分組：

12周齡雄性sd大鼠40只，體重(220±10g)，購自上海斯萊克公司。飼養(yǎng)條件：4－5只/籠，恒濕55±5％，恒溫22±2℃，人工光照明暗各12小時/天，24小時自由飲水和取食，飼料由上海斯萊克公司提供。40只sd隨機分為5組：1)a組，對照組(control，n＝8)；2)b組，假手術(shù)組(sham，n＝8)；3)c組，心梗組(mi，n＝8)；4)d組，心梗10mg/kg/dbex給藥組(mi+bex10，n＝8)；5)e組，心梗30mg/kg/dbex給藥組(mi+bex30，n＝8)。經(jīng)受手術(shù)后的存活急性心梗大鼠被隨機分成c組、d組和e組。d組、e組中將bexarotene溶于生理鹽水，采用灌胃法給藥，a組、b組及c組則用等量生理鹽水灌胃，三組均每日一次，持續(xù)4周。本次動物試驗經(jīng)由福建醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會許可。

2.2急性心梗大鼠模型的建立：

1)參照文獻olivetti法建立心梗模型，10％水合氯醛0.2-0.3ml/100g劑量腹腔注射麻醉；

2)3-5min大鼠麻醉完成后，仰臥于小動物操作臺，固定其頭部及四肢，雙上肢及右下肢連接多道生理記錄儀，記錄術(shù)前心電圖；

3)剃除心前區(qū)及頸部鼠毛，碘伏擦拭頸部并正中切開分離露出氣管，將7號靜脈留置針于甲狀軟骨下插入氣管2-3cm，退出針芯，用細棉球絲放置于針管前檢查氣管通氣是否順暢，固定留置針，連接呼吸機，參數(shù)設(shè)定為呼吸頻率60次/min，通氣量20-25ml/min；

4)經(jīng)左側(cè)第4肋間剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，打開胸腔，剪開心包膜，擠壓出心臟；

5)在左心耳與肺動脈圓錐之間接近主動脈根部2mm處用7-0號無創(chuàng)縫線結(jié)扎大鼠左冠脈前降支，結(jié)扎后觀察大鼠左室前壁結(jié)扎線以下部位變蒼白，心跳變慢，連接大鼠心電圖儀，心電圖顯示st段弓背上抬提示手術(shù)成功；

6)迅速將心臟放回胸腔，排除胸腔氣體后逐層縫合關(guān)閉胸腔，縫合胸部及頸部肌肉和皮膚，待大鼠自主呼吸恢復后拔除氣管插管。

假手術(shù)組只在冠狀動脈前降支相同部位穿線但不結(jié)扎，其他操作同造模組。術(shù)后給予青霉素8萬u后肢肌肉注射，放回籠中繼續(xù)喂養(yǎng)。給4周后進行心功能及其它相關(guān)指標的檢測。

2.3彩色多普勒心臟超聲儀測大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能

1)采用10％水合氯醛對大鼠進行腹腔注射麻醉，將麻醉好的大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺上；

2)剔除大鼠前胸區(qū)鼠毛；

3)采用gevivide9多普勒心臟彩色超聲儀，12s探頭(頻率4-12mhz，配備有echopac113.1.3工作站)于胸骨旁左心室長軸觀采集m型超聲圖像，于二尖瓣腱索水平采集血流脈沖多普勒圖像，于二尖瓣前葉瓣環(huán)處記錄組織多普勒圖像，同步記錄心率；

4)測量及計算左心室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(lveds)、室間隔舒張末期厚度(ivsd)、室間隔收縮末期厚度(ivss)、左室后壁舒張末期厚度(lvpwd)、左室后壁收縮末期厚度(lvpws)、組織多普勒顯像(tdi)檢測二尖瓣血流舒張早期與瓣環(huán)運動峰值速度比值(e/e')、左室短軸縮短率(fs)、按改良simpson法計算lvef；

5)以上數(shù)據(jù)均測量5個心動周期，取平均值。

2.4大鼠血清標本制備

1)大鼠麻醉完成后抽取3-5ml大鼠心室血液置于肝素鈉抗凝管中；

2)3500rpm離心5min，吸取上清；

3)移入另一ep管，-80℃冰箱備用。

2.5大鼠體質(zhì)量、心臟大體形態(tài)、心臟質(zhì)量、左室質(zhì)量及左室質(zhì)量指數(shù)測定

1)所有大鼠在試驗前(禁食，可飲水)；

2)處死前稱動物體重(bw)，腹腔注射10％水合氯醛(0.2ml-0.3ml/100g；)

3)麻醉后3-5min用剪刀快速剪開胸腔，取出心臟，放置于培養(yǎng)皿用生理鹽水沖洗2-3次；

4)吸干心臟表面水分，拍攝心臟大體形態(tài)照片，剪去血管及心臟表面組織，稱取心臟質(zhì)量，計算心臟質(zhì)量指數(shù)(hwi)；

5)眼科剪沿雙側(cè)心耳上緣去除心臟肺動靜脈、上下腔靜脈及周圍脂肪組織，濾紙吸干水分后稱重；

6)沿二尖瓣平面分離心房與心室，再沿室間隔剪除右心室，保留左心室及室間隔，稱重，即左室質(zhì)量(lvw)；

7)根據(jù)lvw/bw計算值為左室質(zhì)量指數(shù)。

2.6心肌組織勻漿

1)取大鼠左室前壁心肌組織50mg加冷生理鹽水1ml(每ml生理鹽水中含蛋白酶抑制劑10ul)，勻漿器充分勻漿；

2)將勻漿液放置-80℃冰箱反復凍融2次；

3)超聲儀震蕩10min，3500rpm離心10min，移上清液于另一ep管，-80℃冰箱備用。

2.7心肌組織he染色

1)取下大鼠心臟以pbs沖洗2-3次，切去約0.5cm心尖及心房組織，投入預先配好的10％福爾馬林固定48h；

2)從福爾馬林液中取出心臟組織，自來水沖洗30min；

3)70％-100％酒精梯度脫水各30min，二甲苯中透明30min；

4)將已透明心肌組織置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫，待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋；

5)將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成4-6um薄片，切下的薄片放到加熱40-50℃熱水中燙平，再貼到載玻片上，放60℃烤箱30min；

6)從烤箱中取出載玻片放入二甲苯15min，二甲苯25min，100％-75％酒精梯度水化，每步3-5min，放入自來水水洗10min；

7)水中取出載玻片，滴加即用型的蘇木素1-2min；

8)酸水及氨水中分色，各數(shù)秒鐘；

9)流水沖洗1-2min放入蒸餾水片刻；

10)75％和95％酒精中脫水各5min；

11)入酒精伊紅染色液染色2-3min；

12)染色后的切片經(jīng)95％酒精30s，晾干；

13)切片滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，晾干，貼上標簽。

2.8心肌組織天狼星紅染色

1)取材和固定同he染色步驟1-61)水中取出載玻片，滴加0.1％苦味酸天狼星紅染色1-2min；

2)流水沖洗后入蒸餾水片刻；

3)75％和95％酒精中脫水各5min，晾干；

4)切片滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，晾干，貼上標簽。

2.9心肌組織免疫組化染色

1)用于collagenⅰ和collagenⅲ的檢測，石蠟切片脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，pbs)沖洗；

2)3％過氧化氫避光孵育15min，pbs沖洗；

3)將切片浸入0.01mol/l檸檬酸鹽緩沖液(ph6.0)，微波修復中高火5min，中低火10min，待修復液自然冷卻至室溫；

4)pbs沖洗；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體；

5)滴加一抗(一抗?jié)舛确謩e為collagenⅰ1:100，collagenⅲ1:50)，于濕盒中4℃孵育16h；

6)室溫復溫30min，pbs沖洗；dab顯色，在鏡下控制顯色時間，終止顯色，流水沖洗10min；

7)蘇木素染色5min，流水沖洗10min；

8)1％鹽酸酒精分化4s，流水沖洗10min，脫水、透明，封片；

9)用光學顯微鏡olympuscx31采集×200倍圖像。

2.10western-blotting檢測心肌組織smad2、p-smad2、smad3、p-smad3、及smad7的蛋白表達

2.10.1大鼠心肌組織蛋白提取

1)取大鼠左室前壁心肌組織50mg加入1mlripa組織裂解液，勻漿器冰上勻漿2-3min；

2)將勻漿液移至ep管中，放置-80℃冰箱反復凍融2-3次；

3)按體積1:1加入2×sds，用力振蕩15s后超聲儀震蕩10min，沸水放置10min，12000g離心10min，取上清液移入另一ep管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.10.2考馬斯亮藍法心肌組織蛋白濃度測定

1)繪制蛋白分析標準曲線，配制1g/ml牛血清白蛋白(bsa)溶液；

2)取96孔板，加200μl/wellg250考馬斯亮藍染液，以濃度0、2、4、6、8、10mg/ml加入bsa，并取復孔，放置15min；

3)酶標儀595nm波長檢測吸光度，做出標準回歸曲線和曲線公式；

4)另取96孔板，加200μl/wellg250考馬斯亮蘭染液及1μl蛋白樣品，空白對照組加細胞裂解緩沖液1μl，混勻后室溫靜置15min；

5)酶標儀595nm波長檢測樣品的od值，減去空白對照后，根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度。

2.10.3蛋白電泳

2.10.3.1灌膠

1)清洗玻璃板，雙蒸水沖洗1次，95％酒精擦洗，烘干，安裝夾板；

2)10％sds-page分離膠10ml，加入temed后迅速混勻；

3)用移液器將10％分離膠注入雙層玻璃板，膠液面距塑料梳子下緣線約lcm，隨后均勻加入95％酒精約0.5ml，室溫下靜置約30min，棄去上層未凝聚液體，用雙蒸水沖洗分離膠的上膠面3次，用濾紙吸去殘液；

4)5％sds-page積層膠5ml(ddh2o3.4ml，30％丙烯酰胺0.83ml，1.0mph6.8tris0.63ml，10％sds50ul，10％過硫酸銨50ul，temed8ul)，加入temed后立即混勻，將積層膠直接灌注到聚合好的分離膠上，立即插入teflon梳子(臨用前用水洗凈，乙醇干燥)，注意不要混入氣泡；

5)室溫下靜置30min，待積層膠凝固后捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕拔出，用雙蒸水沖洗加樣槽，以去除殘留的丙烯酰胺，必要時用加樣器修正積層膠的加樣孔。

2.10.3.2蛋白上樣

1)將待測的蛋白樣品從-80℃的冰箱中取出，置于100℃水浴3-5min；

2)移液器吸取15ul樣品按預定順序加入上樣槽。

2.10.3.3電泳

1)將加樣后的sds-page凝膠放入電泳槽中(矮玻璃板面向內(nèi)，高玻璃板面向外)；

2)電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，電泳液需漫過內(nèi)側(cè)玻璃板，電泳下槽加入電泳緩沖液沒過下槽電極；

3)接通電源，正極接下槽，調(diào)80-100v電壓電泳至溴酚蘭前沿進入分離膠界面，電壓加至120v，待溴酚蘭條帶電泳至分離膠底部，關(guān)閉電源。

2.10.4轉(zhuǎn)膜

1)取5×2cmwhatman濾紙4張，切同樣大小pvdf膜，pvdf膜在甲醇中浸泡1-2min，雙蒸水漂洗后與濾紙一起浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中；

2)輕柔地撬開玻璃板，刮去積層膠，注意避免損傷分離膠，根據(jù)蛋白marker識別目標蛋白分子量大小，切割分離膠與pvdf膜同大，浸入轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)液5min；

3)至下而上依陽極碳板、濾紙、凝膠、pvdf膜、濾紙、陰極碳板的順序?qū)R放置，每疊放一層均要用玻璃棒去除氣泡；

4)加入約3-5ml轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)液，蓋上電板，接通電源，電流為2ma/cm2，電轉(zhuǎn)膜電轉(zhuǎn)1.5h；

5)取出pvdf膜，雙蒸水漂洗2次，浸入0.1％麗春紅染液預染，判斷電轉(zhuǎn)后的蛋白條帶分布，根據(jù)蛋白marker剪取目標蛋白所在的膜，大小約1-2cm寬。

2.10.5封閉

將修剪后的pvdf膜移至3％脫脂奶粉封閉液中，室溫下?lián)u床孵育1h。

2.10.6一抗、二抗孵育

1)一抗：3％脫脂奶粉為1:1000，與pvdf膜一同放入密閉膠袋內(nèi)，pvdf膜完全浸沒于一抗稀釋液(3％脫脂奶粉)中；

2)4℃孵育12h；

3)取出pvdf膜，室溫下1×tbst漂洗3次，每次5min；

4)二抗：3％脫脂奶粉為1:5000，與pvdf膜一同放入密閉膠袋內(nèi)，膜完全浸沒于二抗稀釋液(3％脫脂奶粉)中；

5)37℃孵育1-1.5h；

6)取出pvdf膜，室溫下1×tbst漂洗3次，每次5min。

2.10.7蛋白檢測

1)將pvdf膜平放在保鮮膜上，ecl試劑盒中a、b顯色劑在ep管中等體積混合，均勻滴在pvdf膜上(蛋白面)，室溫孵育1min；

2)棄去pvdf膜上多余的ecl工作液，以保鮮膜包裹pvdf膜；

3)將膜蛋白面朝向曝光盒內(nèi)放置的膠片，曝光1-2min；

4)暗室內(nèi)取出膠片，浸入顯影液中2-3min；

5)從顯影液中取出膠片，清水漂洗后浸入定影液約5min；

6)從定影液中取出膠片，清水洗滌3-5min，晾干；

7)膠片條帶的掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標蛋白與β-actin的光密度比值，表示目標蛋白的表達水平。

2.11心肌組織elisa檢測

1)測心肌組織中tgf-β1、collagenl和collagenⅲ含量，血清中bnp含量，根據(jù)elisa試劑盒說明進行操作，450nm波長測量od值；

2)根據(jù)標準濃度和od值算出標準曲線的回歸方程，并計算被測樣品濃度。

2.12石蠟切片tunel檢測

1)石蠟切片用二甲苯浸洗2次，每次5min；用梯度乙醇(100、95、90、80、70％)各浸洗1次，每次3min；

2)pbs漂洗2次×5min；用proteinasek工作液處理組織15-30min在21-37℃(溫度、時間、濃度均需摸索)；

3)pbs漂洗2次×5min；

4)用濾紙吸去玻璃片上組織周圍多余的液體，滴加50μl的tunnel反應(yīng)混合液，置于濕盒中37℃反應(yīng)1小時；

5)pbs漂洗3次×5min；

6)滴加pod，置濕盒內(nèi)37℃×30min；pbs漂洗3次×5min；

7)滴加dab溶液顯色，顯微鏡下觀察；

8)蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。棕黃色或棕褐色細胞核為凋亡細胞，藍紫色為非凋亡細胞，陰性對照片無棕黃色著色；

9)光鏡下觀察并攝片，在梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)分別隨機選擇5個視野，以細胞核周圍有肌纖維確認為心肌細胞，以tunel染色的凋亡細胞為陽性細胞，用image-pro-plus6.0軟件分別計數(shù)每個視野細胞凋亡占總數(shù)的百分數(shù)作為細胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex，ai)。

2.13透射電鏡

1)取材：(按需要及要求取標本)；

2)前固定：3％戊二醛-1.5％多聚甲醛-0.1mpbs(ph7.2)4℃數(shù)天(2h以上)；

3)漂洗:0.1mpbs(ph7.2)3次；

4)后固定：1％鋨酸-1.5％亞鐵氰化鉀4℃1.5h；

5)漂洗:0.1mpbs(ph7.2)3次；

6)脫水：50％酒精10min→70％酒精飽和醋酸鈾染液4℃過夜→90％酒精10min→90％酒精-丙酮10min→90％丙酮10min→無水丙酮10minx3次；

7)浸透：(1)無水丙酮+環(huán)氧樹脂618包埋劑(1:1)1.5h，

(2)純618包埋劑35℃3h；

8)包埋、聚合：35℃12h，45℃12h，60℃3d。

9)修快，半薄切片，定位

10)切片、染色：leicauc-6型超薄切片機切100nm的超薄切片；經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5－15min，并蒸餾水水洗。

11)在philipsem208型透射電鏡下觀察并攝片。

實施例1.心肌梗死大鼠建模及存活情況

冠狀動脈前降支縫扎術(shù)中，可見縫扎部位以下心肌局部運動減弱，顏色蒼白，與術(shù)前相比，心電圖示st段明顯抬高(圖1)。手術(shù)大鼠45只，術(shù)后假手術(shù)組8只大鼠全部存活，存活率100％；手術(shù)組大鼠存活26只，存活率70％。死于麻醉過量1只，死于心臟大出血2只，死于氣胸3只，死于心室顫動和心跳驟停5只。各組大鼠保證實驗結(jié)束后存活8只供取材。假手術(shù)組大鼠，生長狀態(tài)良好，毛發(fā)密實光亮順滑，活動量大，動作敏捷。心肌梗死術(shù)后大鼠毛發(fā)較稀疏并且雜亂暗淡，活動量較少，呼吸急促，動作較緩慢。

實施例2.蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠tnf-α、il-10、心肌酶、血脂、腎臟功能及肝臟功能的影響

sham組、mi組、mi+bex10組及mi+bex30組的tnf-α、bun水平無顯著差異，mi組、mi+bex10組及mi+bex30組的tg、vldl-c水平無顯著差異，mi+bex10組、mi+bex30組及sham組的hdl-c水平無顯著差異，sham組、mi組的nefa的水平無顯著差異。

mi組的tg、vldl-c水平較sham組顯著降低(p<0.05)；mi+bex10組和mi+bex30組的il-10、vldl-c、tg、nefa的表達水平較sham組顯著下降(p<0.05)；mi+bex10組、mi+bex30組的nefa水平較mi組明顯降低(p<0.05)。

mi組scr的水平較sham組顯著升高(p<0.05)；mi+bex10組和mi+bex30組的tcho、hdl-c、ldh、ldl-c水平較mi組顯著升高(p<0.05)；mi+bex30組ck-mb水平較sham組、mi組及mi+bex10組組顯著升高(p<0.05)；mi+bex10組和mi+bex30組的ldh、ldl-c、alt、scr水平與sham組比較顯著升高(p<0.05)；mi+bex30組scr的水平較mi組顯著升高(p<0.05)；mi+bex10組alt的水平較mi組顯著升高(p<0.05)。(見表1)

表1bexarotene治療4周后對心梗sd大鼠tnf-α、il-10、心肌酶、血脂及肝腎功能的影響

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例3.心肌梗死后大鼠心臟大體形態(tài)觀察

sham組：心臟表面光滑，幾何形態(tài)規(guī)整，外形呈倒圓錐形；心臟大體形態(tài)、心腔體積正常，心室厚度均勻一致，彈性及韌性良好；穿線處心外膜下為炎性增生，可見輕微蒼白，余心臟表面顏色呈嫩紅色。

mi組：心臟表面不光滑，梗死區(qū)心肌纖維化形成瘢痕組織，外形呈普大型心，失去原有的幾何形態(tài)；心臟體積及左室腔明顯擴大，梗死區(qū)心肌變薄向外膨隆，彈性和初性消失；梗死區(qū)心肌呈蒼白色，與非梗死區(qū)形成明顯差異，非梗死區(qū)室壁明顯增厚；多數(shù)小鼠梗死區(qū)心肌已形成室壁瘤，在體時膨出呈球狀，離體后皺縮凹陷入心室腔內(nèi)。

mi+bex10和mi+bex30治療組：心臟形態(tài)增大，色偏暗紅，心室壁厚度增加，梗死區(qū)彈性和鋪性減弱，表面欠光滑。與mi組比較，梗死區(qū)范圍縮小，可見蒼白色；心臟基本能維持正常幾何形狀，體積縮??；梗死區(qū)仍殘存心肌組織，彈性及初性較好；心室腔擴張程度減輕。

實施例4.蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠體重、全心質(zhì)量指數(shù)及左室質(zhì)量指數(shù)

心梗后4周模型組，與sham組相比較體重減輕(p<0.05)，而全心質(zhì)量指數(shù)、左心質(zhì)量指數(shù)均增大(p<0.05)。mi+bex10和mi+bex304周bex治療組與mi組相比較，體重、全心質(zhì)量指數(shù)和左心質(zhì)量指數(shù)情況均有所改善，且mi+bex30治療組上述情況優(yōu)于mi+bex10治療組。(見表2)

表2蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠體重、全心質(zhì)量、左室質(zhì)量、全心質(zhì)量指數(shù)及左室質(zhì)量指數(shù)的影響

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例5.蓓薩羅丁干預對心梗大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

與sham組相比，mi組左心室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(lveds)、左室后壁舒張末期厚度(lvpwd)、左室后壁收縮末期厚度(lvpws)及組織多普勒顯像(tdi)檢測二尖瓣血流舒張早期與瓣環(huán)運動峰值速度比值(e/e')顯著增大(p<0.05)，左室短軸縮短率(fs)、左室射血分數(shù)(lvef)顯著降低(p<0.05)，而室間隔舒張末期厚度(ivsd)、室間隔收縮末期厚度(ivss)差異無統(tǒng)計學意義；mi+bex10和mi+bex30治療組左心室舒張末期內(nèi)徑(lvedd)、左室后壁舒張末期厚度(lvpwd)、左室后壁收縮末期厚度(lvpws)、組織多普勒顯像(tdi)檢測二尖瓣血流舒張早期與瓣環(huán)運動峰值速度比值(e/e')及左室射血分數(shù)(lvef)均有所改善(p<0.05)。(見表3、圖3)

與control組、sham組相比，mi組elisa法測血漿bnp水平顯著升高(bnpcontrol291.59±17.08pg/mlvssham304.30±11.96pg/mlvsmi471.90±97.19pg/ml，p<0.05)；與mi組相比，mi+bex10組及mi+bex30組血漿bnp水平顯著降低(bnpmi471.90±97.19pg/mlvsmi+bex10354.81±68.88pg/mlvsmi+bex30309.51±87.68pg/ml,p＜0.05)；mi+bex10組與mi+bex30組血漿bnp水平無顯著差異。(見表3)

表3蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的影響

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例6.心肌梗死后大鼠心肌組織he染色結(jié)果

與control組和sham組相比，mi組梗死區(qū)室壁變薄，心肌細胞排列紊亂數(shù)量減少，炎性細胞浸潤，細胞外間質(zhì)可見大量增生組織；與mi組相比，左室前壁細胞數(shù)量較多，mi+bex10和mi+bex30治療組心肌結(jié)構(gòu)較為完整，心肌細胞的排列相對整齊，心肌細胞外間隙增生組織較少；與mi+bex10組相比，mi+bex30治療組心肌結(jié)構(gòu)更為完整，排列較為整齊，心肌細胞外間質(zhì)增生較少。(見圖4)。

實施例7.蓓薩羅丁對大鼠心肌梗死后纖維化面積的影響

天狼星紅苦味酸染色結(jié)果顯示：control組和sham組心肌組織中可見少量紅染絲狀纖維；mi組：心肌梗死區(qū)及梗死邊緣區(qū)紅染纖維明顯增多呈片狀彌漫性分布，室壁變?。籱i+bex10和mi+bex30治療組：心肌梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)可見膠原呈細束狀浸潤性分布(見圖4)。心肌膠原分析結(jié)果顯示：與control組和sham組比較，mi組心肌膠原水平明顯增多(p<0.05)；與mi組相比，mi+bex10和mi+bex30治療組膠原水平均有所降低(p<0.05)，且mi+bex30治療組較mi+bex10治療組纖維化面積數(shù)值更低(p<0.05)(見表4)。

表4各實驗組大鼠心肌纖維化面積比較

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例8.elisa法和免疫組化法分別檢測心肌梗死區(qū)i型膠原、ⅲ型膠原的蛋白表達

與control組和sham組比較，mi組、mi+bex10和mi+bex30治療組梗死邊緣區(qū)ⅰ型、ⅲ型膠原蛋白表達顯著增加(p<0.05)；與mi組比較，mi+bex10和mi+bex30治療組ⅰ型、ⅲ型膠原蛋白表達明顯減少，且mi+bex30治療組ⅰ型、ⅲ型膠原蛋白表達量顯著低于mi+bex10治療組(p<0.05)(見表5、表6，圖6)。

表5elisa法測各組大鼠心肌組織collagenⅰ、collagenⅲ水平

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

表6心肌組織膠原蛋白的表達以及ⅰ/ⅲ膠原的比值結(jié)果

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例9.蓓薩羅丁對心梗大鼠心梗邊緣區(qū)心肌組織tgf-β1、p-smad2、smad2、p-smad3、smad3及smad7水平的影響

與control組和sham組相比，mi組左室前壁梗死邊緣區(qū)心肌組織tgf-β1、p-smad2、p-smad3及smad7顯著增加(p<0.05)；與mi組相比，mi+bex10組和mi+bex30組tgf-β1、p-smad3顯著降低(p<0.05)，而p-smad2、smad7水平顯著增加(p<0.05)，且mi+bex30組tgf-β1、p-smad3低于mi+bex10組(p<0.05)，而p-smad2、smad7水平高于mi+bex10組(p<0.05)；各組間smad2、smad3水平無顯著差異。(見表7，圖7a、b、c、d)

表7elisa法測各組大鼠心肌梗死邊緣區(qū)tgf-β1水平

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝8)。^＄p<0.05，vssham組；⁺p<0.05，vsmi組；^#p<0.05，vsmi+bex10組。

實施例10.蓓薩羅丁干預心梗大鼠后對心肌細胞凋亡的影響

與control組和sham組相比，mi組梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心肌凋亡指數(shù)顯著增加(p＜0.05)；與mi組相比較，mi+bex10、mi+bex30組梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心肌凋亡指數(shù)顯著降低(p＜0.05)；與mi+bex10組相比，在梗死邊緣區(qū)mi+bex30凋亡指數(shù)顯著降低(p＜0.05)；在梗死區(qū)和非梗死區(qū)mi+bex10、mi+bex30組凋亡指數(shù)無明顯差異。(見表8，圖8)

表8蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠心肌梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)及非梗死區(qū)心肌細胞凋亡指數(shù)的影響

注：數(shù)值表示為均數(shù)±標準差(n＝5)。與sham組比較，^＄p<0.05；與mi組比較，⁺p<0.05；；與mi+bex10組比較，^#p<0.05。

實施例11.蓓薩羅丁治療4周后對心梗sd大鼠心肌梗死邊緣區(qū)組織超微結(jié)構(gòu)的影響

與control組和sham組相比，mi組心肌纖維排列稀疏、紊亂，部分心肌細胞質(zhì)膜不完整線粒體漏出且呈腫脹狀態(tài)，可見自噬溶酶體增多；伴有肌細胞灶性壞死及萎縮，間質(zhì)可見大量膠原纖維增生；與mi組相比較，mi+bex10組和mi+bex30組，大部分肌纖維排列緊密，心肌細胞質(zhì)膜相對完整，未見線粒體漏出，可見少量自噬溶酶體，間質(zhì)內(nèi)膠原增生不明顯；mi+bex10和mi+bex30組兩者相互比較，mi+bex30組肌纖維排列更為緊密，心肌細胞質(zhì)膜更為完整，且間質(zhì)內(nèi)膠原增生更少。(見圖9)

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