本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種DNA分子克隆方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA分子克隆技術(shù)是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，其創(chuàng)新和發(fā)展直接推動(dòng)著分子生物學(xué)的進(jìn)步。目前使用的分子克隆方法主要有3類：1.酶切-連接方法。使用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶是最早的分子克隆方法，目前仍在廣泛使用，但它受DNA內(nèi)部相應(yīng)位點(diǎn)的限制(包括近年建立的Golden Gate克隆)。2.重疊序列克隆。該類方法包括Gibson拼接、In-Fusion、LIC等，具有不受DNA序列限制、可同步拼接多個(gè)片段的優(yōu)點(diǎn)，但Gibson和In-Fusion試劑盒昂貴，并且需要線性化的載體，不能像Gateway克隆那樣直接使用環(huán)狀質(zhì)粒。3.特異位點(diǎn)重組克隆。該類方法主要是Gateway克隆，能直接在質(zhì)粒間進(jìn)行DNA重組，操作簡(jiǎn)便，具有高通量的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是試劑昂貴、多片段克隆受限(只能克隆2-4個(gè)片段且效率低)、特異位點(diǎn)序列不能去除。因此，目前的分子克隆方法仍存在一些不足，缺乏一種適用范圍廣、接受程度高的方法，還存在克隆效率低的問(wèn)題。故急需一種DNA分子克隆方法，解決上述技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種DNA分子克隆方法及其應(yīng)用，優(yōu)化了克隆反應(yīng)液的成分，其次是建立了2個(gè)閉環(huán)載體間的克隆，并且可去除接頭序列的無(wú)縫克隆，提高了克隆效率，可廣泛用于各種類型的DNA分子克隆。

本發(fā)明采用的技術(shù)手段如下：一種DNA分子克隆方法，包括以下步驟：

S1、獲得入門載體，所述入門載體含有ccdB基因，所述ccdB基因一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第一接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn)，另一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第二接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn)，即所述入門載體含有“SfiI酶切位點(diǎn)-第一接頭序列-XcmI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-XcmI酶切位點(diǎn)-第二接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)”的結(jié)構(gòu)；

S2、獲得環(huán)狀表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有ccdB基因，所述ccdB基因一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第三接頭序列，另一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第四接頭序列；所述第三接頭序列與第一接頭序列相同，所述第四接頭序列與第二接頭序列相同，即所述表達(dá)載體含有“第三接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-SfiI酶切位點(diǎn)-第四接頭序列”的克隆框結(jié)構(gòu)；

S3、通過(guò)PCR獲得目標(biāo)DNA，通過(guò)TA克隆插入到所述入門載體，獲得入門克??；

或者在PCR過(guò)程中通過(guò)引物加入相應(yīng)的接頭序列，獲得線性PCR產(chǎn)物；

S4、將上述入門克隆或線性PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體混合，在克隆反應(yīng)液作用下完成克隆。

進(jìn)一步的，所述目標(biāo)DNA為單個(gè)或多個(gè)DNA片段，多個(gè)DNA通過(guò)在片段間的接頭序列完成克隆。

進(jìn)一步的，所述克隆反應(yīng)液包含：SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶，利用克隆反應(yīng)液中T5核酸外切酶的5＇-3＇外切酶活性和Phusion酶的3＇-5＇外切酶活性的共同作用可消化去除表達(dá)載體上的接頭序列，實(shí)現(xiàn)無(wú)縫克隆。

進(jìn)一步的，所述第一接頭序列和第二接頭序列為15-40bp。

進(jìn)一步的，所述克隆反應(yīng)條件為50℃反應(yīng)15～60分鐘。

本發(fā)明提供一種目標(biāo)DNA分子克隆重組載體，所述載體由上述DNA分子克隆的方法而制備。

本發(fā)明提供一種DNA分子克隆的試劑盒，所述試劑盒包含：上述的克隆反應(yīng)液、入門載體和表達(dá)載體。

本發(fā)明提供單DNA片段或多DNA片段克隆，或表達(dá)載體的多部位克隆。

本發(fā)明中的目標(biāo)DNA片段既可通過(guò)PCR加接頭，以線性PCR產(chǎn)物的形式克隆到環(huán)狀表達(dá)載體，也可將目標(biāo)DNA片段克隆到入門載體后，以環(huán)狀入門克隆的形式克隆到環(huán)狀表達(dá)載體。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，將“SfiI酶切位點(diǎn)-第一接頭序列-XcmI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-XcmI酶切位點(diǎn)-第二接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)”結(jié)構(gòu)分別插入到pENTR/D-TOPO載體的TOPO克隆位點(diǎn)處，獲得卡那霉素(Kan)抗性的配套入門載體。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，將“第三接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-SfiI酶切位點(diǎn)-第四接頭序列”結(jié)構(gòu)替換pUC19質(zhì)粒上的lacZ基因，獲得氨芐青霉素(Amp)抗性的配套表達(dá)載體。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，選用lacZ基因，比較了該克隆系統(tǒng)的帶接頭序列克隆和無(wú)縫克隆與Gibson克隆的效率。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，選用lacZ基因構(gòu)建入門克隆，完成了2個(gè)閉環(huán)載體間的克隆。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，選用番木瓜eIF4E基因和番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)的VPg基因，完成了2個(gè)基因克隆到表達(dá)載體的2個(gè)部位。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種DNA分子克隆的試劑盒。

本發(fā)明的提供的技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明優(yōu)化了克隆反應(yīng)液的成分以及入門載體和表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)，建立了2個(gè)閉環(huán)載體間的克隆，發(fā)現(xiàn)了可去除接頭序列的無(wú)縫克隆，實(shí)現(xiàn)單個(gè)或多個(gè)線性PCR產(chǎn)物或環(huán)狀質(zhì)粒上的DNA在克隆反應(yīng)液作用下直接克隆到環(huán)狀目標(biāo)載體的一個(gè)或多個(gè)部位，提高了克隆效率。其中，DNA片段與目標(biāo)載體SfiI-ccdB-SfiI結(jié)構(gòu)側(cè)翼的重疊序列可設(shè)計(jì)在接頭序列的外圍，不重疊的接頭序列可由T5核酸外切酶的5＇-3＇外切酶活性和Phusion酶的3＇-5＇外切酶活性消化去除，使得該方法既可用于通用重疊序列(接頭)的標(biāo)準(zhǔn)化克隆，也可用于特需要求的去除接頭序列的無(wú)縫克隆，提高了克隆效率。本發(fā)明的DNA分子克隆方法可廣泛用于各種類型的DNA分子克隆。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的DNA分子克隆方法的應(yīng)用示意圖，可靈活用于單片段、多片段、多克隆位點(diǎn)等多種形式的克?。?/p>

圖2是配套入門載體的結(jié)構(gòu)示意圖，含有“SfiI酶切位點(diǎn)-第一接頭序列-XcmI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-XcmI酶切位點(diǎn)-第二接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)”的結(jié)構(gòu)；

圖3是配套表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖，含有“第三接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-SfiI酶切位點(diǎn)-第四接頭序列”的克隆框結(jié)構(gòu)；

圖4是本發(fā)明克隆方法的帶接頭序列克隆和無(wú)縫克隆與Gibson克隆的效率比較；

圖5是2個(gè)基因以線性PCR產(chǎn)物的形式克隆到表達(dá)載體2個(gè)部位的重組子的鑒定，其中M：DL2000Marker(大連寶生物)，1-10為隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆，上、下2條帶分別為番木瓜eIF4E基因和PRSV的VPg基因。

圖6是2個(gè)基因以入門克隆的形式克隆到表達(dá)載體2個(gè)部位的重組子的鑒定，其中M：DL2000Marker(大連寶生物)，1-10為隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆，上、下2條帶分別為番木瓜eIF4E基因和PRSV的VPg基因。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例未詳述的方案和配方，請(qǐng)參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社。

實(shí)施例1

(1)入門載體的構(gòu)建

首先克隆“SfiI酶切位點(diǎn)-第一接頭序列-XcmI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-XcmI酶切位點(diǎn)-第二接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)”結(jié)構(gòu)。根據(jù)ccdB基因的核酸序列(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)：JQ085427)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物FP(SEQ ID NO:1)：

TCAGCTGTCTCGTTATTCTCGACTAAGTTGGCAG，以及下游引物RP(SEQ ID NO:2)：

TCAACAAACGCAGACTGTGTATAAGGGAGCCTG，其中斜體的序列分別為SfiI酶切位點(diǎn)和XcmI酶切位點(diǎn)，下劃線序列為接頭序列。以含ccdB基因的質(zhì)粒pRNAi-GG(GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)：JQ085427)為模板，利用上述兩條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4分鐘；再94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增得到ccdB基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)電泳回收后與pENTR/D-TOPO載體混合，通過(guò)TOPO克隆反應(yīng)插入到載體上，獲得本發(fā)明克隆配套的卡那霉素(Kan)抗性入門載體(如圖2所示)。其它類型(不同抗性、不同接頭序列)的配套入門載體的構(gòu)建參照此方法。

(2)表達(dá)載體的構(gòu)建

首先克隆“第三接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-SfiI酶切位點(diǎn)-第四接頭序列”的克隆框結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物FP(SEQ ID NO:3)：AGCTGTCTCGTTCCATCTCTATTCTCGACTAAGTTGGCAG，以及下游引物RP(SEQ ID NO:4)：AACAAACGCAGACCACAAGTCTGTGTATAAGGGAGCCTG，其中斜體的序列為SfiI酶切位點(diǎn)，下劃線的序列為接頭序列，接頭序列分別與上述入門載體中的接頭序列一致。以含ccdB基因的質(zhì)粒pRNAi-GG為模板，利用該對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4分鐘；再94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增得到ccdB基因的PCR產(chǎn)物，電泳回收。

接著擴(kuò)增pUC19載體框架，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，

上游引物FP(SEQ ID NO:5)：

AGAGATGGAACGACAGCT TCACTGCCCGCTTTCCAGTC，

以及下游引物RP(SEQ ID NO:6)：

ACTTGTGGTCTGCGTTTGTT TGTGACCGTCTCCGGGAGCT，其中下劃線序列分別與上述接頭序列反向互補(bǔ)。以含pUC19載體為模板，利用該對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4分鐘；再94℃30秒，55℃30秒，72℃90秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增得到pUC19載體框架的PCR產(chǎn)物，電泳回收。

回收后的克隆框結(jié)構(gòu)與pUC19載體框架混合，通過(guò)Gibson克隆，獲得本發(fā)明克隆配套的氨芐青霉素(Amp)抗性的表達(dá)載體(如圖3所示)，命名為pUC19-NC。其它類型(不同抗性、不同接頭序列)的配套表達(dá)載體的構(gòu)建參照此方法。

(3)克隆反應(yīng)：本發(fā)明克隆方法與Gibson克隆的克隆效率比較

選用lacZ基因?yàn)槟繕?biāo)基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，

上游引物FP(SEQ ID NO:7)：

AGCTGTCTCGTTCCATCTCTGCGCAACGCAATTAATGTGAG，以及下游引物RP(SEQ ID NO:8)：

AACAAACGCAGACCACAAGTACAGCTTGTCTGTAAGCGGA，下劃線序列分別與配套表達(dá)載體上的接頭序列相同，用于本發(fā)明的帶接頭序列克隆和Gibson克隆；

設(shè)計(jì)另一對(duì)lacZ基因引物，上游引物FP(SEQ ID NO:9)：

GACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAG，以及下游引物RP(SEQ ID NO:10)：

AGCTCCCGGAGACGGTCACA ACAGCTTGTCTGTAAGCGGA，下劃線序列不與配套表達(dá)載體上的接頭序列相同，而是與接頭序列外圍的載體序列反向互補(bǔ)，用于本發(fā)明的去除接頭序列的無(wú)縫克隆。以含pUC19載體為模板，利用這兩點(diǎn)對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4分鐘；再94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。擴(kuò)增得到2個(gè)lacZ基因(含原核啟動(dòng)子)的PCR產(chǎn)物，電泳回收，分別命名為lacZ和lacZ-sl

(無(wú)縫克隆)。

將lacZ和lacZ-sl分別與配套表達(dá)載體pUC19-NC的環(huán)狀質(zhì)粒混合，利用含有SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶的克隆反應(yīng)液，50℃反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行帶接頭序列克隆和無(wú)縫克隆，其中，克隆反應(yīng)液中T5核酸外切酶的5＇-3＇外切酶活性和Phusion酶的3＇-5＇外切酶活性的共同作用可消化去除表達(dá)載體上的接頭序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)無(wú)縫克?。粚UC19-NC環(huán)狀質(zhì)粒用SfiI酶切，回收的線性載體與lacZ混合，進(jìn)行Gibson克隆，反應(yīng)條件同樣為50℃反應(yīng)1小時(shí)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌后統(tǒng)計(jì)藍(lán)色菌落，結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明克隆方法的帶接頭序列克隆和無(wú)縫克隆的效率均比Gibson克隆高。

實(shí)施例2：2個(gè)基因克隆到載體的2個(gè)部位

(1)2個(gè)基因以線性PCR產(chǎn)物形式克隆到表達(dá)載體的2個(gè)部位

選用番木瓜eIF4E基因和番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)的VPg基因，利用本發(fā)明的克隆方法將這2個(gè)基因同步克隆到整合型植物BiFC載體(pBiFC-GG)的2個(gè)部位。

設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增番木瓜eIF4E基因的引物，

上游引物FP(SEQ ID NO:11)：

GTCTGGAGACCTAGGTTCTG ATGGTAGTAGAAGGAACCC，

以及下游引物RP(SEQ ID NO:12)：

CTGAACCACCTGAGACCGAA TACCGAGTAGCGATTCTTAG，

以番木瓜的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因。

設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增PRSV的VPg基因的引物，

上游引物FP(SEQ ID NO:13)：

TAGTGGCGGAGACCATGGAG ATGGGTTTCTCCGCGCGACAG，以及下游引物RP(SEQ ID NO:14)：

TACTACCTCCTGAAGAGACC TTCATGGTGAACAGATTTTGTT,以感染PRSV的番木瓜cDNA為模板，擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因。2個(gè)基因經(jīng)電泳回收后與pBiFC-GG載體混合，通過(guò)含有SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶的克隆反應(yīng)液作用，獲得重組載體。重組載體經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5，隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆均含有番木瓜eIF4E基因和PRSV的VPg基因。

(2)2個(gè)基因以入門克隆的形式克隆到表達(dá)載體的2個(gè)部位設(shè)計(jì)不帶接頭序列的PCR引物，其中擴(kuò)增番木瓜eIF4E基因的引物為，上游引物FP(SEQ ID NO:15)：ATGGTAGTAGAAGGAACCC，以及下游引物RP(SEQ ID NO:16)：TACCGAGTAGCGATTCTTAG，以番木瓜的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因。

擴(kuò)增PRSV的VPg基因的引物為，

上游引物FP(SEQ ID NO:17)：ATGGGTTTCTCCGCGCGACAG，

以及下游引物RP(SEQ ID NO:18)：

TTCATGGTGAACAGATTTTGTT,以感染PRSV的番木瓜cDNA為模板，擴(kuò)增獲得目標(biāo)基因。2個(gè)基因經(jīng)PCR和電泳回收后通過(guò)TA克隆插入到氨芐抗性的入門載體中，帶有目標(biāo)基因的2個(gè)入門克隆與pBiFC-GG載體混合，通過(guò)含有SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶的克隆反應(yīng)液作用，獲得重組載體。重組載體經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖6，隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆均含有番木瓜eIF4E基因和PRSV的VPg基因。

實(shí)施例3

一種DNA分子克隆的試劑盒，所述試劑盒包含：克隆反應(yīng)液、入門載體和表達(dá)載體，其中，所述克隆反應(yīng)液包含：SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶；所述入門載體含有ccdB基因，所述ccdB基因一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第一接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn)，另一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第二接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn)，即所述入門載體含有“SfiI酶切位點(diǎn)-第一接頭序列-XcmI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-XcmI酶切位點(diǎn)-第二接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)”的結(jié)構(gòu)；所述表達(dá)載體含有ccdB基因，所述ccdB基因一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第三接頭序列，另一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第四接頭序列；所述第三接頭序列與第一接頭序列相同，所述第四接頭序列與第二接頭序列相同，即所述表達(dá)載體含有“第三接頭序列-SfiI酶切位點(diǎn)-ccdB基因-SfiI酶切位點(diǎn)-第四接頭序列”的克隆框結(jié)構(gòu)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明保護(hù)的范圍之內(nèi)。