本發(fā)明涉及一種基于磁小體、磁性微囊和體外磁力引導(dǎo)設(shè)備組合構(gòu)建的沙門氏菌體內(nèi)磁引導(dǎo)投送方法，具體地說，涉及含有磁小體的趨磁沙門氏菌和裝載趨磁沙門氏菌的磁性微囊，并通過在體外的非接觸式磁引導(dǎo)設(shè)備，組合實(shí)現(xiàn)的一種沙門氏菌在體內(nèi)靶向投送的方法，屬于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

傳統(tǒng)的分子藥物靶向輸送方法存在藥物不能足夠精確和足量到達(dá)病患處的問題，故要提高抗腫瘤治療因子的靶向效率和殺傷效果，需要依托新型的靶向轉(zhuǎn)運(yùn)載體。相比于其他的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，沙門氏菌具有趨低氧、嗜腫瘤組織特性。借助趨化受體和動(dòng)力鞭毛，它可以感測、移動(dòng)、聚集、并在實(shí)體瘤內(nèi)擴(kuò)增，但由于沙門氏菌自驅(qū)動(dòng)力較弱，且體內(nèi)血管環(huán)境復(fù)雜，使之不易到達(dá)靶器官腫瘤組織。

趨磁細(xì)菌是一類能夠沿著磁場方向運(yùn)動(dòng)的細(xì)菌的總稱，其最顯著的特征是在胞內(nèi)特殊的原核細(xì)胞器—磁小體。磁小體是具有外膜包被、納米級、在胞內(nèi)成鏈狀排列的fe3o4或fe3s4磁性顆粒，如同指南針一樣為趨磁細(xì)菌導(dǎo)航[文獻(xiàn)1]。kolinkoi等利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在具有光合作用的紅螺菌體內(nèi)合成磁性納米顆粒，即磁小體鏈,開創(chuàng)了趨磁細(xì)菌的人工合成方法[文獻(xiàn)2]。進(jìn)一步，martel利用核磁共振(mri)梯度場實(shí)現(xiàn)了趨磁細(xì)菌在人造血管中的運(yùn)動(dòng)控制[文獻(xiàn)3]。加拿大生物醫(yī)學(xué)工程研究所-納米機(jī)器人實(shí)驗(yàn)室嘗試在體外控制載藥趨磁細(xì)菌的移動(dòng)方向，突破了大分子藥物難以彌散到實(shí)體瘤乏氧區(qū)的難題[文獻(xiàn)4]。但以上的研究多基于體外的模擬試驗(yàn)，難以克服體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境對細(xì)菌投送的影響，故需研發(fā)一種趨磁細(xì)菌在體內(nèi)靶向投送的方法。

文獻(xiàn)1：alphandérye.applicationsofmagnetosomesynthesizedbymagnetotacticbacteriainmedicine.frontbioengbiotechnol.2014,2(5):1-6

文獻(xiàn)2：kolinkoi,lohea,borgs,.raschdorfo,joglerc,tuq,posfaim,tompae,plitzkojm,brachmanna,wannerg,mullerr,zhangy,schulerd.biosynthesisofmagneticnanostructuresinaforeignorganismbytransferofbacterialmagnetosomegeneclusters.natnanotechnol.2014,9(3):193-197

文獻(xiàn)3：martels,felfoulo,mathieujb,chanua,tamazs,mohammadim,mankiewiczm,tabatabaein.mri-basedmedicalnanoroboticplatformforthecontrolofmagneticnanoparticlesandflagellatedbacteriafortargetinterventionsinhumancapillaries.intjrobres.2009,28(9):1169-1182

文獻(xiàn)4：taherkhanis,mohammadm,daoudj,martels,tabrizianm.covalentbindingofnanoliposomestothesurfaceofmagnetotacticbacteriaforthesynthesisofself-propelledtherapeuticagents.acsnano.2014,8(5):5049-5060

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種含有趨磁沙門氏菌的磁性微囊，以及利用該磁性微囊在體外磁引導(dǎo)設(shè)備作用下體內(nèi)趨磁沙門氏菌的靶向投送方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種磁性微囊，包括：

由含趨磁沙門氏菌的培養(yǎng)液和降解液混合得到的混合液滴，所述趨磁沙門氏菌內(nèi)含有磁小體；

磷酸甘油酯微滴，其中包含所述混合液滴；以及

磁性水凝膠外殼，其包裹在所述磷酸甘油酯微滴之外。

優(yōu)選地，所述降解液為海藻酸鈉水凝膠降解液。

優(yōu)選地，所述混合液滴中的含趨磁沙門氏菌的培養(yǎng)液的細(xì)菌密度為1×10⁵個(gè)/毫升；所述海藻酸鈉水凝膠的濃度為0.01克/毫升。

優(yōu)選地，所述水凝膠外殼通過包含四氧化三鐵磁性納米粒子的海藻酸溶液和氯化鈣溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)形成。

優(yōu)選地，所述包含四氧化三鐵磁性納米粒子的海藻酸溶液中的磁性納米粒子濃度為0.005克/毫升。

優(yōu)選地，所述磁小體的是由質(zhì)粒ptps-abg6復(fù)合體和質(zhì)粒ptps-xyz復(fù)合體通過電穿孔方法構(gòu)建。

本發(fā)明還提供了根據(jù)以上技術(shù)方案中任一項(xiàng)所述的磁性微囊的制造方法，包括以下步驟：

將趨磁沙門氏菌的菌液接種于不含抗生素的lysogenybroth(lb)培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌2次，洗滌后的細(xì)菌懸于冰預(yù)冷的無菌去離子水，用電穿孔法將ptps-abg6、ptps-xyz質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至沙門氏菌，構(gòu)建磁小體基因，從而實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的趨磁性。

利用半導(dǎo)體工藝的軟光刻技術(shù)，加工微流道芯片；

將含所述減毒沙門氏菌的lb培養(yǎng)液和0.0162克/毫升的海藻酸鈉水凝膠降解液混合；

通過注射泵，將該混合液，磷酸甘油酯、包含四氧化三鐵磁性納米粒子的海藻酸溶液和礦物油分別注入所述微流道芯片，形成海藻酸溶液包裹磷酸甘油酯微滴再包含混合液微滴的結(jié)構(gòu)；

海藻酸溶液被礦物油液體夾斷，形成海藻酸液微滴，該微液滴被注入氯化鈣溶液中，海藻酸微滴將和氯化鈣溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成水凝膠外殼，從而形成磁性微囊結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選地，所述微流道的深度為100微米。

本發(fā)明還提供了一種沙門氏菌的磁引導(dǎo)投送方法，包括以下步驟：

步驟一、制造包含所述沙門氏菌的根據(jù)以上技術(shù)方案之一所述的磁性微囊；

步驟二、將所述磁性微囊投遞到目標(biāo)位置附近的第一位置；

步驟三、利用磁力引導(dǎo)設(shè)備的磁場引導(dǎo)所述磁性微囊到達(dá)目標(biāo)位置附近的第二位置；

步驟四、所述磁性微囊在所述第二位置破裂，從而釋放所述沙門氏菌；之后，使所述沙門氏菌在磁場梯度的引導(dǎo)下，移動(dòng)到目標(biāo)位置。

優(yōu)選地，所述磁力引導(dǎo)設(shè)備包括機(jī)械臂和電磁鑷；通過所述機(jī)械臂能夠調(diào)節(jié)所述電磁鑷的尖端位置，從而形成所述磁場梯度。

優(yōu)選地，在所述步驟四中，含有所述沙門氏菌的磁性微囊通過其自身內(nèi)部包裹的降解液使其定時(shí)破裂，從而將所述沙門氏菌釋放。

有益效果：

本發(fā)明通過基于微流控技術(shù)構(gòu)建包裹趨磁沙門氏菌的磁性微囊；最后基于這種包裹沙門氏菌的磁性微囊，構(gòu)建基于機(jī)械臂控制的磁力引導(dǎo)的靶向投遞方法，可實(shí)現(xiàn)集器官內(nèi)介入、大血管微囊磁導(dǎo)投遞與小血管沙門氏菌磁導(dǎo)自趨于一體的主動(dòng)式三級投遞系統(tǒng)，突破治療因子的高靶向性、高濃度的投送，可以克服目前伴多器官轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌治療方法效率低、特異性不高的問題，為提高靶向藥物的治療效率提供新的途徑。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的方法示意圖

圖2是微流道結(jié)構(gòu)示意圖

圖3中的局部位置16的細(xì)節(jié)圖

附圖標(biāo)記：1.沙門氏菌鞭毛；2.沙門氏菌；3.包裹沙門氏菌磁性微囊；4.介入管道；5.肝臟；6.機(jī)械臂；7.尖端電磁鑷；8.電磁鑷鐵芯尖端；9.螺線管；10含有沙門氏菌的培養(yǎng)液和海藻酸鈉水凝膠降解液的混合液注入微流道；11.磷酸甘油酯注入微流道；12.海藻酸鈉溶液注入微流道；13.礦物油注入微流道，14.肝臟中血管，15.腫瘤，16.腫瘤位置。

具體實(shí)施方式

在此的術(shù)語“微流控”所指的是一種精確控制和操控微尺度流體，尤其特指亞微米結(jié)構(gòu)的技術(shù)。

根據(jù)本發(fā)明的磁引導(dǎo)靶向投送方法如圖1所示，所述投送方法步驟如下；

步驟一、基于微流控技術(shù)加工包含趨磁沙門氏菌的磁性微囊。

步驟二、通過臨床醫(yī)學(xué)中介入的方法，將本發(fā)明所述的含有趨磁沙門氏菌的磁性微囊準(zhǔn)確投遞至肝臟大血管位置。

步驟三、將本發(fā)明所述的包含趨磁沙門氏菌的磁性微囊在由所述磁力引導(dǎo)設(shè)備的磁場引導(dǎo)下隨著血流進(jìn)入靶器官；通過磁力引導(dǎo)設(shè)備中的機(jī)械臂調(diào)節(jié)電磁鑷的尖端位置，沿著通向腫瘤的血管的方向，形成磁力梯度。磁性微囊可以沿著磁力梯度到達(dá)通向腫瘤的小血管前段(血管直徑小于磁性微囊的直徑)。磁性微囊在體內(nèi)的空間位置通過核磁設(shè)備(mri)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。

步驟四、在小血管前段，本發(fā)明所述的含有沙門氏菌的磁性微囊通過其自身內(nèi)部包裹的降解液使其定時(shí)破裂，從而將所述重組減毒沙門氏菌釋放；之后，便進(jìn)入所述趨磁沙門氏菌的由于具有趨磁性的自驅(qū)動(dòng)階段，在這一階段，所述趨磁沙門氏菌運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力主要是由自身攜帶的鞭毛提供，其運(yùn)動(dòng)的方向由磁力梯度來控制，磁力梯度覆蓋腫瘤位置，從而引導(dǎo)沙門氏菌移動(dòng)至腫瘤位置，從而完成所述含有沙門氏菌的磁性載體的靶向投送

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的投送過程如下：

(1)將減毒沙門氏菌的菌液接種于不含抗生素的lysogenybroth(lb)培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的細(xì)菌懸于冰預(yù)冷的無菌去離子水，用電穿孔法(multiporator4308eppendorf電轉(zhuǎn)儀)將ptps-abg6、ptps-xyz轉(zhuǎn)染至減毒沙門氏菌，從而實(shí)現(xiàn)減毒沙門氏菌的趨磁性。

(2)利用半導(dǎo)體工藝的軟光刻技術(shù)，加工polydimethylsiloxane(pdms)微流道。如圖2所示，所述微流道包括含有沙門氏菌的培養(yǎng)液和海藻酸鈉水凝膠降解液的混合液注入微流道10、磷酸甘油酯注入微流道11、海藻酸鈉溶液注入微流道12，以及礦物油注入微流道13。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，該微流道的深度為大約100微米，出口寬度為大約400微米。將含減毒沙門氏菌的lb培養(yǎng)液(細(xì)菌密度：1×10⁵個(gè)/毫升)和0.0162克/毫升的sodiumcitratetribasicdihydrate海藻酸鈉水凝膠降解液混合，之后，按照圖2所示，通過注射泵，將該混合液，磷酸甘油酯、包含四氧化三鐵磁性納米粒子的海藻酸溶液(磁性粒子濃度：0.005克/毫升，海藻酸溶液濃度：0.01克/毫升)和礦物油分別注入該芯片，形成海藻酸溶液包裹磷酸甘油酯微滴再包含混合液微滴的結(jié)構(gòu)。再次，海藻酸溶液被礦物油液體夾斷，形成海藻酸液微滴，該微液滴被注入氯化鈣溶液中，海藻酸微滴將和氯化鈣溶液發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成水凝膠外殼，從而形成磁性微囊結(jié)構(gòu)。

(3)通過臨床醫(yī)療中介入的方法，將磁性微囊準(zhǔn)確投遞至靶向器官大血管位置，接著，磁性微囊可在由機(jī)械臂控制的尖端電磁鑷的磁場引導(dǎo)下隨著血流進(jìn)入靶器官。尖端電磁鑷由直徑為1毫米的銅線和圓柱形軟鐵鐵芯兩部分組成，銅線繞鐵芯一端形成5000匝的螺線管，鐵芯另一端被加工成尖端，用于匯聚磁場。如圖1所示，尖端電磁鑷鐵芯包括一基本呈圓柱形的部分，以及連接于該圓柱的一端的基本呈圓錐形的部分。其中該基本呈圓柱形的部分的長度大約22厘米，截面直徑大約為16厘米。該基本呈圓錐形的部分的底面尺寸與該圓柱形部分的端面尺寸基本相同，高度可根據(jù)實(shí)際需要設(shè)計(jì)。在核磁共振成像系統(tǒng)的引導(dǎo)下，確定腫瘤具體位置，通過機(jī)械臂調(diào)節(jié)電磁鑷的尖端位置，沿著通向腫瘤的血管的方向，形成磁力梯度。磁性微囊可以沿著磁力梯度到達(dá)通向腫瘤的小血管前段。在小血管前段，磁性微囊通過其自身內(nèi)部包裹的降解液使其定時(shí)破裂，從而將微囊內(nèi)的減毒沙門氏細(xì)菌釋放。之后，便進(jìn)入趨磁細(xì)菌的自驅(qū)動(dòng)階段，在這一階段，趨磁減毒沙門氏菌運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力主要是由自身攜帶的鞭毛提供，其運(yùn)動(dòng)的方向由體外磁場梯度來控制，體外磁場梯度穿過腫瘤位置，引導(dǎo)沙門氏菌移動(dòng)至腫瘤位置，從而完成重組減毒沙門氏菌的靶向投遞。