本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CcdB致死基因和SmaI酶切位點(diǎn)的酶切連接共體系同時(shí)進(jìn)行的方法。

背景技術(shù)：

自1970年代初基因克隆技術(shù)問世至今，分子克隆已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室最重要及最基本實(shí)驗(yàn)操作之一。通過體外PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到的目的基因片段往往需要先連接至克隆載體，為序列測(cè)定、蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建等后續(xù)分子生物學(xué)操作提供便利。相比于酶切PCR片段后直接連入目的載體，將PCR片段首先連入商業(yè)化的T-A克隆載體或平末端克隆載體顯得簡(jiǎn)單、快速和高效。

pGEM-T載體系統(tǒng)是目前最為廣泛使用的T-A克隆載體，由Promega公司生產(chǎn)。它的原理為pGEM-T載體在其5’端具有一個(gè)突出的dT(脫氧胸苷酸)，可以和經(jīng)絕大部分Taq DNA聚合酶所擴(kuò)增的PCR片段(其3’端被非特異性添加一個(gè)dA(脫氧腺苷酸))互補(bǔ)，在T4 DNA連接酶的輔助下，使PCR片段連接到pGEMT克隆載體中。然而，由于普通的Taq DNA聚合酶缺少3'到5'的核酸外切酶校正活性，導(dǎo)致Taq DNA聚合酶的保真性不高，錯(cuò)配率達(dá)到2.1X10^-4(Dunning et al.1988；Keohavong and Thilly 1989；McInerney et al.2014)，對(duì)后續(xù)的亞克隆、蛋白表達(dá)純化，SNP分析及高通量測(cè)序等實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性造成了極大的影響。

高保真DNA聚合酶的開發(fā)有效的彌補(bǔ)了Taq DNA聚合酶錯(cuò)賠率高的不足，目前常用的高保真DNA聚合酶有Phusion-HF(Thermo Scientific)、Q5(NEB)、KOD(TOYOBO)、PrimeSTAR(Takara)及Pfu DNA聚合酶(Promega)等，該類DNA聚合酶具有3'到5'的核酸外切酶校正活性，能夠切除PCR延伸反應(yīng)中錯(cuò)配到3'端的堿基，具有極低的堿基錯(cuò)配率，從而保證了PCR反應(yīng)的高保真性。為了確保擴(kuò)增片段的精準(zhǔn)性，研究者通常選擇高保真DNA聚合酶作為基因擴(kuò)增的首選DNA聚合酶。經(jīng)高保真DNA聚合酶擴(kuò)增得到的PCR片段均為平末端，無法直接用于T-A克隆，需將平末端PCR片段進(jìn)行加A處理后才能連入T載體，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而商業(yè)化的平末端載體可以直接連接平末端PCR片段，從而深受研究者的喜愛。

為了有效的鑒定插入PCR片段的重組質(zhì)粒，眾多的篩選策略被提出，其中以藍(lán)白斑篩選應(yīng)用最為廣泛。藍(lán)白斑篩選以缺失LacZΔM15的大腸桿菌為宿主細(xì)胞，因外源質(zhì)粒本身攜帶LacZα基因并帶有一系列的多克隆位點(diǎn)，空載體情況下，形成“α-互補(bǔ)”，在IPTG的誘導(dǎo)下，大腸桿菌表達(dá)β－半乳糖苷酶活性，分解X-gal從而形成藍(lán)色物質(zhì)；反之當(dāng)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)被外源片段插入后，LacZα基因的正常表達(dá)受到破壞，菌落顯示為白色(Slilaty and Lebel 1998)。然而這種方法在實(shí)際操作中往往存在假陰性(含有插入片段的藍(lán)色菌落)和假陽性(未含有插入片段的白色菌落)的問題(Slilaty and Lebel 1998)，且對(duì)IPTG和X-gal的需求加重了實(shí)驗(yàn)成本，此外顯示反應(yīng)常常需要額外的時(shí)間(Cheong et al.2009)。為了克服藍(lán)白斑篩選的不足，一種新型的通過阻斷致死基因ccdB表達(dá)來進(jìn)行陽性克隆篩選的技術(shù)被開發(fā)出來(Bernard et al.1994)。

Ccd(control of cell death)系統(tǒng)位于細(xì)菌的F質(zhì)粒上，是研究最為深入的一種毒素-抗毒素系統(tǒng)(toxin-antitoxin system，TA系統(tǒng))(Mruk and Kobayashi 2014)。該系統(tǒng)編碼兩個(gè)蛋白，分別是由101個(gè)氨基酸組成的CcdB毒性蛋白和由72個(gè)氨基酸組成的CcdA解毒蛋白。CcdB通過阻斷細(xì)菌促旋酶-DNA復(fù)合體的活性，導(dǎo)致DNA復(fù)制的終止，從而影響基因的表達(dá)來發(fā)揮致死功能。抗毒素CcdA通過緊密結(jié)合CcdB形成蛋白復(fù)合體來解除毒性。Bernard和Couturier發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大腸桿菌的GyrA蛋白上的第462位的精氨酸(Arg)突變?yōu)榘腚装彼?Cys)后，大腸桿菌表現(xiàn)出對(duì)CcdB的毒性耐受，即CcdB不致死(Bernard and Couturier 1992)?；诖怂悸?，大量的以ccdB致死基因作為篩選的質(zhì)體載體被構(gòu)建出來。其原理為將插入ccdB致死基因的重組質(zhì)粒在突變的大腸桿菌中保存(例如DB3.1大腸桿菌)，當(dāng)外源PCR片段插入重組質(zhì)粒的ccdB基因中，導(dǎo)致ccdB基因讀碼框改變，喪失了對(duì)普通大腸桿菌(例如DH5α等)的毒性，而沒有插入外源PCR片段的重組質(zhì)粒ccdB發(fā)揮毒性作用，從而達(dá)到陽性篩選的目的。

目前ccdB致死基因已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建T-A克隆，平末端克隆等克隆載體(Hu et al.2010；Weibel et al.2013)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于ccdB致死基因和SmaI酶切位點(diǎn)的酶切連接共體系同時(shí)進(jìn)行的方法，該方法是一套快速、高效、低背景的克隆方法，無需對(duì)ccdB重組載體及PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切及膠回收等步驟，可以直接將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體，效率高，整個(gè)時(shí)間控制在20分鐘以內(nèi)，極大地減少了實(shí)驗(yàn)成本，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，該克隆體系具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的基于ccdB致死基因和SmaI酶切位點(diǎn)的酶切連接共體系同時(shí)進(jìn)行的方法，其特征在于，包括以下步驟：

將ccdB基因插入載體pUC18的EcoRI和HindIII位點(diǎn)之間，得到pUC18-ccdB質(zhì)粒，然后將pUC18-ccdB質(zhì)粒、DNA片段、限制性內(nèi)切酶SmaI、T4連接酶、T4連接酶buffer和水混合形成反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)，由此得到連接產(chǎn)物。

連接產(chǎn)物可以轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物的陽性克隆。

優(yōu)選是每20μl反應(yīng)體系含有1μg pUC18-ccdB、200ng DNA片段，加入0.5μl限制性酶切酶SmaI和1μl T4連接酶，2μl T4連接酶buffer，最終補(bǔ)水至20μl。

本發(fā)明以常見的pUC18載體為骨架載體，結(jié)合ccdB致死基因的篩選機(jī)制以及ccdB致死基因內(nèi)部含有的SmaI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建出一套快速、高效、低背景的克隆方法，無需對(duì)ccdB重組載體及PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切及膠回收等步驟，可以直接將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體，效率高，整個(gè)時(shí)間控制在20分鐘以內(nèi)，極大地減少了實(shí)驗(yàn)成本，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度，該克隆體系具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明：

圖1是pUC18-ccdB載體構(gòu)建示意圖；

圖2是ccdB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，M:DNA marke，1-4：ccdB PCR片段；

圖3是重組質(zhì)粒pUC18-ccdB陽性克隆篩選，M:DNA marke，1-14：菌落PCR篩選陽性克??；

圖4是pUC18-ccdB質(zhì)粒在DH5α和DB 3.1的致死性比較；

圖5是外源片段的連接轉(zhuǎn)化效率，-PCR,連接體系中沒有加入PCR片段。+PCR，連接體系中加入PCR片段；

圖6是外源PCR片段連入的重組質(zhì)粒菌落PCR陽性篩選，1-18：外源PCR片段插入的重組質(zhì)粒PCR檢測(cè)。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

1材料和方法

1.1材料、試劑與菌株

含有ccdB致死基因(其Genbank登錄號(hào)為EU496090.1)的Reading Frame Cassette B質(zhì)粒購(gòu)自Invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、SmaI購(gòu)自NEB公司，高保真DNA聚合酶Phusion-HF，T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司，骨架載體為pUC18。大腸桿菌菌株E.coli DH 5α和DB 3.1由本實(shí)驗(yàn)室保存。引物交由華大生物公司合成。

1.2方法

1.2.1 ccdB基因的擴(kuò)增

以Reading Frame Cassette B為模板，使用Phusion DNA polymerase及表1中引物ccdB-F、ccdB-R擴(kuò)增ccdB致死片段，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30s，98℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸15s，30個(gè)循環(huán)，終末72℃延伸10min。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并切膠回收所需ccdB片段。

表1引物及序列

1.2.2載體pUC18-ccdB的構(gòu)建

分別取1μg載體pUC18和200ng的ccdB回收片段，加入EcoRI和HindIII后按照Thermo Scientific FastDigest試劑的說明書，進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，時(shí)間為30min。酶切完成后，進(jìn)行凝膠電泳，分別對(duì)酶切片段進(jìn)行回收?；厥盏馁|(zhì)粒片段和ccdB片段，按照1:5的物質(zhì)的量之比混合，加入1μl T4連接酶，2μl連接buffer，最終補(bǔ)水至20μl，室溫反應(yīng)10min后，取10μl連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至100μl的DB3.1感受態(tài)中。37℃，過夜培養(yǎng)。使用ccdB-F、ccdB-R進(jìn)行陽性克隆鑒定，挑選有陽性條帶的單菌落，搖菌，提質(zhì)粒，送樣測(cè)序，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pUC18-ccdB。

1.2.3 pUC18-ccdB致死檢測(cè)

為驗(yàn)證pUC18-ccdB質(zhì)粒的致死效率，將測(cè)序正確的pUC-ccdB質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DB 3.1中，37℃培養(yǎng)過夜，次日觀察大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)，檢測(cè)質(zhì)粒的致死性。

1.2.4 PCR片段插入含有pUC18-ccdB重組質(zhì)粒的快速高效體系

分別取1μg構(gòu)建好的pUC18-ccdB和200ng的PCR片段(擴(kuò)增自水稻基因組，約700bp)，加入0.5μl限制性酶切酶SmaI和1μl T4連接酶，2μl T4連接酶buffer，最終補(bǔ)水至20μl，室溫反應(yīng)10min后，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至100μl的DH5α感受態(tài)中。37℃，過夜培養(yǎng)。使用M13-F、M13-R引物進(jìn)行陽性克隆鑒定，挑選有陽性條帶的單菌落，搖菌，提質(zhì)粒，送樣測(cè)序，檢測(cè)連接片段的正確性。

2、結(jié)果與分析：

2.1重組質(zhì)粒pUC18-ccdB的鑒定與分析

載體pUC18-ccdB的構(gòu)建示意圖見圖1。ccdB的高保真PCR擴(kuò)增片段電泳圖見圖2。將ccdB PCR片段膠回收及雙酶切后和pUC18載體雙酶切后膠回收片段進(jìn)行連接，連接完成后轉(zhuǎn)化DB3.1大腸桿菌。為確定陽性克隆效率，使用ccdB-F和ccdB-R引物隨機(jī)挑選14個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，在隨機(jī)挑選的14個(gè)單菌落中，有13個(gè)陽性菌落，任意選擇3個(gè)菌落測(cè)序，ccdB基因正確的插入了pUC18的EcoRI和HindIII位點(diǎn)之間。

為了確定pUC18-ccdB在大腸桿菌菌株DH5α上的致死能力，將構(gòu)建好的pUC18-ccdB質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DB3.1和DH5α大腸桿菌中測(cè)定其致死效率，過夜培養(yǎng)后，大腸桿菌的生長(zhǎng)結(jié)果如圖4所示。轉(zhuǎn)化DB3.1菌株的LB平板布滿大量單菌落，而轉(zhuǎn)化DH5α菌株的LB平板上只生長(zhǎng)極少數(shù)的幾個(gè)單菌落。說明pUC18-ccdB質(zhì)粒對(duì)不耐受ccdB毒性蛋白的大腸桿菌DH5α菌株致死效果明顯，可以作為后續(xù)陽性篩選的克隆載體使用。

1.2外源片段快速高效連接驗(yàn)證

將PCR片段及pUC18-ccdB混合后加入T4連接酶反應(yīng)體系及0.5μl SmaI限制性內(nèi)切酶，室溫反應(yīng)10min后，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，過夜培養(yǎng)，連接效率見圖5。隨機(jī)挑選取18個(gè)單菌落，用M13F，M13R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。挑選的單菌落中，有18個(gè)顯示為陽性克隆，如圖6所示。從其中各隨機(jī)選擇5個(gè)陽性菌落進(jìn)行搖菌后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已知基因序列一致，說明該P(yáng)CR片段成功插入載體中，陽性選擇率極高。

3討論

目前廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室的分子克隆商業(yè)載體分為兩大類，一類是T-A克隆載體，另一類是平末端克隆載體。經(jīng)Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的PCR片段末尾帶有一個(gè)突出的A，可以完美兼容T-A克隆載體，但由于Taq DNA聚合酶的保真性較差，部分研究者往往先采用高保真PCR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，再使用加A試劑盒對(duì)經(jīng)高保真酶擴(kuò)增的平末端PCR片段加A后連入T-A載體，但受試劑盒加A效率的影響及額外的工作時(shí)間，大部分研究者偏好直接使用平末端克隆載體對(duì)經(jīng)高保真聚合酶PCR片段進(jìn)行連接。

商業(yè)化的平末端克隆載體存在價(jià)格昂貴、產(chǎn)品質(zhì)量批次波動(dòng)及一次性使用等不足之處。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期進(jìn)行大規(guī)模分子克隆時(shí)，商業(yè)化載體的價(jià)格問題往往也是研究者考慮的因素之一。若實(shí)驗(yàn)室能夠自行制備出快速簡(jiǎn)潔高效且可永久保存的克隆載體，會(huì)極大地節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。

CcdB致死基因已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建平末端克隆載體(Hu et al.2010；Weibel et al.2013)。本研究將ccdB基因插入最常用的pUC18載體，成功構(gòu)建出pUC18-ccdB重組載體，利用ccdB基因?qū)Υ竽c桿菌DH5α的致死能力，排除了載體自連對(duì)后續(xù)陽性克隆鑒定等實(shí)驗(yàn)的影響。利用pUC18-ccdB重組載體能夠在大腸桿菌DB3.1中復(fù)制的特點(diǎn)，可以在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)大量擴(kuò)增提取該質(zhì)粒。此外，本研究進(jìn)一步利用ccdB致死基因中含有的SmaI獨(dú)特的堿基識(shí)別位點(diǎn)，經(jīng)SmaI酶切后的pUC18-ccdB為平末端載體，可以直接連接經(jīng)高保真酶擴(kuò)增的PCR片段。本研究最大的創(chuàng)新點(diǎn)在于將pUC18-ccdB重組載體和PCR片段混合后加入T4連接酶及SmaI限制性內(nèi)切酶，在T4連接酶體系中室溫反應(yīng)10min，pUC18-ccdB載體在混合體系中發(fā)生邊酶切邊連接，酶切pUC18-ccdB產(chǎn)生的平末端線性分子直接連接外源PCR產(chǎn)物，連接完成后含有外源PCR片段的重組載體喪失了SmaI的酶切位點(diǎn)，不受SmaI內(nèi)切酶的影響，未酶切連接的pUC18-ccdB載體在轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中由于ccdB發(fā)揮功能而死掉。本實(shí)驗(yàn)對(duì)0.6Kb外源片段在該系統(tǒng)連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行了菌落PCR及測(cè)序驗(yàn)證，陽性克隆比例高。

此外，Thermo Scientific公司的T4連接酶的連接溫度為22℃，而NEB公司SmaI的酶切溫度為25℃，二者對(duì)溫度的要求相差不大，本研究發(fā)現(xiàn)在22℃SmaI也能極好的發(fā)揮酶切作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，在T4連接酶buffer中，T4連接酶和SmaI內(nèi)切酶完美兼容。本方法大大的縮短了PCR產(chǎn)物連接到克隆載體的時(shí)間(共同孵育10min后即可轉(zhuǎn)化大腸桿菌)，無需對(duì)載體及片段進(jìn)行雙酶切后膠回收等步驟，并保留了pUC18載體上的M13F和M13R測(cè)序引物結(jié)合序列，為克隆片段的測(cè)序提供了便利。本研究所創(chuàng)建的載體及快速高效連接體系具有技術(shù)明確簡(jiǎn)潔，速度快，效率高，所用試劑均為分子生物學(xué)操作中的常規(guī)試劑，在保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量的情況下極大地加速了實(shí)驗(yàn)進(jìn)度并顯著降低了實(shí)驗(yàn)成本，具有廣闊的應(yīng)用前景，非常適合實(shí)驗(yàn)室推廣使用。