本發(fā)明涉及納米材料技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于運(yùn)載膀胱癌癥治療藥物的磁性靶向中空普魯士納米顆粒載體(hpbmnps)的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：癌癥是各種惡性腫瘤的總稱，是威脅人類健康的一項(xiàng)重大疾病。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)，放療和化療。傳統(tǒng)手術(shù)用于切除早期的良性和未擴(kuò)散的腫瘤，但缺點(diǎn)是未必能將腫瘤完全切除可能造成復(fù)發(fā)。放療是采用高能射線殺死腫瘤來(lái)達(dá)到治療腫瘤的目的，治療早期還可以殺死大量腫瘤細(xì)胞，少數(shù)變異的腫瘤細(xì)胞繼續(xù)存活并發(fā)生增殖，最終導(dǎo)致放療失敗。化療是用化學(xué)藥物殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。但是長(zhǎng)期化療，會(huì)使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，從而不能達(dá)到理想的效果。雖然放療和化療在一定程度上殺死了腫瘤細(xì)胞，但是也對(duì)人體的正常細(xì)胞產(chǎn)生傷害，使人體產(chǎn)生副作用。傳統(tǒng)治療癌癥的藥物，人體免疫系統(tǒng)中的吞噬細(xì)胞往往會(huì)將它們吞噬掉，使藥物不能產(chǎn)生藥效。而且傳統(tǒng)的分子尺寸比較大，并不能到達(dá)細(xì)胞內(nèi)部。而納米級(jí)粒子因?yàn)槌叽巛^小、穿透性強(qiáng)、靶向性高、吸附性好的優(yōu)點(diǎn)，可以通過(guò)靜脈注射注入到人體體內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。隨著納米生物技術(shù)發(fā)展為國(guó)際前沿和熱點(diǎn)問(wèn)題，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，特別是納米藥物載體和成像技術(shù)。如藥物輸運(yùn)系統(tǒng)(dds)的出現(xiàn)為藥物的靶向輸運(yùn)和可控釋放提供了新途徑，對(duì)腫瘤的高效治療和減少毒副作用有重要的作用。近年來(lái)，已經(jīng)有無(wú)機(jī)納米粒子廣泛合成和用作藥物載體，到目前為止，已經(jīng)成功地生成了具有sio2,tio2和zro2組成的生物相容的中空納米顆粒。除了提供藥物的能力外，無(wú)機(jī)骨架的功能特征也在診斷和成像應(yīng)用中顯示出潛力。因此，開(kāi)發(fā)新的中空殼層無(wú)機(jī)納米粒子作為潛在的藥物納米載體在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有重要的意義。普魯士藍(lán)(pb)是一種歷史悠久的藍(lán)色染料，其制備簡(jiǎn)單且價(jià)格便宜。美國(guó)食品與藥物管理局(fda)于2003年批準(zhǔn)將其作為治療銫和鉈輻射中毒的臨床用藥，它在人體內(nèi)的生物安全性和代謝途徑非?？煽俊Ｒ虼?，納米型pb的高安全性使我們將其用作癌癥化療的細(xì)胞內(nèi)藥物載體。納米磁性粒子在外磁場(chǎng)下可以進(jìn)行定向移動(dòng)，從而可以到達(dá)預(yù)期的目的地，而殼層中空可以作為藥物的儲(chǔ)存空間和釋放空間。聚乙烯吡咯烷酮(pvp)是以n-乙烯基-2-吡咯烷酮為單體，通過(guò)聚合反應(yīng)，形成的一種高分子聚合物，其具有很好的調(diào)控納米粒徑和可控侵蝕作用。經(jīng)查閱專利和文獻(xiàn)得出，現(xiàn)階段所研究的納米pb型載體粒子的靶向性太低，且載體載藥數(shù)量不一。因此，能研究出一種靶向性強(qiáng)、低毒性且運(yùn)載數(shù)量均等的運(yùn)送癌癥治療藥物的納米pb型載體顆粒，將有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服普魯士藍(lán)納米顆粒在應(yīng)用于運(yùn)送藥物的過(guò)程中沒(méi)有高特異性靶向性的缺點(diǎn)，提供一種用于運(yùn)載膀胱癌癥治療藥物的靶向納米顆粒載體及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)體外磁場(chǎng)，以實(shí)現(xiàn)載體裝載的體內(nèi)藥物的磁性靶向分布。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于運(yùn)載膀胱癌癥治療藥物的靶向納米顆粒載體，所述納米顆粒載體以磁性四氧化三鐵為核，其表面包裹有普魯士藍(lán)納米殼，且其殼層有大小均等的中空孔隙。具體的，所述納米顆粒載體為立方體結(jié)構(gòu)，表面殼層含有中空孔隙，所述納米顆粒載體的粒徑為110nm，其殼層空腔的直徑為90nm；其表面殼層的中空孔隙的直徑小于2nm。研究表明，粒徑介于20～150nm之間的納米顆粒能夠有效地避免被機(jī)體清楚機(jī)制所清除而更有效地到達(dá)靶組織，因此，制備的載體顆粒具有合適的尺寸，在進(jìn)入機(jī)體內(nèi)代謝過(guò)程中，更易在目標(biāo)組織區(qū)域進(jìn)行輸送和吸收。優(yōu)選的，納米顆粒載體表面殼層的中空孔隙通過(guò)聚乙烯吡咯烷酮(pvp)可控侵蝕納米粒子表面層形成，因?yàn)槠淇煽刂魄治g的孔徑大小和粒徑大小，使藥物可以均勻的裝載與顆粒物上。一種用于運(yùn)載膀胱癌癥治療藥物的靶向納米顆粒載體的制備方法，包括以下步驟：(1)配制fecl3·6h2o與h2o2的混合水溶液，記為溶液a；(2)配制k3fe(cn)6與h2o2的混合水溶液，記為溶液b；(3)配制fecl2·4h2o、fecl3·6h2o和hcl的混合鐵鹽溶液，氮?dú)獬?，在n2條件下，將上述混合鐵鹽溶液逐滴加入到無(wú)氧氨水溶液中，室溫劇烈攪拌；反應(yīng)結(jié)束后，磁鐵分離，用超純水洗至中性，密封保存得到fe3o4mnps儲(chǔ)備溶液，記為溶液c；(4)在常溫?cái)嚢锠顟B(tài)下，將溶液a緩慢滴加到溶液b中，再加入溶液c，攪拌3h，得到含有磁性普魯士藍(lán)納米粒子的溶液，取出膠體溶液，進(jìn)行磁性分離和清洗，將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干，得到粉末狀磁性普魯士藍(lán)納米粒子；(5)在磁力攪拌下，將聚乙烯吡咯烷酮水溶液加入到含有磁性普魯士藍(lán)納米粒子溶液的聚四氟乙烯容器中，放置3h后，將聚四氟乙烯容器在140℃電爐中的不銹鋼高壓釜中放置4小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行離心分離，離心后，將沉淀物在蒸餾水中洗滌數(shù)次，冷凍干燥后得到所述納米顆粒載體。所述溶液a中，fecl3·6h2o的濃度為0.04m；每ml溶液a中，含有質(zhì)量濃度30％的h2o20.5μl；所述溶液b中，k3fe(cn)6的濃度為0.04m；每ml溶液a中，含有質(zhì)量濃度30％的h2o20.5μl；所述步驟(3)的混合鐵鹽溶液中，fecl2·4h2o的濃度為2m，fecl3·6h2o的濃度為1m，hcl的濃度為2m；無(wú)氧氨水溶液的濃度為0.7m。所述步驟(4)中，溶液a、溶液b、溶液c的體積比為2:2:1。所述步驟(5)中，聚乙烯吡咯烷酮水溶液的濃度為5mg/ml，磁性普魯士藍(lán)納米粒子溶液的濃度為1mg/ml。本發(fā)明的用于運(yùn)載膀胱癌癥治療藥物的靶向納米顆粒載體在膀胱癌癥治療藥物磁性靶向運(yùn)載方面的應(yīng)用。所述納米顆粒載體的殼層的中空孔隙中裝載抗腫瘤藥物-順鉑粒子。有益效果：本發(fā)明的納米顆粒載體(hpbmnps)在運(yùn)送藥物對(duì)膀胱癌t24細(xì)胞具有良好的靶向識(shí)別功能，有效的進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；準(zhǔn)確的殺死癌癥細(xì)胞，同時(shí)具有無(wú)毒副作用，具有成為新一代高靶向運(yùn)載抗癌藥物對(duì)癌癥細(xì)胞高準(zhǔn)確殺傷的潛力。本發(fā)明的和納米顆粒載體以前的藥物載體相比具有高度的生物相容性，并且該納米粒子裝載藥物后不僅可以被動(dòng)的被細(xì)胞吞噬，還可以設(shè)置體外磁場(chǎng)，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)藥物的磁性靶向分布，進(jìn)而更精確的釋放藥物對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷，且用藥量大大減少，進(jìn)而極大地降低了毒副作用。該類型納米粒子在將來(lái)藥物納米載體發(fā)展中具有極大的潛力。附圖說(shuō)明圖1表示固態(tài)的pbmnps和hpbmnps的sem和tem圖，其中a為pbmnps的sem；b和c分別為hpbmnps的sem圖和tem圖；圖2表示fe3o4mnps和hpbmnps的紅外光譜圖；圖3表示cis@hpbmnps的吸附動(dòng)力學(xué)(a)和釋放的狀況(b)；圖4表示hpbmnps和cis@hpbmnps的mtt測(cè)試的對(duì)比狀況；圖5表示膀胱癌t24細(xì)胞的共焦熒光圖像，其中(a)為未添加物質(zhì)，(b)為加入hpbmnps，(c)為加入cis@hpbmnps。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做更進(jìn)一步的解釋。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1配制含有2mfecl24h2o、1mfecl36h2o和2mhcl的混合鐵鹽溶液，氮?dú)獬?0min。在n2條件下，將混合鐵鹽溶液逐滴加入到250ml、濃度為0.7m的無(wú)氧氨水溶液中，室溫劇烈攪拌30min。磁鐵分離，用超純水洗至中性，定容250ml容量瓶中，密封保存得到fe3o4mnps儲(chǔ)備溶液。實(shí)施例2配制含0.04mfecl3·6h2o與20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的h2o2混合水溶液40ml，記為溶液a；配制含0.04mk3fe(cn)6與20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的h2o2混合水溶液40ml，記為溶液b；在攪拌狀態(tài)下，溶液a緩慢滴加到溶液b中，再加入20mlfe3o4mnps儲(chǔ)備液，攪拌3h，含有磁性普魯士藍(lán)納米粒子的溶液。取出膠體溶液，進(jìn)行磁性分離、清洗，將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干，得到粉末狀pbmnps。實(shí)施例3在磁力攪拌下，將濃度為5mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)水溶液加入到含有濃度為1mg/ml的pbmnps溶液的聚四氟乙烯容器中，約3h后，將溶液在140℃電爐中的不銹鋼高壓釜中放置4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行離心分離，離心后，將沉淀物在蒸餾水中洗滌數(shù)次。冷凍干燥后得到中空的納米顆粒載體(hpbmnps)。使用掃描電子顯微鏡(sem)、透射電子顯微鏡(tem)對(duì)pbmnps和hpbmnps進(jìn)行表征如圖1所示，其中a為pbmnps的sem和；b和c分別為hpbmnps的sem和tem圖。從中看出，合成的hpbmnps粒子粒徑約為100nm左右，具有約為90nm的中空，而其中的微孔小于2nm，和膀胱癌治療藥物順鉑的粒徑相近，非常適于運(yùn)載。采用ft-ir(傅里葉變換紅外光譜)及振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)lh-3來(lái)表征fe3o4mnps和hpbmnps，其表征圖分別圖1和表1。從紅外來(lái)看，合成的hpbmnps是符合要求的，而從磁性強(qiáng)度的測(cè)試，也得出合成的粒子具有超順磁性，在一定的磁場(chǎng)范圍內(nèi)可以定向移動(dòng)，這樣就可以用于磁靶性運(yùn)載。表1fe3o4mnps和pbmnps的磁性性質(zhì)物質(zhì)fe3o4mnpshpbmnps磁性性質(zhì)超順磁性超順磁性實(shí)施例4為了充分利用hpbmnps在細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用中的潛力，必須考慮的首要任務(wù)是安全/毒理學(xué)問(wèn)題。通過(guò)t24細(xì)胞的mtt測(cè)定檢查合成的hpbmnps的細(xì)胞毒性。即使hpbmnps的劑量高達(dá)1000mgml-1時(shí)，細(xì)胞活力約為70％，表明在體外具有優(yōu)異的生物相容性。為了確保hpbmnps可用于不同的化療方案，我們進(jìn)一步研究了ph對(duì)hpbmnps穩(wěn)定性的影響。hpbmnps溶液在ph值為2，5.4，7.4和8.6時(shí)保持其藍(lán)色，分別代表胃、內(nèi)體、血液和膀胱中的條件，表明hpbmnps納米顆粒在較寬范圍的ph條件下是穩(wěn)定的。溶液的顏色在高ph值為11時(shí)變成淺橙色，表明hpbmnps中的配位結(jié)構(gòu)的分解(淺橙色來(lái)自fe(oh)3)。然而，在體內(nèi)從未發(fā)現(xiàn)如此高的ph條件。實(shí)施例5在黑暗中攪拌下，將5mg的hpbmnps納米顆粒加入到3ml順鉑水溶液(2mg/ml)中。24小時(shí)后，通過(guò)離心機(jī)分離hpbmnps納米顆粒。通過(guò)將上清液與鄰苯二胺溶液的dmf溶液(1.2mg/ml)以1:1的體積比混合來(lái)測(cè)定上清液中的順鉑濃度。將混合物在100℃下加熱10分鐘，然后通過(guò)juscov-570uv/vis/nir分光光度計(jì)測(cè)量704nm處的吸光度,如圖3(a)所示，表明其負(fù)載性很好。實(shí)施例6為了釋放順鉑，在37℃下不加攪拌將裝載有順鉑的hpbmnps納米顆粒(5mg)加入到pbs緩沖液(ph7.4,5ml)中。通過(guò)uv/vis分光光度計(jì)測(cè)量順鉑從載鉑的hpbmnps納米顆粒的釋放曲線，如圖3(b)所示，順鉑釋放率較低，但足夠?qū)24細(xì)胞進(jìn)行殺傷。利用元素分析儀對(duì)cis@hpbmnps進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)fe和pt都有對(duì)映的映射，且均勻分布，表明pt和fe均勻分布。實(shí)施例7將t24細(xì)胞系用含有10％胎牛血清的mccoy's5α培養(yǎng)基作為單層培養(yǎng)，在37℃的95％空氣和5％co2的潮濕氣氛的培養(yǎng)箱中。在這些條件下，電鍍效率為90％，倍增時(shí)間為19小時(shí)。通過(guò)單層培養(yǎng)物的胰蛋白酶消化獲得單細(xì)胞懸浮液。實(shí)施例8將t24細(xì)胞以1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔培養(yǎng)板中。孵育過(guò)夜后，用不同濃度的hpbmnps納米顆粒(0,50,100,150,200μg/ml)和負(fù)載順鉑的hpbmnps(0,50,100,150和200μg/ml)24小時(shí)。然后，用0.5mg/mlmtt處理細(xì)胞1小時(shí)，并將產(chǎn)生的甲臘晶體在100μldmso中勻漿。使用酶標(biāo)儀(moleculardevices，usa)在570nm和690nm讀取光密度(od)。在570nm記錄吸光度，參考值為690nm。在單獨(dú)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞或0.01％的tritonx-100作為細(xì)胞活力的陰性對(duì)照或細(xì)胞死亡陽(yáng)性對(duì)照。hpbmnps和負(fù)載順鉑的hpbmnps對(duì)細(xì)胞活力的影響通過(guò)與陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化的活細(xì)胞的相對(duì)百分比進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖4所示。負(fù)載順鉑的hpbmnps隨著其濃度的提高，對(duì)t24細(xì)胞的殺傷力增強(qiáng)，表明其與劑量有關(guān)，可對(duì)其增加人體可承受范圍的劑量。實(shí)施例9在每個(gè)孔底部的lab-tek腔室蓋玻片的4孔培養(yǎng)板中以1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種t-24細(xì)胞。孵育過(guò)夜后，連接到板上的t-24細(xì)胞，并將mem培養(yǎng)基用無(wú)血清的mem培養(yǎng)基(0.5ml/孔)中的不同濃度的藥物負(fù)載納米顆粒置換。然后用pbs溶液洗滌細(xì)胞鍍覆層三次。然后加入dapipbs緩沖液(2.80e-5m，1ml)將細(xì)胞核染色30-60分鐘。用pbs溶液洗滌后，使用具有63x油浸物鏡的共焦熒光顯微鏡系統(tǒng)(leicatcssp5ii)檢查dapi染色的覆蓋層以檢查顆粒的細(xì)胞定位，如圖5所示，其中(a)無(wú)，(b)只有hpbmnps，(c)cis@hpbmnps，當(dāng)用cis@hpbmnps處理細(xì)胞時(shí)，可以看出細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞的形態(tài)在形狀上變化，顯示了負(fù)載順鉑的hpbmnps具有較高的t24細(xì)胞殺傷能力。達(dá)到了我們預(yù)期的效果，在以后的癌癥治療方面具有明顯的應(yīng)用價(jià)值。最后有必要說(shuō)明的是，以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12