本發(fā)明涉及一種基因，尤其是涉及一種乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的靶向腫瘤重組藥物載體蛋白(Hepatitis B virus like particles，HBc VLPs)基因及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙肝核心蛋白病毒樣顆粒概述病毒樣顆粒是不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白都具有自動(dòng)組裝成VLPs的能力，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上與天然的病毒顆粒相似，具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性。由于VLPs不含有病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有感染性，其中有些已經(jīng)作為疫苗成功應(yīng)用于臨床。VLPs在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合型VLPs并將外源性抗原展示在其表面。

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在1987年被第一次用作外源抗原病毒樣顆粒載體^[1，2]。HBV基因組中的C基因包含兩個(gè)起始密碼子ATG，從第一個(gè)起始密碼子ATG開(kāi)始翻譯則得到比HBcAg多29個(gè)氨基酸的HBeAg；而若從第二個(gè)起始密碼子開(kāi)始翻譯得到的，則是HBcAg。HBeAg和HBcAg大部分氨基酸是相同的，但是由于總體氨基酸數(shù)目種類(lèi)不同，兩種蛋白的構(gòu)象不同，抗原位點(diǎn)不同。用于HBcAg表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)具有多樣化，包括原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等^[3～5]，并且都能達(dá)到較高產(chǎn)量，形成天然顆粒狀結(jié)構(gòu)。

由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生的HBcAg主要有兩種顆粒大小，一種包括180個(gè)亞基(T＝3，T＝Triangulation number)，另外一種包括240個(gè)亞基(T＝4)，部分顆粒中包裹大腸桿菌核酸。每個(gè)形成顆粒的亞基都是由HBcAg單體形成的二聚體，構(gòu)成顆粒外部的刺突。兩個(gè)HBcAg單體通過(guò)二硫鍵形成一個(gè)亞基，每個(gè)HBcAg單體有4個(gè)Cys殘基，包括Cys48、Cys61、Cys107、Cys183。其中Cys107包裹在顆粒內(nèi)部；Cys48部分參與單體間二硫鍵形成，剩下的殘基游離在顆粒表面；而Cys61和Cys183則全部參與單體間或二聚體之間二硫鍵形成，和野生型的HBcAg具有同樣的結(jié)合方式。對(duì)于全長(zhǎng)183個(gè)氨基酸的HBcAg來(lái)說(shuō)，前144個(gè)氨基酸屬于顆粒裝配區(qū)，主要功能和病毒顆粒狀形成有關(guān)。而第145～183個(gè)氨基酸屬于核酸結(jié)合區(qū)富含精氨酸，具有三個(gè)重復(fù)的SPRRR結(jié)構(gòu)，主要作用是結(jié)合病毒核酸并將其包裹至病毒顆粒內(nèi)部對(duì)病毒核酸起到保護(hù)和提供復(fù)制場(chǎng)所的功能。HBcAg氨基酸序列中第78～82個(gè)氨基酸之間是主要免疫區(qū)域(Major Immunodominant Region，MIR)，這個(gè)區(qū)域呈現(xiàn)在顆粒表面刺突的頂部；第127～133個(gè)氨基酸在主要刺突旁邊形成一個(gè)小的刺突，這兩部分為HBcAg表面的主要B細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)。

MIR區(qū)域由于分布在顆粒表面的刺突頂部，具有易于與受體結(jié)合和不影響外源片段自然構(gòu)象的優(yōu)點(diǎn)^[4]。對(duì)于HBcAg單體的N末端和C末端而言，插入片段時(shí)需要考慮是否呈現(xiàn)在顆粒表面、是否影響顆粒結(jié)構(gòu)組裝和插入片段是夠能保持天然構(gòu)象這三方面問(wèn)題。C末端在144個(gè)氨基酸之后插入小片段序列不會(huì)影響顆粒自組裝，但是插入片段的大小對(duì)插入片段是否能正確折疊和是夠能呈現(xiàn)在顆粒表面有很大影響。N末段插入外源序列要保持序列正確構(gòu)象和顆粒表面呈現(xiàn)比較困難，所以對(duì)插入片段大小有嚴(yán)格的限制。用結(jié)構(gòu)比較松散的截短型即前144個(gè)氨基酸形成的顆粒，可以提高N末端插入片段呈現(xiàn)在顆粒表面的可能性^[6]。

參見(jiàn)文獻(xiàn)：

[1]Gilbert R J C,Beales L,Blond D,Simon M N,Lin B Y,Chisari F V,Stuart D I,Rowlands D J.Hepatitis B small surface antigen particles are octahedral[J].Proceedings of the National Acad emy of Sciences of the United States of America,2005,102(41):14783.

[2]Clarke B,Newton S,Carroll A,Francis M,Appleyard G,Syred A,Highfield P,Rowlands D,Brown F.Improved immunogenicity of a peptide epitope after fusion to hepatitis B core protein[J].Nature,1987,330(6146):381-384.

[3]Tan W S,Dyson M R,Murray K.Hepatitis B virus core antigen:enhancement of its produ ction in Escherichia coli,and interaction of the core particles with the viral surface antigen[J].Biol ogical Chemistry,2003,384(3):363-371.

[4]Hirschman S Z,Price P,Garfinkel E,Christman J,Acs G.Expression of cloned hepatitis B virus DNA in human cell cultures[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1980,77(9):5507.

[5]Beesley K,Francis M,Clarke B,Beesley J,Dopping-Hepenstal P,Clare J,Brown F,Roma nos M.Expression in yeast of amino-terminal peptide fusions to hepatitis B core antigen and their i mmunological properties[J].Nature Biotechnology,1990,8(7):644-649.

[6]Zlotnick A,Cheng N,Stahl S,Conway J,Steven A,Wingfield P.Localization of the C ter minus of the assembly domain of hepatitis B virus capsid protein:implications for morphogenesis a nd organization of encapsidated RNA[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1997,94(18):9556.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性的重組藥物載體蛋白基因及其制備方法與應(yīng)用。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性的重組藥物載體蛋白基因，其載體蛋白的表達(dá)基因包含編碼乙肝病毒核心蛋白位氨基酸、編碼靶向腫瘤多肽序列及鏈接肽、編碼疏水性多肽NS5A(1～31aa)兩親的α螺旋、編碼pH敏感的聚組氨酸多肽的基因序列，并通過(guò)基因工程，制備純化得到。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性的重組藥物載體蛋白的基因序列，其基因編碼靶向腫瘤的多肽序列位于乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的第72～92位氨基酸之間的位置；其基因中編碼疏水性多肽NS5A(1～31aa)兩親的α螺旋位于乙肝病毒核心蛋白C端的140～183氨基酸之間；其基因編碼的聚組氨酸的多肽位于疏水性多肽NS5A(1～31aa)蛋白最末端。

所述編碼靶向腫瘤多肽、編碼疏水性多肽、編碼pH敏感的聚組氨酸多肽分子的基因序列中的任意至少兩種與乙肝病毒核心蛋白基因序列進(jìn)行組合。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白，由大腸桿菌BL21(DE3)完成重組蛋白的表達(dá)可溶性嵌合蛋白。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白，其在大腸桿菌表達(dá)的方法包括以下條件：

1)在LB肉湯培養(yǎng)基中10～37℃培養(yǎng)0.5～4h；

2)利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，IPTG濃度為0.1～1mM，培養(yǎng)時(shí)間為4～16h，培養(yǎng)溫度為16～37℃；

3)培養(yǎng)期間搖床轉(zhuǎn)速為120～300r/min。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白藥物的純化方法包括以下步驟：

1)超聲破碎菌體，250W、50Hz超聲持續(xù)時(shí)間1～10s，間隔1～10s；

2)硫酸銨沉淀初純?nèi)诤系鞍祝?0％～50％的飽和硫酸銨溶液進(jìn)行蛋白鹽析；

3)離子交換柱色譜純化，采用DEAE樹(shù)脂柱，流動(dòng)相為10mM Tris-Cl(pH8.0)的緩沖液；

4)分子排阻色譜法純化，得基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白藥物。

在步驟4)中，所述分子排阻色譜法純化可采用Sepharose CL 4B分子篩柱色譜純化，流動(dòng)相為10mM Tris-Cl，150mM NaCL(pH8.0)的緩沖液。

制備的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒聚粒徑均勻、形貌高度均一，解聚自組裝特性，病毒樣顆粒粒徑范圍為30～40nm。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白的解聚條件如下：

解聚緩沖液：50mM Tris-HCl，pH8.0，0～10M尿素；解聚時(shí)間：0.5～4h。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白的重組條件如下：

重組緩沖液1：50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，10％甘油，1％甘氨酸；

重組緩沖液2：50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，1％甘氨酸。

所述通過(guò)所描述病毒樣顆粒解聚再重組過(guò)程進(jìn)行藥物裝載，藥物與解聚的病毒樣顆?；旌显谝黄?，病毒樣顆粒與藥物摩爾比為1︰(50～10000)，調(diào)整溶液pH值至藥物本身pKa，孵育時(shí)間為0.5～4h。

所述基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白可在制備抗腫瘤多肽納米藥物及腫瘤光熱/光動(dòng)力治療藥物中應(yīng)用。

本發(fā)明的抗腫瘤多肽納米藥物的制備方法包括以下步驟：

1)通過(guò)基因合成法獲得具有編碼基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感的重組藥物載體蛋白的基因序列，通過(guò)Xho I/Nde I酶切位點(diǎn)構(gòu)建到表達(dá)載體質(zhì)粒pEt43.1(a)中；

2)使步驟1)得到的載體質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白；

3)將步驟2)收集得到的載體質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白分離純化后，通過(guò)調(diào)控其自組裝過(guò)程，裝載化療藥物，制成抗腫瘤多肽納米藥物。

本發(fā)明提供一種基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白基因及其表達(dá)產(chǎn)物，所述病毒樣顆粒納米藥物包含腫瘤靶向多肽、為提高其載藥量而插入的疏水性多肽、具有pH敏感的聚組氨酸酸響應(yīng)性功能多肽。

本發(fā)明對(duì)乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒進(jìn)行改造，將腫瘤靶向多肽片段展示在顆粒表面以賦予其靶向腫瘤細(xì)胞及組織的能力，在其內(nèi)部插入疏水性多肽以增強(qiáng)其對(duì)疏水性藥物的裝載能力，提高所包載疏水性藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性，減少藥物對(duì)正常組織細(xì)胞的損傷；同時(shí)引入聚組氨酸多肽片段在顆粒內(nèi)部而獲得酸響應(yīng)性功能。所構(gòu)建的基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性重組藥物載體蛋白生物相容性好，穩(wěn)定，提高了對(duì)腫瘤部位的靶向性以及其生物利用度。另外，由于該藥物中含有酸響應(yīng)性功能分子使得所述病毒樣顆粒具有酸響應(yīng)性，在微酸性環(huán)境中，內(nèi)部多聚組氨酸被質(zhì)子化，質(zhì)子內(nèi)流，疏水端之間的正電荷排斥力使自組裝體解聚，在腫瘤組織pH值為酸性的環(huán)境下，快速釋放藥物，達(dá)到較好的腫瘤治療效果。

本發(fā)明的腫瘤靶向多肽為RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的三肽序列，其兩端分別連有的19個(gè)富絲氨酸甘氨酸的連接肽構(gòu)成。位于乙肝病毒核心蛋白的主要免疫區(qū)部位，此區(qū)域是暴露在病毒樣顆粒的表面，因此有利于腫瘤靶向RGD多肽分子與腫瘤細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)整合素受體結(jié)合，從而發(fā)揮特異的腫瘤靶向作用。

本發(fā)明所述疏水性多肽NS5A(1-33aa)插入到顆粒的C端，其C段主要包埋在顆粒內(nèi)部，因此可以形成內(nèi)部疏水的空腔結(jié)構(gòu)，再通過(guò)乙肝核心蛋白的解聚-重組的過(guò)程將治療性的藥物裝載到顆粒內(nèi)部。

本發(fā)明所述酸響應(yīng)的酸性pH值是相對(duì)于人體內(nèi)正常組織內(nèi)的pH值而言的，人體正常組織的pH值為7.4，而腫瘤細(xì)胞的pH值為5～7.2，因此相對(duì)于人體正常組織來(lái)說(shuō)，腫瘤組織部位的pH環(huán)境為弱酸性。

酸響應(yīng)性功能分子在pH值為5～6時(shí)，可以被質(zhì)子化，導(dǎo)致多顆粒內(nèi)部聚組氨酸質(zhì)子化，之間產(chǎn)生正電荷排斥力，使自組裝納米顆粒形態(tài)被破壞。

本發(fā)明所述乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感、具有自組裝特性的重組藥物載體蛋白中，所述具有腫瘤靶向的多肽、疏水性多肽、聚組氨酸多肽分子中的任意一種或至少兩種與乙肝病毒核心蛋白片段組合。

本發(fā)明所述一種基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感的重組藥物載體蛋白的粒徑為30～40nm。該范圍內(nèi)的納米顆粒穩(wěn)定，具有腫瘤富集作用，可以提高藥物的靶向性以及藥物的生物利用度。

所述編碼靶向腫瘤多肽兩端連接多肽為含有5～30個(gè)絲氨酸或甘氨酸。

一種基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感的重組藥物載體蛋白的表達(dá)基因片段通過(guò)合成實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明所述的基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感的重組藥物載體蛋白克服了病毒樣顆粒靶向腫瘤差載，藥量偏低的缺點(diǎn)，提供一種具有腫瘤部位弱酸環(huán)境響應(yīng)性、生物相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、腫瘤靶向性好、安全性高易于大規(guī)模生產(chǎn)、成本低和生物利用度高的多肽納米藥物載體。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的重組病毒樣顆粒生物相容性好，毒副作用低，具有酸性pH響應(yīng)性與自組裝特性，納米材料本身即為蛋白類(lèi)，易于在體內(nèi)生物降解。本發(fā)明的基于乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒靶向腫瘤多肽納米藥物載體可通過(guò)主動(dòng)靶向性富集于腫瘤部位，在腫瘤部位的弱酸性環(huán)境中，納米藥物的納米粒子形態(tài)解聚，裝載藥物被有效釋放，以達(dá)到抗腫瘤治療的作用，提高了抗腫瘤藥物的生物利用度。本發(fā)明的抗腫瘤多肽納米藥物載體可以在大腸桿菌中大量生產(chǎn)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1與實(shí)施例2中重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的SDS-PAGE電泳分析圖；

圖2為實(shí)施例1重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的TEM結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2中重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的TEM結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例1與實(shí)施例2中重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的水合半徑結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例1中重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒裝載藥物阿霉素的液相色譜圖；

圖6為實(shí)施例2中重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒裝載藥物阿霉素的液相色譜圖；

圖7為實(shí)施例3中對(duì)實(shí)施例1與實(shí)施例2中制備的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒進(jìn)行酸性響應(yīng)性測(cè)定的結(jié)果圖；

圖8為實(shí)施例3中對(duì)實(shí)施例1與實(shí)施例2中制備的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒在PBS緩沖液中粒徑隨時(shí)間變化圖；

圖9為實(shí)施例4中測(cè)定的實(shí)施例1實(shí)施例1與實(shí)施例2中制備的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒在體外靶向腫瘤細(xì)胞效果圖；

圖10為實(shí)施例5中測(cè)定的實(shí)施例1實(shí)施例1與實(shí)施例2中制備的載有阿霉素的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果圖；

圖11為實(shí)施例6中測(cè)定的裝載有吲哚菁綠的實(shí)施例2中的重組乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的體外808激光照射升溫曲線。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

本發(fā)明的目的在于提供一種基于乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒的靶向腫瘤藥物載體的設(shè)計(jì)及制備方法，通過(guò)基因改造，在截?cái)嗟囊腋魏诵牡鞍證端144位氨基酸后插入來(lái)源于丙肝病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A(1～31aa)作為疏水性多肽，同時(shí)在其尾部插入6個(gè)組氨酸作為酸敏感多肽，在大腸桿菌表達(dá)并最終分離純化，得到具有形貌規(guī)則、粒徑30～40nm的單分散病毒樣顆粒。通過(guò)其自身的自組裝過(guò)程裝載化療藥物用于腫瘤靶向治療。

首先通過(guò)基因合成獲得目的基因片段，利用Xho I/Nde I酶切位點(diǎn)插入到表達(dá)載體質(zhì)粒中，之后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.所述融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

1)挑取含表達(dá)載體的BL21(DE3)單菌落，在LB培養(yǎng)基(含100μg/mL氨芐青霉素)中37℃，255rpm培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；

2)菌液與培養(yǎng)基按1:1000的比例稀釋?zhuān)?7℃，255rpm培養(yǎng)過(guò)夜，使其OD600值達(dá)到0.5～0.6；按照1︰1將菌種稀釋至新鮮培養(yǎng)基，37℃，255rpm培養(yǎng)2h；

3)37℃溫度下誘導(dǎo)，IPTG終濃度為1mM；

4)誘導(dǎo)4h后，取出1mL菌液，12,000rpm離心1min后去上清，加入100μL PBS重懸菌體，樣品用12％SDS-PAGE凝膠電泳分析。

2.硫酸銨沉淀初純?nèi)诤系鞍?/p>

1)將誘導(dǎo)結(jié)束的菌液以4000rpm離心10min后收集菌體，用10mM Tris、0.5％Triton pH8.0緩沖溶液將菌體吹起。

2)用超聲破碎的方法將菌體破碎，功率300W共超聲30min將菌體破碎，此時(shí)菌液成粘稠半透明狀，12000rpm離心10min，收集上清(目的蛋白在上清液中，為可溶性蛋白)。

3)將上清液分裝在1.5ml離心管中，每管500μL，分別用10％、20％、30％、40％、50％的飽和硫酸銨溶液進(jìn)行蛋白鹽析，在4℃下鹽析30min，12,000rpm離心10min，收集沉淀，每個(gè)濃度的沉淀取樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白分布。

3.DEAE離子交換色譜純化

1)基液平衡柱子：用10倍柱體積含10mM Tris-Cl(pH8.0)的基液沖洗柱子，至流出液的pH與基液pH一致。

2)上樣：將收集到的樣品即硫酸銨沉淀透析后的蛋白粗提取物以3mL/min的流速上樣。

3)上樣洗脫：用5個(gè)柱體積的基液沖洗層析柱，至紫外檢測(cè)儀的示數(shù)重新回到基線。

4)洗脫液Ⅰ洗脫：用5倍柱體積的洗脫液Ⅰ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、50mM NaCl)沖洗柱子，收集洗脫峰。

5)洗脫液Ⅱ洗脫：用5倍柱體積的洗脫液Ⅱ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、100mM NaCl)沖洗柱子，收集洗脫峰。

6)洗脫液Ⅲ洗脫：用5倍柱體積的洗脫液Ⅲ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、200mM NaCl)沖洗柱子，收集洗脫峰。

7)洗脫液Ⅲ洗脫：用5倍柱體積的洗脫液Ⅳ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl)沖洗柱子，收集洗脫峰。

8)洗脫液Ⅲ洗脫：用5倍柱體積的洗脫液Ⅳ(含10mM Tris-Cl(pH8.0)、400mM NaCl)沖洗柱子，收集洗脫峰。

4.融合蛋白分子篩Sepharose CL 4B純化

使柱子中的液體緩慢下降，待液面降到凝膠界面時(shí)，將樣品滴加到膠面上，不可使液面被攪起，待其沉降到膠面以下，補(bǔ)加脫氣的去離子水，緩慢加入，直至將柱子補(bǔ)滿，連上進(jìn)口適配器；以恒定的流速1.5mL/min過(guò)柱。2mL/管收集流出液。

5.蛋白透析及濃縮

1)將盛有蛋白溶液的透析袋放入預(yù)冷好的透析液中，放在4℃冰箱進(jìn)行透析；

2)整個(gè)透析過(guò)程換4次透析液，直至透析完全；

3)將透析完全的蛋白溶液放入新的大燒杯中，加聚乙二醇粉末覆蓋在透析袋上，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，將燒杯置于4℃冰箱進(jìn)行濃縮；

4)在濃縮過(guò)程中，少量多次加入干燥的聚乙二醇粉末，以增加濃縮速度，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的濃縮體積；

5)濃縮結(jié)束后，用蒸餾水將透析袋沖洗干凈，將濃縮的蛋白溶液取出，用BCA法定量測(cè)定蛋白濃度。

6.藥物裝載

1)病毒樣顆粒的解離

解離液配制：50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，8.0M的尿素(urea)。取10μL病毒樣顆粒(～10mg/mL)與上述配制好的解離液在4℃下孵育3h。

2)病毒樣顆粒的重組

重組緩沖液1︰50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1％甘氨酸；重組緩沖液2︰50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl，1％甘氨酸。將解離后的病毒顆粒溶液移入分子量為8000～14000Da的透析袋中并置于100mL重組緩沖液1中并在4℃下過(guò)夜透析，12h后更換為重組緩沖液2。透析時(shí)間總共為48h，期間更換緩沖液2次。

3)藥物裝載

取1mL病毒樣顆粒(～1mg/mL)與預(yù)先配制好的解離液在4℃下孵育2.5h，溶液總體積為10mL。此時(shí)向上述解離液中加入500mg阿霉素，伴隨輕微震蕩，所得混合溶液繼續(xù)共培養(yǎng)30min。之后，將其移至分子量為8000～14000Da的透析袋中，首先置于重組緩沖液1中并在4℃下過(guò)夜透析，12h后更換為重組緩沖液2。透析時(shí)間總共為48h，期間更換緩沖液2次。所得裝載有藥物的病毒樣顆粒保存于-20℃下保。

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證了，制得蛋白單體分子量(圖1)。透射電子顯微鏡證明了所構(gòu)建的病毒樣顆?？捎行ЫM裝成形貌均一的單分散顆粒，如圖2。激光粒度儀進(jìn)一步驗(yàn)證了其粒徑為30～40nm的顆粒結(jié)構(gòu)，如圖4。高效相色譜分析(圖5)證實(shí)了本實(shí)施例得到病毒樣顆粒可有效裝載化療藥物阿霉素。

其核苷酸序列為：

atgGACATCGACCACTACAAAGAATTCGGTGCTTCCGTTGAACTGCTGTCCTTCCTGCCGTCCGACTTCTTCCCGTCCATCCGTGACCTGCTGGACACTGCTTCCGCTCTGTACCGTGAAGCTCTGGAATCCCCGGAACACTGCTCCCCGCACCACACTGCTCTGCGTCAGGCTATCCTGTGCTGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACTTGGGTTGGTTCCAACCTGGAAGACCCGGCTTCCCGTGAACTGGTTGTTGGTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCGTCAGATCCTGTGGTTCCACATCTCCTGCCTGACTTTCGGTCGTGAAACTGTTCTGGAATACCTGGTTTCCTTCGGTGTTTGGATTCGTACTCCGCCGGCTTACCGTCCGCCGAACGCTCCGATCCTGTCCACTCTGCCGGCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGCTGAGCGATTTTAAGACCTGGCTGAAGGCCAAGCTCATGCCAACCATGCACCACCACCACCACCAC

其編碼的氨基酸序列為：

MDIDHYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDPASRELVVGYVNVNMGLKIRQILWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPAGSWLRDIWDWICEVLSDFKTWLKAKLMPTMHHHHHH

實(shí)施例2

在本實(shí)施例中，在原有的實(shí)施例1的基礎(chǔ)之上，在其主要免疫區(qū)72～82位之間插入腫瘤靶向多肽序列。通過(guò)與實(shí)施例1相同的表達(dá)純化方法以及步驟，實(shí)現(xiàn)了針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面過(guò)量表達(dá)的整合素受體高親和力結(jié)合的腫瘤主動(dòng)靶向性。經(jīng)與實(shí)施例1相同的自組裝過(guò)程裝載抗腫瘤藥物阿霉素，得到抗腫瘤多肽納米藥物體系。

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳手段證實(shí)了本實(shí)施例得到的病毒樣顆粒預(yù)期分子量(圖1)。

利用透射電鏡和激光粒度儀對(duì)得到的病毒樣顆粒進(jìn)行形態(tài)以及粒徑表征(圖3)，結(jié)果表明制備得到的病毒樣顆粒呈球形，顆粒大小較均一，水合粒徑分布為30～40nm(圖4)，平均粒徑約為36.5±2.1nm。

圖6展示了裝載阿霉素后實(shí)施例2的高效液相色譜結(jié)果。

其核苷酸序列為：

atgGACATCGACCACTACAAAGAATTCGGTGCTTCCGTTGAACTGCTGTCCTTCCTGCCGTCCGACTTCTTCCCGTCCATCCGTGACCTGCTGGACACTGCTTCCGCTCTGTACCGTGAAGCTCTGGAATCCCCGGAACACTGCTCCCCGCACCACACTGCTCTGCGTCAGGCTATCCTGTGCTGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACTTGGGTTGGTTCCAACCTGGAAGACGGTACCTCCGGTTCCTCCGGTTCCGGTTCCGGTGGTTCCGGTTCCGGTGGTGGTGGTCGAGGTGACGGTGGTGGTGGTTCCGGTTCCGGTGGTTCCGGTTCCGGTTCCTCCGGTTCCACCGGTTCCCGTGAACTGGTTGTTGGTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCGTCAGATCCTGTGGTTCCACATCTCCTGCCTGACTTTCGGTCGTGAAACTGTTCTGGAATACCTGGTTTCCTTCGGTGTTTGGATTCGTACTCCGCCGGCTTACCGTCCGCCGAACGCTCCGATCCTGTCCACTCTGCCGGCCGGTTCCTGGCTAAGGGACATCTGGGACTGGATATGCGAGGTGCTGAGCGATTTTAAGACCTGGCTGAAGGCCAAGCTCATGCCAACCATGCACCACCACCACCACCAC*

其編碼多肽的氨基酸序列為：

MDIDHYKEFGASVELLSFLPSDFFPSIRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMNLATWVGSNLEDGTSGSSGSGSGGSGSGGGGRGDGGGGSGSGGSGSGSSGSTGSRELVVGYVNVNMGLKIRQILWFHISCLTFGRETVLEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPAGSWLRDIWDWICEVLSDFKTWLKAKLMPTMHHHHHH

實(shí)施例3

本實(shí)施例目的在于測(cè)定基于乙肝病毒核心蛋白病毒樣顆粒在微酸性溶液中的粒徑。

將實(shí)施例1與實(shí)施例2中得到的病毒樣顆粒與不同pH值(8.0、7.4、6.4、5.8、5、4)的磷酸鹽緩沖溶液共孵育12h，采用激光粒度儀測(cè)定其水合粒徑。如圖3所示，在pH小于等于5時(shí)，所制備病毒樣顆粒粒徑發(fā)生明顯變大，超過(guò)100nm(圖7)。而在生理pH條件下，病毒樣顆粒的粒徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化(圖8)。這說(shuō)明在酸性溶液中，所制備的病毒樣顆粒不再是納米球狀，而是由于其內(nèi)部質(zhì)子化，使得納米球結(jié)構(gòu)產(chǎn)生排斥力，導(dǎo)致其發(fā)生不可逆解聚。

實(shí)施例4

本實(shí)施例目的在于測(cè)定在體外基于乙肝核心蛋白病毒樣顆粒的腫瘤靶向、pH敏感的重組藥物載體蛋白在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性。

將U87MG細(xì)胞以5×10⁵cells/孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，孵育24h待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，棄去舊的培養(yǎng)液，給予經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋實(shí)施例1及實(shí)施例2中的載有阿霉素的病毒樣顆粒。阿霉素濃度為5μg/mL，分別孵育0.5h、1h和2h。孵育結(jié)束后，棄去舊培養(yǎng)液，用冰冷的PBS沖洗3遍。每孔加入100μL胰酶，終止消化后收集細(xì)胞，離心，棄去上液，加入500μL PBS分散細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀測(cè)定。如圖9所示，實(shí)施例2重組病毒樣顆粒更容易被腫瘤細(xì)胞(U87Mg)攝取。

實(shí)施例5

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG細(xì)胞，以7×10³個(gè)/孔接種于96孔板，37℃培養(yǎng)24h后，分別加入100μL的實(shí)施例1及實(shí)施例2中載藥重組病毒樣顆粒，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。置培養(yǎng)箱中孵育48h后，吸去含藥培養(yǎng)液，每孔加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL)，繼續(xù)孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加入100μL的DMSO，振蕩2min以溶解藍(lán)紫色結(jié)晶物，最后用酶標(biāo)儀在492nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度值(OD)，并采用下面的公式計(jì)算細(xì)胞存活率(如圖10)。

實(shí)施例6

本實(shí)施例中，通過(guò)實(shí)施例2包載光敏劑吲哚菁綠用于腫瘤光熱/光動(dòng)力治療。實(shí)施例2中的病毒樣顆粒在2.5M尿素條件下使其解聚，之后與光敏劑吲哚菁綠共孵育4～8h后，于重組緩沖液透析48h，期間更換兩次透析液。最終得到載有吲哚菁綠的重組乙肝病毒核心蛋白。在功率為1W的808激光照射0～300s，載有吲哚菁綠的實(shí)施例1可以升高到45℃左右，具有優(yōu)良的光熱性能(如圖11)，可應(yīng)用于腫瘤光熱及光動(dòng)力治療。

本發(fā)明克服傳統(tǒng)納米載體腫瘤靶向性、生物相容性差、免疫原性強(qiáng)等諸多缺點(diǎn)。本發(fā)明同時(shí)也解決了傳統(tǒng)化療藥物用藥劑量大、毒性強(qiáng)、患者耐受性差等問(wèn)題。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單、適宜大規(guī)模生產(chǎn)、對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性，載有化療藥物后能夠有效抑制腫瘤，也可裝載光敏劑進(jìn)行腫瘤光熱共動(dòng)力治療。

序列表

<110>廈門(mén)大學(xué)

<120>重組藥物載體蛋白基因及其制備方法與應(yīng)用

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1（實(shí)施例1 DNA序列）

<211> 543

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atggacatcg accactacaa agaattcggt gcttccgttg aactgctgtc cttcctgccg 60

tccgacttct tcccgtccat ccgtgacctg ctggacactg cttccgctct gtaccgtgaa 120

gctctggaat ccccggaaca ctgctccccg caccacactg ctctgcgtca ggctatcctg 180

tgctggggtg aactgatgaa cctggctact tgggttggtt ccaacctgga agacccggct 240

tcccgtgaac tggttgttgg ttacgttaac gttaacatgg gtctgaaaat ccgtcagatc 300

ctgtggttcc acatctcctg cctgactttc ggtcgtgaaa ctgttctgga atacctggtt 360

tccttcggtg tttggattcg tactccgccg gcttaccgtc cgccgaacgc tccgatcctg 420

tccactctgc cggccggttc ctggctaagg gacatctggg actggatatg cgaggtgctg 480

agcgatttta agacctggct gaaggccaag ctcatgccaa ccatgcacca ccaccaccac 540

cac 543

<210> 2（實(shí)施例2 DNA序列）

<211> 660

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

atggacatcg accactacaa agaattcggt gcttccgttg aactgctgtc cttcctgccg 60

tccgacttct tcccgtccat ccgtgacctg ctggacactg cttccgctct gtaccgtgaa 120

gctctggaat ccccggaaca ctgctccccg caccacactg ctctgcgtca ggctatcctg 180

tgctggggtg aactgatgaa cctggctact tgggttggtt ccaacctgga agacggtacc 240

tccggttcct ccggttccgg ttccggtggt tccggttccg gtggtggtgg tcgaggtgac 300

ggtggtggtg gttccggttc cggtggttcc ggttccggtt cctccggttc caccggttcc 360

cgtgaactgg ttgttggtta cgttaacgtt aacatgggtc tgaaaatccg tcagatcctg 420

tggttccaca tctcctgcct gactttcggt cgtgaaactg ttctggaata cctggtttcc 480

ttcggtgttt ggattcgtac tccgccggct taccgtccgc cgaacgctcc gatcctgtcc 540

actctgccgg ccggttcctg gctaagggac atctgggact ggatatgcga ggtgctgagc 600

gattttaaga cctggctgaa ggccaagctc atgccaacca tgcaccacca ccaccaccac 660

<210> 3（實(shí)施例1蛋白序列）

<211> 181

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 3

Met Asp Ile Asp His Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Ala Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu

145 150 155 160

Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala Lys Leu Met Pro Thr Met His

165 170 175

His His His His His

180

<210> 4（實(shí)施例2蛋白序列）

<211> 220

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 4

Met Asp Ile Asp His Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Thr

65 70 75 80

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly

85 90 95

Gly Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser

100 105 110

Gly Ser Ser Gly Ser Thr Gly Ser Arg Glu Leu Val Val Gly Tyr Val

115 120 125

Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Ile Leu Trp Phe His Ile

130 135 140

Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser

145 150 155 160

Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala

165 170 175

Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Ala Gly Ser Trp Leu Arg Asp Ile Trp

180 185 190

Asp Trp Ile Cys Glu Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Lys Ala

195 200 205

Lys Leu Met Pro Thr Met His His His His His His

210 215 220