本發(fā)明涉及植物病毒學(xué)和分子生物學(xué)，提供了一個可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體。
背景技術(shù)：
：小麥黃花葉病于1927年在日本首次報道，其病原主要包括小麥黃花葉病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)和中國小麥花葉病毒(Chinesewheatyellowvirus，CWMV)，其中小麥黃花葉病毒的分布區(qū)域較為廣泛。1980年以后，我國長江流域各省麥區(qū)也陸續(xù)報道了其危害，小麥黃花葉病毒在我國分布廣泛，長江流域各省份以及山東、河南、陜西等省份都有分布，對小麥生長、發(fā)育構(gòu)成嚴(yán)重危害。與其他大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)病毒一樣，自然情況下WYMV是由根腫菌目多粘菌屬的禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)傳播。這種真菌產(chǎn)生休眠孢子堆,休眠孢子堆抗逆性極強(qiáng),至少可在土壤中存活20-25年。WYMV粒子呈彎曲線狀，長度分為300和600nm兩種。WYMV為二分體基因組，由兩條線性的單鏈正義RNA組成。RNA1全長約7.6kb，RNA2全長約3.6kb，分別編碼一個270kDa和100kDa的多聚蛋白。WYMVRNA的5’端有共價結(jié)合的VPg，3’端有一個poly(A)尾。其中RNA1編碼的NIb蛋白具有RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)的活性，參與WYMV的基因組復(fù)制，而基因組復(fù)制水平直接決定WYMV在植物體內(nèi)的致病性。RNA病毒在細(xì)胞體內(nèi)的累積與基因組復(fù)制、蛋白翻譯甚至病毒粒子包裝有關(guān)，而獨(dú)立研究基因組復(fù)制的調(diào)控需要建立體外復(fù)制體系。然而目前還沒有WYMV體外復(fù)制的研究體系，需要通過原核表達(dá)并純化NIb蛋白來建立體外復(fù)制體系，但是NIb蛋白的編碼序列在不同WYMV分離物中的同源性較高，而目前研究僅通過同源推導(dǎo)知道其應(yīng)該具備RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)活性，但對于其如何調(diào)控WYMV基因組復(fù)制的機(jī)制卻依然不清楚，特別是具備RdRp活性的蛋白在原核表達(dá)、純化過程中容易造成活性喪失，因而根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)是無法建立體外復(fù)制體系的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了提供了一個可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體名稱為pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分離物的NIb蛋白編碼序列，該質(zhì)?？捎脕磉M(jìn)行NIb蛋白的原核表達(dá)，利用純化的NIb蛋白建立NIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系，可用于WYMV基因組復(fù)制調(diào)控的研究。發(fā)明人首先公開了一個可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體名稱為pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分離物NIb蛋白的編碼序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，編碼的氨基酸序列如SeqIDNo.2所示。為了獲得該質(zhì)粒，發(fā)明人首先利用PCR方法以含有NIb蛋白編碼序列的質(zhì)粒為模板獲得WYMV潢川分離物NIb蛋白的編碼序列，然后將NIb蛋白的編碼序列利用酶切和連接插入到pMAL-C2X(NEB公司)載體中，獲得了含有小麥黃花葉病毒NIb蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體名稱為pMAL-WYMV-NIb，其中含有WYMV潢川分離物NIb蛋白的編碼序列。發(fā)明人利用該質(zhì)粒載體進(jìn)行原核表達(dá)并通過親和層析方法純化NIb融合蛋白，利用純化的NIb融合蛋白進(jìn)行體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)，可成功識別基因組3'UTR，并以其為模板產(chǎn)生互補(bǔ)鏈。由此證明WYMVNIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系的建立成功，將為WYMV的復(fù)制調(diào)控研究和WYMV的體內(nèi)致病性機(jī)理解析提供體系和數(shù)據(jù)支持。更為具體的，發(fā)明人公開了該可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體pMAL-WYMV-NIb的構(gòu)建方法如下：根據(jù)GenBank中公布的WYMV潢川分離物(WYMV-HC)RNA1的序列(登錄號：AF067124)和RNA2的序列(登錄號：AF041041)，設(shè)計引物(引物信息見表1)擴(kuò)增NIb的編碼序列和其他片段(對應(yīng)于RNA1和RNA2的5'末端，中間序列和3'末端，用于制備對應(yīng)的RNA作為體外復(fù)制模板)；以含有WYMV潢川分離物RNA1全序列的質(zhì)粒pUWR1-1(董家紅，2004，博士論文記載)為模板，在Taq酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到WYMV潢川分離物的NIb編碼序列；此PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收后進(jìn)行BamHI和SalI(Takara)雙酶切，與同樣雙酶切的pMAL-C2X載體(NEB公司)連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切鑒定和DNA測序，得到含有WYMV潢川分離物NIb蛋白編碼序列的陽性克隆pMAL-WYMV-NIb。表1本發(fā)明中用到的引物PrimernameSequence(5'to3')PCRfragmentSeqIDNoWYM-R1-4921-BamHI-FATGGATCCATGGCCTCCGACACTCTCAGCNIbSeqIDNo.3WYM-R1-6504-SalI-RATGTCGACGATAGTTTGGAGCTCAATGCTGCTNIbSeqIDNo.4WYM-T7-R-1-FATtaatacgactcactataGGAAAATAAAACCACCACAAACRNA15'160ntSeqIDNo.5WYM-R1-162-RATCTCGAAGGGAGTGAAGAARNA15'160ntSeqIDNo.6WYM-R1-T7-390-FATtaatacgactcactataGCAGCCCCGCACATCTCATGCRNA1int160ntSeqIDNo.7WYM-R1-549-RATCTCGAGTGTGGTTGTTCCAAAGTGRNA1int160ntSeqIDNo.8WYM-T7-R1-7387-FATtaatacgactcactataGGACCATAACCCCCCTCCGCRNA13'260ntSeqIDNo.9WYM-R1-7644-RATATTACCTTCTGGTACTCGTAAACGCACRNA13'260ntSeqIDNo.10WYM-T7-R-2-FATtaatacgactcactataGGAAAATAAAACCACCACAAACRNA25'170ntSeqIDNo.11WYM-R2-170-RATAGAAGCGGAAAGAACTAGGRNA25'170ntSeqIDNo.12WYM-R2-T7-390-FATtaatacgactcactataGCTTGCTGCCAACCTTCGTRNA2int160ntSeqIDNo.13WYM-R2-549-RATGAAGGTTCGGACTGGTTGTRNA2int160ntSeqIDNo.14WYM-T7-R2-3460-FATtaatacgactcactataGGGCACCGCGCGTTGTGCCACGRNA23'190ntSeqIDNo.15WYM-R2-3652-RATGTCACATTTCCTGTGTACAAAAGCTGGRNA23'190ntSeqIDNo.16注：酶切位點(diǎn)用下劃線表示，T7啟動子序列用小寫斜體表示；int：表示中間序列nt：核苷酸獲得質(zhì)粒pMAL-WYMV-NIb后，發(fā)明人利用該質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)，并通過親和層析方法純化可溶性的NIb融合蛋白，進(jìn)而建立NIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NIb蛋白可特異識別WYMVRNA1和RNA2的3’末端片段，產(chǎn)生其互補(bǔ)鏈。主要步驟包括：1)融合MBP的NIb蛋白的預(yù)表達(dá)：將質(zhì)粒pMAL-WYMV-NIb轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta的感受態(tài)細(xì)胞，利用SDS-PAGE電泳測試不同IPTG濃度對目的蛋白(帶MBP標(biāo)簽的NIb蛋白，命名為MBP-NIb)的誘導(dǎo)作用，確認(rèn)最優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度為0.4mM。2)MBP-NIb蛋白的可溶性分析：在確認(rèn)IPTG可誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的前提下，分析目的蛋白的可溶性。并測試不同誘導(dǎo)溫度對于可溶性目的蛋白比例的影響，確認(rèn)最佳的誘導(dǎo)溫度為20℃，保證可溶性目的蛋白的比例可滿足后續(xù)的親和層析純化。3)可溶性蛋白的AmyloseResin親和柱層析純化(MBP標(biāo)簽)：利用AmyloseResin(NEB公司，0111207)制備層析柱，經(jīng)裝柱、平衡、上樣、洗脫等步驟純化可溶性MBP-NIb蛋白，用于后續(xù)的體外復(fù)制活性測試。4)NIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系：首先通過體外轉(zhuǎn)錄制備WYMVRNA1和RNA2的不同片段(包括5'末端、中間序列和3'末端),然后測試純化的MBP-NIb蛋白對于不同RNA片段的催化能力，最終體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)表明MBP-NIb蛋白特異性識別WYMVRNA1和RNA2的3'末端片段，并催化合成其互補(bǔ)鏈。綜上所述，本發(fā)明獲得了一個可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體，該質(zhì)粒載體名稱為pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分離物的NIb蛋白編碼序列，該質(zhì)?？捎脕磉M(jìn)行NIb蛋白的原核表達(dá)，利用純化的NIb蛋白建立NIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系，可用于WYMV基因組復(fù)制調(diào)控的研究。附圖說明圖1為WYMV潢川分離物NIb蛋白編碼序列的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果示意圖，其中M為為SinoBio公司的DNALadder5000，PCR產(chǎn)物應(yīng)為1600bp；圖2為質(zhì)粒pMAL-WYMV-NIb的酶切鑒定結(jié)果電泳示意圖，其中M為SinoBio公司的DNALadder5000，酶切后分別得到載體和NIb編碼片段；圖3為質(zhì)粒pMAL-WYMV-NIb原核表達(dá)的預(yù)表達(dá)結(jié)果示意圖，其中M為Transgen公司的BluePlusIIProteinMarker。IPTG誘導(dǎo)后有約100kDa的特異蛋白表達(dá)，其分子量與NIb(58kD)和MBP標(biāo)簽(40kD)的分子量之和相符；圖4為融合MBP的NIb蛋白的可溶性分析結(jié)果示意圖，其中M為Transgen公司的BluePlusIIProteinMarker，IPTG誘導(dǎo)后有約100kDa的特異蛋白表達(dá)，超聲波處理后分析可見上清和沉淀中目的蛋白(MBP-NIb)的比例，其中20℃誘導(dǎo)可達(dá)到20％左右，而37℃誘導(dǎo)下小于1％；圖5為WYMV潢川分離物NIb融合蛋白介導(dǎo)的體外復(fù)制結(jié)果示意圖，體外復(fù)制實(shí)驗(yàn)是分析純化得到NIb融合蛋白是否具有催化活性及其識別的特異性模板，由圖可知，MBP-NIb可特異性識別RNA1的3'片段和RNA2的3'片段，催化產(chǎn)生各自的互補(bǔ)鏈；同時可見其中反應(yīng)條帶的強(qiáng)弱也說明MBP-NIb對于不同識別片段(RNA1的3’片段和RNA2的3'片段)的催化效率不同。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施例中除特殊說明外其他均采用現(xiàn)有技術(shù)；實(shí)施例1可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體pMAL-WYMV-NIb的構(gòu)建方法，具體步驟如下：根據(jù)GenBank中公布的WYMV潢川分離物(WYMV-HC)RNA1的序列(登錄號：AF067124)，設(shè)計引物WYM-R1-4921-BamHI-F和WYM-R1-6504-SalI-R，這對引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即為WYMV潢川分離物NIb蛋白的編碼序列。以含有WYMV潢川分離物RNA1全序列的質(zhì)粒pUWR1-1(董家紅，2004，博士論文記載)為模板，在Taq酶(全式金，AP221-01)的作用下進(jìn)行PCR，引物對為WYM-R1-4921-BamH1-F和WYM-R1-6504-Sal1-R；PCR條件：94℃預(yù)變性5min；94℃40s變性，51℃退火40s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；擴(kuò)增得到WYMV潢川分離物的NIb編碼序列；此PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒(全式金，EG101-02)回收后進(jìn)行BamHI和SalI(Takara)雙酶切，與同樣雙酶切的pMAL-C2X在T4DNA連接酶(Takara,2011A)的作用下在16℃下過夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，涂帶有100mg/mL氨芐青霉素的LB平板，經(jīng)菌落PCR篩選、酶切鑒定和DNA測序確認(rèn)得到陽性克隆pMAL-WYMV-NIb。結(jié)果分析：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物約為1.6kb(圖1所示)，與WYMVNIb的編碼序列(1584個核苷酸)長度基本吻合。此PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和SalI酶切后插入同樣經(jīng)BamHI和SalI酶切的pMAL-C2X中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)菌落PCR初篩后，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，選用BamHI和SalI雙酶切鑒定，酶切結(jié)果顯示有約1.6kb的酶切條帶，并且剩余的酶切片段大小為約6.7kb，基本確認(rèn)該質(zhì)粒中含有WYMV-NIb的基因序列(圖2所示)；并通過質(zhì)粒的DNA測序進(jìn)行最終鑒定。實(shí)施例2WYMV潢川分離物NIb蛋白的原核表達(dá)：具體操作步驟如下：融合MBP的NIb蛋白的預(yù)表達(dá)：首先該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta的感受態(tài)細(xì)胞，涂帶有100mg/mL氨芐青霉素的LB平板；挑取含重組質(zhì)粒的Rossetta菌株置于5ml的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；取過夜培養(yǎng)的菌液按1:100的比例加入到30mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，培養(yǎng)至OD600至0.4-0.6之間；將新鮮培養(yǎng)的菌液放置在冰上10min，分裝到指形管中，每管3ml，共6管。加入IPTG至終濃度分別為0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM。37℃，200rpm培養(yǎng)4h；取1.5ml誘導(dǎo)培養(yǎng)物于1.5mL離心管中，13000rpm，離心30s，收集菌體，去上清。樣品處理：向收集的菌中加入100μLddH2O，振蕩懸浮，加入等體積的2×SDS蛋白上樣緩沖液。沸水浴5min，冰上靜置5min。跑膠及檢測：將上述樣品各取10μL點(diǎn)樣，120V電泳，至溴酚藍(lán)指示帶完全跑出。染色：將分離膠放在培養(yǎng)皿中，加入染色液，保鮮膜密封，在微波爐里中高火加熱15s，取出，水平搖床搖動10min，倒掉染色液，染色液回收。脫色：加入脫色液，在微波爐里中高火加熱15s，水平搖床搖動10min，去脫色液，加入ddH2O，水平搖床振蕩至脫色干凈。結(jié)果分析：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，與陰性對照(IPTG濃度為0mM)相比，IPTG終濃度分別為0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM時，誘導(dǎo)菌液中均有分子量約100kDa的特異蛋白表達(dá)(圖3所示)，此蛋白分子量與融合MBP的NIb蛋白的大小基本吻合。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用中IPTG終濃度為0.4mM。實(shí)施例3融合MBP的NIb蛋白的可溶性分析：按照原核表達(dá)的基本步驟，在0.4mMIPTG濃度下，誘導(dǎo)10mL菌液，20℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，并設(shè)置對照組；將誘導(dǎo)好的菌液集中在1.5mL離心管中，不同溫度誘導(dǎo)條件分別收集1mL菌液(樣品處理備用)；將菌體收集物用1.0mL蛋白緩沖液重新懸浮，并加入PMSF(終濃度為0.1mM)。注意：從此步開始，所有操作在冰上進(jìn)行。超聲波破碎(條件：400W，100次，工作4s，間隔4s)在冰上進(jìn)行。13000rpm，15min，4℃，將上清液和沉淀分開。樣品處理將1mL誘導(dǎo)的菌體收集物和1ml未誘導(dǎo)的菌體收集物分別加入100μL水，劇烈振蕩懸浮后加入等體積的2×SDS蛋白上樣緩沖液。對于超聲波處理后的沉淀，處理方法同上；對于超聲波處理后的上清液，加入等體積的2×SDS蛋白上樣緩沖液。將上述樣品沸水浴5min，冰上靜置5min。跑膠及檢測具體過程見實(shí)施例2中的操作；最終檢測目的蛋白在上清和沉淀中的比例。結(jié)果分析：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，在37℃下誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白基本都以包涵體的形式存在于沉淀中，上清中目的蛋白含量比例極低，小于1％；而在20℃下誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白在上清中的相對比例明顯提高，可達(dá)到20％左右(圖4所示)，可滿足后續(xù)的親和層析實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4可溶性蛋白的AmyloseResin親和柱層析純化(適用于MBP標(biāo)簽)：按照上述原核表達(dá)的方法，0.4mMIPTG于20℃誘導(dǎo)500mL菌液，離心后用柱平衡緩沖液重懸菌體，并進(jìn)行超聲波破碎；離心后將上清液用0.45μm的水系濾膜過濾至50ml離心管中，置冰上備用，等待過層析柱。親和層析(4℃環(huán)境中進(jìn)行)，裝柱：取2mLAmyloseResin(NEB公司，0111207)填料加入層析柱中，使液體流出；平衡：用5-10倍柱體積的平衡緩沖液平衡層析柱；上樣：將樣品通過層析柱；洗滌：用5-10倍柱體積的平衡緩沖液洗滌層析柱，收集流出液；洗脫：用3mL洗脫液洗脫目的蛋白(用離心管收集洗脫液，每管500μl，并做標(biāo)記，放置于冰上)。檢測：上清液、洗滌液和不同濃度maltose的洗脫液各取10μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測純化蛋白的質(zhì)量。最終，將含有目的蛋白的溶液儲存在-80℃。其中所采用的平衡緩沖液(AmyloseResin)：20mMTris-Cl(pH8.0)，25mMNaCl，1mMEDTA(pH8.0)，10mMβ-mercaptoethanol，10％glycerol；洗脫緩沖液(AmyloseResin)：在平衡緩沖液中加入0.5Mmaltose母液，使maltose終濃度達(dá)到10mM。實(shí)施例5體外轉(zhuǎn)錄制備WYMVRNA1和RNA2的不同RNA片段：以含有WYMV潢川分離物RNA1和RNA2全序列的質(zhì)粒pUWR1-1和pUWR2-1(董家紅，2004，博士論文記載)為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得對應(yīng)于WYMV不同位置的PCR片段(所用引物和擴(kuò)增片段見表1)，并利用DNA回收試劑盒(全式金，EG101-02)進(jìn)行切膠回收。利用以上PCR產(chǎn)物為模板，在T7RNA聚合酶(普洛麥格，P2075)的作用下進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物4.0μg，100mMDTT12.0μl，5mMrNTPs12.0μl，5×T7Buffer24.0μl，Rnase酶抑制劑0.5μl，T7RNA聚合酶2.0μl，H2O補(bǔ)至120μl)，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間2.5h；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化對應(yīng)的RNA片段。純化后RNA片段作為體外復(fù)制的模板備用。實(shí)施例6WYMVNIb介導(dǎo)的體外復(fù)制體系：在MBP-NIb蛋白的作用下進(jìn)行體外復(fù)制反應(yīng)(反應(yīng)體系：RNA模板1.0μg，1MTris-Cl(pH8.2)2.5μl，1MMgCl20.5μl，1MDTT0.5μl，1MKCl5μl，10mg/mlyeasttRNA1.75μl，20mMATP2.5μl，20mMGTP2.5μl，20mMCTP2.5μl，1mMUTP0.5μl，α-32P-UTP0.5μl，NIb融合蛋白12.5μl，H2O補(bǔ)至50μl)，反應(yīng)溫度20℃，孵育1h-1.5h；反應(yīng)結(jié)束后加入70μLddH2O混勻，加入120μL酚/仿(0.5mL苯酚/0.5mL氯仿/0.04mL0.5MEDTA/0.01mL10％SDS混合物)抽提；離心上清液加入2.4倍體積的NH4Ac/isopropanol(5MNH4Ac:isopropanol＝1:5),混勻，-20℃過夜沉淀，沉淀經(jīng)離心、洗滌、晾干；加入10μLRNAloadingbuffer，然后在5％PAGE膠(含8M尿素)中，1500mA電泳1-2h；干膠，壓磷屏成像。結(jié)果分析：體外復(fù)制結(jié)果如圖5顯示，MBP-NIb蛋白可特異性識別WYMVRNA1和RNA2的3'末端序列，產(chǎn)生其互補(bǔ)鏈。其中反應(yīng)條帶的強(qiáng)弱也說明MBP-NIb對于不同特異性識別片段(RNA1的3’片段和RNA2的3'片段)的催化效率不同。說明此通過質(zhì)粒pMAL-WYMV-NIb原核表達(dá)并純化的MBP-NIb蛋白可介導(dǎo)針對WYMV的體外復(fù)制體系。<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一個可原核表達(dá)小麥黃花葉病毒潢川分離物NIb蛋白的質(zhì)粒載體<160>16<210>1<211>1590<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcctccgacactctcagcaagatcaacaactccatccttggcttt48MetAlaSerAspThrLeuSerLysIleAsnAsnSerIleLeuGlyPhe151015ggaagtgatttgaaaggccagcttgttcaacccgtaacaccagctcta96GlySerAspLeuLysGlyGlnLeuValGlnProValThrProAlaLeu202530cgcactcgctttgaggccctgttcggtggtggaagcttcgaactcgtc144ArgThrArgPheGluAlaLeuPheGlyGlyGlySerPheGluLeuVal354045ggaacaatgaacaaaggactcatagacaaacacataattgttggggag192GlyThrMetAsnLysGlyLeuIleAspLysHisIleIleValGlyGlu505560aacgacaacgttcatgatttcatgagagagcaccccacttttgcttgg240AsnAspAsnValHisAspPheMetArgGluHisProThrPheAlaTrp65707580cttcagggtttcatggacgaatacgcaccaagtgtcttgaactactcg288LeuGlnGlyPheMetAspGluTyrAlaProSerValLeuAsnTyrSer859095gcttactacaaggatctttgcaagtacaataggaagaagcaccaactc336AlaTyrTyrLysAspLeuCysLysTyrAsnArgLysLysHisGlnLeu100105110tccttcaaccctcacgagcttcggagtgccaccgctggaatgatcaga384SerPheAsnProHisGluLeuArgSerAlaThrAlaGlyMetIleArg115120125atgttggaagacgccggcctaactcaaggcgacgtgaggacaccccaa432MetLeuGluAspAlaGlyLeuThrGlnGlyAspValArgThrProGln130135140caggttgtttcagacatgcagtggaacacttccgccggaccaagctac480GlnValValSerAspMetGlnTrpAsnThrSerAlaGlyProSerTyr145150155160cagggcaagaaaagagacgtttgcgcacatctcagcgagcaggaagtt528GlnGlyLysLysArgAspValCysAlaHisLeuSerGluGlnGluVal165170175ctacaccttgcagaaacgtcgcgacacagatttctagcctgcaattcc576LeuHisLeuAlaGluThrSerArgHisArgPheLeuAlaCysAsnSer180185190atcggcatttggaacggatcgctcaaagcagagcttaggacgattgag624IleGlyIleTrpAsnGlySerLeuLysAlaGluLeuArgThrIleGlu195200205aaagtagaagctgagaaaaccagagttttcacggcttcgccaatcacg672LysValGluAlaGluLysThrArgValPheThrAlaSerProIleThr210215220agcctattcgccatgaagttctacgttgacgatttcaacaagaagttc720SerLeuPheAlaMetLysPheTyrValAspAspPheAsnLysLysPhe225230235240tatgcgacaaacctgaaagctccacacacggtaggaatcaacaaattc768TyrAlaThrAsnLeuLysAlaProHisThrValGlyIleAsnLysPhe245250255agcagaggctgggaaatgctccacgacaagctcaaccgcccaggttgg816SerArgGlyTrpGluMetLeuHisAspLysLeuAsnArgProGlyTrp260265270cttcacggcagtggcgatgggtcacgattcgatagttcaattgaccct864LeuHisGlySerGlyAspGlySerArgPheAspSerSerIleAspPro275280285ttcttcttcgacataatcaaggagattcgaaagcactttctaccagtt912PhePhePheAspIleIleLysGluIleArgLysHisPheLeuProVal290295300gagcaccatcgcgcaatcgacctaatatacgacgagattctcaacacc960GluHisHisArgAlaIleAspLeuIleTyrAspGluIleLeuAsnThr305310315320aacatttgtttggcaaatggcatggtgattcgaaagaacgttgggaat1008AsnIleCysLeuAlaAsnGlyMetValIleArgLysAsnValGlyAsn325330335aacagcgggcagccaagcacggtcgtagacaacacacttgttctcatg1056AsnSerGlyGlnProSerThrValValAspAsnThrLeuValLeuMet340345350gtctcttttctctacgcttacattcataaaaccggggaccatatgctc1104ValSerPheLeuTyrAlaTyrIleHisLysThrGlyAspHisMetLeu355360365aagaaactcaacgacagatttgttttcgtctgcaatggtgacgacaac1152LysLysLeuAsnAspArgPheValPheValCysAsnGlyAspAspAsn370375380aaatttgccatttccccagaattcgacgccgagttcggtcacgacttt1200LysPheAlaIleSerProGluPheAspAlaGluPheGlyHisAspPhe385390395400tcaccggagctcacagagctaggtttgacgtacgagtttgacgacata1248SerProGluLeuThrGluLeuGlyLeuThrTyrGluPheAspAspIle405410415acagatgacatctgtgcaaacccctacatgtccctgaccatggtccgc1296ThrAspAspIleCysAlaAsnProTyrMetSerLeuThrMetValArg420425430actccctttggaattgggttctctttgcccgtggaacgcattgtagca1344ThrProPheGlyIleGlyPheSerLeuProValGluArgIleValAla435440445ataatgcagtgggctaagaagggcggcgttctgcactcttacttggca1392IleMetGlnTrpAlaLysLysGlyGlyValLeuHisSerTyrLeuAla450455460ggaatctcagccatttacgaaagcttcaacacaccaaagttgttcaaa1440GlyIleSerAlaIleTyrGluSerPheAsnThrProLysLeuPheLys465470475480tcagtgtatgcgtatttgttatggctgacagaggaacacggctctgac1488SerValTyrAlaTyrLeuLeuTrpLeuThrGluGluHisGlySerAsp485490495atcctagctgcgatgaccggaacagcgacagctctcccaattccctcc1536IleLeuAlaAlaMetThrGlyThrAlaThrAlaLeuProIleProSer500505510atgctcgatgtgtaccgcctccactatggcgatagcagcattgagctc1584MetLeuAspValTyrArgLeuHisTyrGlyAspSerSerIleGluLeu515520525caatag1590Gln529<210>2<211>529<212>PRT<213>人工序列<400>2MetAlaSerAspThrLeuSerLysIleAsnAsnSerIleLeuGlyPhe151015GlySerAspLeuLysGlyGlnLeuValGlnProValThrProAlaLeu202530ArgThrArgPheGluAlaLeuPheGlyGlyGlySerPheGluLeuVal354045GlyThrMetAsnLysGlyLeuIleAspLysHisIleIleValGlyGlu505560AsnAspAsnValHisAspPheMetArgGluHisProThrPheAlaTrp65707580LeuGlnGlyPheMetAspGluTyrAlaProSerValLeuAsnTyrSer859095AlaTyrTyrLysAspLeuCysLysTyrAsnArgLysLysHisGlnLeu100105110SerPheAsnProHisGluLeuArgSerAlaThrAlaGlyMetIleArg115120125MetLeuGluAspAlaGlyLeuThrGlnGlyAspValArgThrProGln130135140GlnValValSerAspMetGlnTrpAsnThrSerAlaGlyProSerTyr145150155160GlnGlyLysLysArgAspValCysAlaHisLeuSerGluGlnGluVal165170175LeuHisLeuAlaGluThrSerArgHisArgPheLeuAlaCysAsnSer180185190IleGlyIleTrpAsnGlySerLeuLysAlaGluLeuArgThrIleGlu195200205LysValGluAlaGluLysThrArgValPheThrAlaSerProIleThr210215220SerLeuPheAlaMetLysPheTyrValAspAspPheAsnLysLysPhe225230235240TyrAlaThrAsnLeuLysAlaProHisThrValGlyIleAsnLysPhe245250255SerArgGlyTrpGluMetLeuHisAspLysLeuAsnArgProGlyTrp260265270LeuHisGlySerGlyAspGlySerArgPheAspSerSerIleAspPro275280285PhePhePheAspIleIleLysGluIleArgLysHisPheLeuProVal290295300GluHisHisArgAlaIleAspLeuIleTyrAspGluIleLeuAsnThr305310315320AsnIleCysLeuAlaAsnGlyMetValIleArgLysAsnValGlyAsn325330335AsnSerGlyGlnProSerThrValValAspAsnThrLeuValLeuMet340345350ValSerPheLeuTyrAlaTyrIleHisLysThrGlyAspHisMetLeu355360365LysLysLeuAsnAspArgPheValPheValCysAsnGlyAspAspAsn370375380LysPheAlaIleSerProGluPheAspAlaGluPheGlyHisAspPhe385390395400SerProGluLeuThrGluLeuGlyLeuThrTyrGluPheAspAspIle405410415ThrAspAspIleCysAlaAsnProTyrMetSerLeuThrMetValArg420425430ThrProPheGlyIleGlyPheSerLeuProValGluArgIleValAla4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