本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及PRIMA1基因在制備椎間盤退行性疾病診斷試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：椎間盤退行性疾病是指椎間盤組織在多種原因綜合作用下發(fā)生細(xì)胞介導(dǎo)的生物化學(xué)變化，引起老化加速、椎間盤力學(xué)特性改變，使臨近骨關(guān)節(jié)、韌帶發(fā)生相應(yīng)變化，造成脊柱不穩(wěn)，壓迫脊髓、神經(jīng)根、動脈，引起相應(yīng)臨床癥狀和體征的綜合征。它包括椎間盤源性腰痛、椎間盤突出癥、退行性脊椎不穩(wěn)癥、退行性椎管狹窄癥、退行性滑脫癥等，是臨床上常見疾病之一。其病因尚不清楚，目前普遍認(rèn)為椎間盤退行性疾病的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。隨著基因檢測技術(shù)的發(fā)展，近年來，人們逐漸意識到遺傳易感性即遺傳因素對于揭示椎間盤退行性疾病發(fā)病的重要作用。目前椎間盤退行性疾病一般采取保守治療，即從保守治療依次到微創(chuàng)、常規(guī)手術(shù)治療、非融合固定治療、融合固定治療的階梯。越是高級階梯的治療，創(chuàng)傷越大，對機(jī)體自然解剖狀態(tài)的干預(yù)越大，每一高級階梯的治療可作為對相對低級階梯治療的補(bǔ)救措施。對患者采取的治療方案要根據(jù)患者病情所處的階段，同時也要考慮到患者個體因素，如創(chuàng)傷、風(fēng)險、費用以及患者的意愿。但是無論哪種手術(shù)方式，均不能在椎間盤退變的早期進(jìn)行有效地干預(yù)，不能延緩或逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。開放手術(shù)(椎間盤切除融合內(nèi)固定術(shù))雖能較為徹底的切除退變椎間盤，但手術(shù)創(chuàng)傷大，費用高，內(nèi)固定限制了脊柱的活動度，加速鄰近節(jié)段椎間盤的退變。微創(chuàng)手術(shù)不能徹底切除退變椎間盤組織，術(shù)后癥狀可能不能完全緩解，術(shù)后復(fù)發(fā)的可能性較大。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供PRIMA1基因或其表達(dá)產(chǎn)物在制備椎間盤退行性疾病診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之二在于提供一種檢測椎間盤退行性疾病的試劑盒。本發(fā)明的目的之三在于提供一種治療椎間盤退行性疾病的藥物。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供PRIMA1基因或其表達(dá)產(chǎn)物在用于制備椎間盤退行性疾病診斷試劑中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述PRIMA1基因或其表達(dá)產(chǎn)物在椎間盤退行性疾病組織中表達(dá)下調(diào)。優(yōu)選地，所述診斷試劑包括基因水平的診斷試劑和蛋白水平的診斷試劑，所述基因水平的診斷試劑包括通過實時熒光定量PCR方法或基因芯片方法檢測基因表達(dá)水平；所述蛋白水平的診斷試劑包括通過免疫學(xué)方法檢測PRIMA1基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。優(yōu)選地，所述實時熒光定量PCR方法包括SYBRGreen法和TaqMan探針法。優(yōu)選地，所述基因芯片包括固相載體以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性捕獲PRIMA1基因的部分或全部核苷酸序列。優(yōu)選地，所述免疫學(xué)方法為ELISA檢測方法。優(yōu)選地，所述ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包括：包被PRIMA1基因單克隆抗體的固相載體，酶標(biāo)抗體，酶的底物，產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應(yīng)終止液等。所述抗體可采用市售的PRIMA1基因單克隆抗體，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種椎間盤退行性疾病診斷試劑盒，所述試劑盒包括特異性擴(kuò)增PRIMA1基因的引物組以及特異性捕獲PRIMA1基因的熒光探針。優(yōu)選地，所述引物組包括如SEQIDNO:2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQIDNO:3所示核苷酸序列的下游引物，所述熒光探針為如SEQIDNO:4所示核苷酸序列。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTP、Taq酶。優(yōu)選地，所述試劑盒含有陽性對照和陰性對照。優(yōu)選地，所述陽性對照為正常的椎間盤髓核組織RNA或DNA，所述陰性對照為ddH2O。進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種椎間盤退行性疾病的治療方法，所述方法包括促進(jìn)PRIMA1基因的表達(dá)，或促進(jìn)PRIMA1基因產(chǎn)物的表達(dá)，或增強(qiáng)PRIMA1基因產(chǎn)物的活性。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種治療椎間盤退行性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含PRIMA1基因或其表達(dá)產(chǎn)物的激活劑。優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，這類載體包括(但并不限于)：稀釋劑、緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)需要制備成各種劑型，包括但不限于，片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。本發(fā)明的藥物組合物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即可，包括但不限于口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經(jīng)皮用藥。本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療椎間盤退行性病變的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提到治療的成功率。優(yōu)選地，所述激活劑能促進(jìn)PRIMA1基因的表達(dá)或增強(qiáng)其活性。優(yōu)選地，所述激活劑通過構(gòu)建過表達(dá)載體的方法促進(jìn)PRIMA1基因或其產(chǎn)物的表達(dá)。優(yōu)選地，所述激活劑為PcDNA3.1-PRIMA1。本發(fā)明的激活劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的PRIMA1基因產(chǎn)物的缺失或不足，通過提高內(nèi)源性產(chǎn)物的表達(dá)，從而治療因內(nèi)源性產(chǎn)物缺乏導(dǎo)致的椎間盤退行性疾病。另一方面可以用于增強(qiáng)內(nèi)源性產(chǎn)物的活性，從而治療椎間盤退行性疾病。優(yōu)選地，所述載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的藥物組合物在促進(jìn)椎間盤退行性疾病細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。本發(fā)明PRIMA1基因的編碼序列如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明使用體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞研究PRIMA1基因?qū)ψ甸g盤退行性病變的治療作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，椎間盤退行性病變發(fā)生的一個重要的生理特征在于髓核細(xì)胞的增殖減緩、衰老加快、凋亡加劇，因此本發(fā)明利用髓核細(xì)胞生長指標(biāo)變化來研究PRIMA1基因與椎間盤退行性病變治療的關(guān)系。本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種椎間盤退行性疾病診斷分子標(biāo)記物PRIMA1基因，并進(jìn)一步證實PRIMA1基因表達(dá)水平在椎間盤退行性疾病組織中表達(dá)下調(diào)。利用PRIMA1基因檢測椎間盤退行性疾病不僅能夠快速有效的做到疾病早期診斷，其精確度大大提高，而且為基因治療、藥物治療等臨床應(yīng)用提供了治療靶點和重要依據(jù)。附圖說明圖1實時熒光定量PCR檢測PRIMA1基因在椎間盤退行性疾病髓核組織中的表達(dá)情況；圖2實時熒光定量PCR檢測PRIMA1基因在椎間盤退行性疾病髓核細(xì)胞中的表達(dá)情況；圖3PRIMA1基因的過表達(dá)對髓核細(xì)胞增殖能力的影響。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。本發(fā)明的發(fā)明人對10例椎間盤退行性疾病患者的髓核組織樣本及4例對照樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，椎間盤退行性疾病患者的髓核組織中PRIMA1基因的水平與對照相比顯著下調(diào)。進(jìn)一步地，發(fā)明人采用TaqMan實時熒光定量PCR方法驗證了PRIMA1基因在椎間盤退行性疾病患者髓核組織中表達(dá)下調(diào)，其相關(guān)制劑可用于椎間盤退行性疾病。PRIMA1(prolinerichmembraneanchor1，脯氨酸豐富的膜錨1)位于14號染色體上，是蛋白編碼基因，能將乙酰膽堿酯酶組裝成四聚體，并將其錨定在神經(jīng)細(xì)胞膜上。實施例1篩選與椎間盤退行性疾病相關(guān)的基因標(biāo)志物1、樣本收集取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科收集10例椎間盤退行性疾病患者作為實驗組，對照組來源于同時期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。上述所有標(biāo)本的取得均通過組織倫理委員會的同意。獲取所有研究對象椎間盤髓核組織，編號后置-80℃低溫冰箱保存。2、對髓核組織進(jìn)行總RNA提取采用Reagent(invitrogen，貨號15596-018)進(jìn)行樣本RNA提取，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：收集樣本后凍存于液氮，取出后把髓核組織放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：①加入Trizol，室溫保存5分鐘；②加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5分鐘-10分鐘；③12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；④12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下12000rpm高速離心5分鐘；⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。3、RNA樣品的質(zhì)量分析RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。4、高通量測序測序平臺為Illumina公司的HiSeq2500高通量測序平臺，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCRduplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對差異表達(dá)基因進(jìn)行了GeneOntology和信號通路分析，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)基因PRIMA1，該基因在髓核組織樣本中表達(dá)下調(diào)。實施例2TaqMan實時熒光定量PCR驗證椎間盤退行性疾病患者PRIMA1基因的表達(dá)情況1、材料按照實施例1的樣本收集方式收集15例椎間盤退行性疾病患者髓核組織及8例對照髓核組織，對其進(jìn)行分組及編號。2、方法2.1對髓核組織進(jìn)行總RNA提取，同實施例1的提取方法。2.2逆轉(zhuǎn)錄采用IIIReverseTranscriptase(invitrogen，貨號18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。2.3Real-TimePCR利用ABIPrimerExpress3.0軟件設(shè)計管家基因(Actin)和目的基因(PRIMA1)的熒光定量擴(kuò)增引物及探針，引物設(shè)計后由invitrogen公司合成。具體引物和探針序列如下：PRIMA1基因：上游引物：AAGGTGCTTCCCACACATCTG(SEQIDNO.2)；下游引物：GAGCCTAGGGTGTAGGGTGTCA(SEQIDNO.3)；探針：CATCGCCCCATCTGCAGTTGTTGTC(SEQIDNO.4)。Actin基因：上游引物：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA(SEQIDNO.5)；下游引物：CTCGGCCAGGGTGTTGAA(SEQIDNO.6)；探針：GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTT(SEQIDNO.7)。用ProbeqPCRMix(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：THUNDERBIRDProbeqPCRMix：12.5uL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8uL，TaqManProbe(10μM)：0.4uL，ROXReferenceDye(50×)：0.5uL，RNase-freedH2O：8uL，模板cDNA：2uL，總體系25uL。反應(yīng)程序在ABI7500上進(jìn)行，擴(kuò)增程序為：95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40個循環(huán)。3、統(tǒng)計學(xué)分析實時定量PCR擴(kuò)增曲線拐點清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，基線平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果，根據(jù)qRT-PCR的相對定量公式：2-ΔΔCt×100％，比較PRIMA1基因在椎間盤退行性疾病患者髓核組織和對照組髓核組織中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中PRIMA1基因在椎間盤退行性疾病組織表達(dá)水平明顯低于對照組，約是對照組的35％，具體見圖1，以上結(jié)果驗證了高通量測序分析的結(jié)果。實施例3PRIMA1基因過表達(dá)一、細(xì)胞培養(yǎng)(1)將獲取的髓核組織在無菌條件下用D-HANKS(華邁科，貨號HMK03230)液沖洗3次。(2)用剪刀將髓核組織剪碎(約1mm3大小)，置于無菌離心管中。(3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min搖動一次。(4)800rpm離心5min，棄去上清液。(5)0.2％Ⅱ型膠原酶37℃消化4h，用200目篩網(wǎng)過濾。(6)濾液以800rpm離心5min，棄去上清液。(7)DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗，800rpm離心5min，重復(fù)3次。(8)細(xì)胞計數(shù)后接種于培養(yǎng)瓶，含10％體積胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基作為養(yǎng)液，于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。二、實驗方法1、根據(jù)PRIMA1基因的編碼序列(如SEQIDNO.1所示)設(shè)計擴(kuò)增引物，引物的設(shè)計為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。從髓核細(xì)胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)成cDNA，以此為模板擴(kuò)增基因，上游引物CGCGGATCCGCCACCATGCTCCTCCGGGACTTG(SEQIDNO.8)，下游引物GCCGCTCGAGTCACACCACTGCGTTGTTCAG(SEQIDNO.9)。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，DNA回收純化，將pcr產(chǎn)物及pcDNA3.1載體質(zhì)粒用BamHI、XholI進(jìn)行雙酶切，回收產(chǎn)物，在T4DNA連接酶的作用下，將pcr產(chǎn)物與pcDNA3.1載體質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗氨芐青霉素陽性克隆，用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，使用PCR和雙酶切鑒定分析，選取含目標(biāo)片段的單克隆菌落遞交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序鑒定。重組質(zhì)粒定名為PcDNA3.1-PRIMA1基因。2細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗分為空白對照組(blank)、陰性對照組(pcDNA3.1空載體)和實驗組(pcDNA3.1-PRIMA1)。按照LipofectamineTM2000TransfectionReagent提供的步驟進(jìn)行。(1)將5×104細(xì)胞接種在6孔板上，這些用于初期接種的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)能在24小時內(nèi)使細(xì)胞匯合達(dá)到70％；(2)準(zhǔn)備質(zhì)粒DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物:a.以250μLOpti-MEM稀釋5μLLipofectamineTM2000，輕輕混勻，室溫下孵育5分鐘；b.實驗各組分別取4μg質(zhì)粒DNA加入250μLOpti-MEM中進(jìn)行稀釋，并輕輕搖動將其混勻；c.孵育5分鐘后，將稀釋的質(zhì)粒DNA和LipofectamineTM2000混合后在室溫下孵育20分鐘。(3)在培養(yǎng)板中的每個孔中都加入細(xì)胞、培養(yǎng)基及DNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物。然后輕輕搖動培養(yǎng)板，使他們充分混合；(4)放置在37℃，CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48小時，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染數(shù)量，檢測轉(zhuǎn)染效率；(5)轉(zhuǎn)染效率為熒光鏡與光鏡視野中的細(xì)胞數(shù)量的比值，細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到90％以上，方可以進(jìn)行后續(xù)的實驗。計算公式如下：轉(zhuǎn)染效率＝發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)量/相同視野下的細(xì)胞數(shù)量×100％3、利用Real-TimePCR實驗檢測PRIMA1基因的過表達(dá)情況具體步驟參照實施例2。PRIMA1基因：上游引物：CTGGTGATCATCATTGCCGTAT(SEQIDNO.10)；下游引物：GGCTTTGTAGCAAATGATGACAAG(SEQIDNO.11)；探針：CTGTGCCTCCCTGGTGTTTCTGACTGT(SEQIDNO.12)。Actin基因：上游引物：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA(SEQIDNO.5)；下游引物：CTCGGCCAGGGTGTTGAA(SEQIDNO.6)；探針：GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTT(SEQIDNO.7)。三、實驗結(jié)果pcDNA3.1-PRIMA1實驗組與pcDNA3.1空載體組和空白對照組相比，實驗組中PRIMA1基因的表達(dá)水平明顯上調(diào)，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功并穩(wěn)定表達(dá)(P<0.05)，具體情況見圖2。實施例4PRIMA1基因過表達(dá)對人椎間盤退行性疾病細(xì)胞增殖的影響實驗分組：空白對照組、pcDNA3.1空載體組和pcDNA3.1-PRIMA1組。取對數(shù)增殖期細(xì)胞配置成1×104/mL單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)6個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入CCK-8試劑，2h后用酶標(biāo)儀測定其450nm波長吸光度值作為零點。以后連續(xù)3d每過24h，每孔加入CCK-8試劑10μL溫育2h后，酶標(biāo)儀測定細(xì)胞吸光度值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-PRIMA1組細(xì)胞生長速度明顯高于pcDNA3.1空載體組和空白對照組細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明PRIMA1基因過表達(dá)能促進(jìn)椎間盤髓核細(xì)胞的生長，具體情況見圖3。實施例5試劑盒組裝組裝本發(fā)明所述用于檢測椎間盤退行性疾病的試劑盒，該試劑盒包括特異擴(kuò)增PRIMA1的引物和探針序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；和特異擴(kuò)增管家基因(Actin)的引物和探針序列如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示；還包括PCRMix反應(yīng)體系，如PCR緩沖液、Taq酶和dNTPs。還包括正常椎間盤組織cDNA：作為對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。反應(yīng)程序為：95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系如表1所示。表1定量PCR反應(yīng)體系組分加入量PCRMix反應(yīng)體系12.5μL上游引物(10μM)0.5μL下游引物(10μM)0.5μLTaqManProbe(10μM)0.4uL模板cDNA2.0μL加入滅菌蒸餾水至25μL雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表<110>北京昊源生物醫(yī)學(xué)科技有限公司<120>PRIMA1基因在制備椎間盤退行性疾病診斷試劑中的應(yīng)用<130>p16zjp42<160>12<170>PatentInversion3.5<210>1<211>462<212>DNA<213>基因序列<400>1atgctcctccgggacttggtgctgcgccgtggctgctgctggtcctcgctgctgctgcac60tgcgcgctccacccgctctggggcttcgtgcaggtgacgcatggtgagccccagaagtcc120tgctccaaagtgactgacagctgccgacacgtctgccagtgccggccccctcccccgctg180cccccgccgcccccacccccgccacctcccagactcctctccgccccagctcccaactct240acctcttgccccactgaggaaagctggtggtcggggctggtgatcatcattgccgtatgc300tgtgcctccctggtgtttctgactgtgcttgtcatcatttgctacaaagccataaaaagg360aaaccactgagaaaagacgaaaatggcaccagcgttgctgagtatcccatgagtgcttcg420cagagcaacaaaggagtagacgtgaacaacgcagtggtgtga462<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2aaggtgcttcccacacatctg21<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3gagcctagggtgtagggtgtca22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4catcgccccatctgcagttgttgtc25<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5gatacgaagggagggtgtacca22<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>6ctcggccagggtgttgaa18<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>7gcttctgatggcaagctctacgtctcctt29<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>8cgcggatccgccaccatgctcctccgggacttg33<210>9<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>9gccgctcgagtcacaccactgcgttgttcag31<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10ctggtgatcatcattgccgtat22<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>11ggctttgtagcaaatgatgacaag24<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>12ctgtgcctccctggtgtttctgactgt27當(dāng)前第1頁1 2 3