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一種DNA分子克隆方法及其應(yīng)用與流程

文檔序號(hào):12778964閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種DNA分子克隆方法,其特征在于:包括以下步驟:

S1、獲得入門載體,所述入門載體含有ccdB基因,所述ccdB基因一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第一接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn),另一端依次連接X(jué)cmI酶切位點(diǎn)、第二接頭序列和SfiI酶切位點(diǎn);

S2、獲得環(huán)狀表達(dá)載體,所述表達(dá)載體含有ccdB基因,所述ccdB基因一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第三接頭序列,另一端依次連接SfiI酶切位點(diǎn)和第四接頭序列;所述第三接頭序列與第一接頭序列相同,所述第四接頭序列與第二接頭序列相同;

S3、通過(guò)PCR獲得目標(biāo)DNA,通過(guò)TA克隆插入到所述入門載體,獲得入門克??;

或者在PCR過(guò)程中通過(guò)引物加入相應(yīng)的接頭序列,獲得線性PCR產(chǎn)物;

S4、將上述入門克隆或線性PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體混合,在克隆反應(yīng)液作用下完成克隆。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子克隆方法,其特征在于:所述目標(biāo)DNA為單個(gè)或多個(gè)DNA片段,多個(gè)DNA通過(guò)在片段間的接頭序列完成克隆。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子克隆方法,其特征在于:所述克隆反應(yīng)液包含:SfiI限制性內(nèi)切酶、T5核酸外切酶和Phusion DNA聚合酶。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子克隆方法,其特征在于:所述接頭序列為15-40bp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子克隆方法,其特征在于:所述克隆反應(yīng)條件為50℃反應(yīng)15~60分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)的權(quán)利要求制備的DNA分子克隆重組載體。

7.一種DNA分子克隆的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒包含:①權(quán)利要求3中所述克隆反應(yīng)液;②權(quán)利要求1中所述入門載體;③權(quán)利要求1中所述表達(dá)載體。

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