本發(fā)明涉及羊絨鑒定方法領(lǐng)域，具體涉及一種羊絨織物的分子鑒定方法。
背景技術(shù)：
：我國是世界上主要生產(chǎn)山羊絨(簡稱羊絨)的國家之一，每年的年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70％以上，居于世界第一位，同時羊絨質(zhì)量也居于世界第一位。羊絨纖維是紡織工業(yè)中的高級原料，有著“軟黃金”的美稱，交易以克論價。近幾年來，人們的生活水平都普遍提高，對于高質(zhì)量的羊絨制品更加青睞，對羊絨市場的需求也更大了。但由于羊絨價格昂貴，附加利潤特別高，受利益驅(qū)使，一些不法商販以次充好，導(dǎo)致市場上的摻假現(xiàn)象嚴(yán)重。例如，用羊毛、兔毛等價格較低的動物纖維冒充羊絨作為填充物。由于這些動物纖維在結(jié)構(gòu)、外觀形態(tài)、理化性能上與羊絨較為接近，但價格上卻相差很大，從而賺取巨額差價來牟取暴利。一般這類以次充好的產(chǎn)品保暖性能都達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)，從而給消費(fèi)者帶來損失。因此，對羊絨織物進(jìn)行鑒定，加以區(qū)分有助于杜絕市場上這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，保證羊絨的質(zhì)量以及消費(fèi)者的利益。山羊?qū)儆诓溉轭惖募倚?，一般生活在氣候變化劇烈的丘陵與高山地區(qū)。因此，山羊?yàn)榱四軌蜻m應(yīng)寒冷的氣候變化，在其粗長的根部，有一層薄薄的細(xì)軟絨毛，即山羊絨(Cashmere)。山羊絨是一種稀有的動物纖維，一般在冬天較寒冷時長出，可以抵御風(fēng)寒。春天氣溫回升之后脫落，使山羊能夠自然的適應(yīng)氣候。羊絨的來源非常豐富，可以直接從活體上獲得所要的樣品。羊絨纖維柔軟纖細(xì)、光澤柔和，在紡織工業(yè)中屬于高檔原料，用其作為原料的制品手感非常柔軟，并且保暖舒適，華麗高雅。羊絨由鱗片和皮質(zhì)層組成，沒有髓質(zhì)層。鱗片較薄，表面及邊緣光滑，緊貼毛干。皮質(zhì)層是纖維的主體，它是由細(xì)而長的紡錘體角質(zhì)細(xì)胞順著纖維縱軸緊密排列而成，纖維的性能主要取決于皮質(zhì)層，鱗片層與皮質(zhì)層共同決定了纖維的縱向和橫截面的形態(tài)特征。山羊絨的強(qiáng)伸度、彈性變化都很好,少卷曲，勻直光滑，具有細(xì)、輕、柔軟、保暖性好等優(yōu)良特性。目前主要的鑒別方法有光學(xué)投影顯微鏡法、計算機(jī)圖形分析法(掃描電子顯微鏡法)、染色法、溶液鑒別法、基因分析法等，具體如下：一、光學(xué)投影顯微鏡法光學(xué)投影顯微鏡法是目前最常用的方法。在紡織中，毛類纖維使用量最大的就是羊毛，羊毛纖維可分為三個組成部分：包覆在毛干外部的鱗片層。組成羊毛實(shí)體主要部分的皮質(zhì)層，在毛干中心由不透明毛髓組成的髓質(zhì)層。山羊絨與羊毛纖維相似,也由鱗片層和皮質(zhì)層構(gòu)成。光學(xué)投影顯微鏡由于放大倍數(shù)和景深的限制,圖像分辨率較低,受樣品顏色影響較大，因此，無法區(qū)分鱗片的細(xì)微結(jié)構(gòu),不能測量鱗片的邊緣厚度、邊緣高度,特別是對纖維表面進(jìn)行了化學(xué)處理后的樣品。所以，在鑒定時主觀性比較強(qiáng)，容易產(chǎn)生誤判。二、計算機(jī)圖形分析法計算機(jī)圖形分析法是通過掃描電子顯微鏡對羊絨和羊毛纖維實(shí)時成像，然后采集圖像，將其傳送到計算機(jī)系統(tǒng)里，并對圖像進(jìn)行一系列處理和計算，從而對羊絨和羊毛纖維進(jìn)行識別。這種檢測方法提高了客觀性和準(zhǔn)確性,也減少了對檢測人員水平、經(jīng)驗(yàn)的依賴性，但是效率比較低、速度也比較慢、反而成本比較高。三、染色法由于山羊絨具有某些特定的物理性質(zhì)，例如較細(xì)、表面能高，所以其對某一類染料的吸附能力比較強(qiáng)。利用這一特點(diǎn)可以對羊絨與羊毛纖維進(jìn)行鑒定。一般情況下，選擇相同的處方和染料，通過觀察是否出現(xiàn)顏色以及顏色的深淺和上色率的不同來鑒別羊絨和羊毛纖維。四、溶液鑒別法因?yàn)檠蚪q的鱗片層比羊毛鱗片層的薄，所以溶液更容易滲透到羊絨的纖維皮質(zhì)層中。與此同時，羊絨纖維的細(xì)度比羊毛更細(xì)，使得溶液能夠把整根纖維都滲透。故如果用同一種溶液對兩種纖維進(jìn)行處理，兩種纖維的卷曲變化會有差異。然后可以借助光學(xué)顯微鏡觀察這種差異。但是這種方法只適合對纖維的宏觀形態(tài)差異進(jìn)行鑒別,準(zhǔn)確度有限。五、基因分析法首先提取樣品的DNA，然后對各個樣品的DNA序列的差異進(jìn)行分析。在羊絨織物的分子鑒定中的應(yīng)用包括分子標(biāo)記法、探針雜交法以及特異性引物擴(kuò)增法。這種方法的準(zhǔn)確度很高，靈敏度好，同時客觀性比較強(qiáng)。但是目前最大的難點(diǎn)就是怎樣從羊絨中獲得高質(zhì)量的DNA。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對目前市場上羊絨產(chǎn)品造假嚴(yán)重的現(xiàn)象，本發(fā)明提供了一種羊絨織物的分子鑒定方法，用不同的方法從純羊絨及羊絨織物中提取到線粒體DNA(mtDNA)，利用根據(jù)設(shè)計出的cytB基因的特異性引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可以定性對羊絨分子進(jìn)行鑒定。一種羊絨織物的分子鑒定方法，包括以下步驟：(1)從羊絨織物中提取線粒體DNA(mtDNA)；(2)進(jìn)行cytB基因的PCR擴(kuò)增；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)暗條帶，則鑒定含有羊絨成分。羊絨織物包括純羊絨織物和非純羊絨織物，非純羊絨織物包括含有部分量羊絨的織物和不含有羊絨的織物。步驟(1)中，從羊絨織物中提取線粒體DNA(mtDNA)采用Biomega試劑盒法，Biomiga試劑盒包括DNA吸附柱、收集管、BL緩沖液、TL緩沖液、KB緩沖液、DNA洗滌液、洗脫緩沖液、蛋白酶K緩沖液，DNA洗滌緩沖液由DNA洗滌液經(jīng)乙醇稀釋得到；該方法具體包括：a.將羊絨織物樣品剪碎；b.加入TL緩沖液，蛋白酶K緩沖液，DTT(二硫蘇糖醇)，混勻均勻，然后溫育；步驟b中，所述的溫育的條件為：45℃～55℃溫育20～40min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的溫育的條件為：50℃溫育30min。c.加入BL緩沖液，混合均勻，再加入無水乙醇，混合均勻；d.將樣品移至DNA吸附柱中，包括沉淀，然后離心，倒掉液體；步驟d中，所述的離心的條件為：在9000～11000rpm條件下離心0.5～3min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：在10000rpm條件下離心1min。e.向吸附柱加入KB緩沖液，離心，倒掉液體，并將吸附柱重新放在收集管中；步驟e中，所述的離心的條件為：在9000～11000rpm條件下離心0.5～3min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：在10000rpm條件下離心1min。f.加入DNA洗滌緩沖液，離心，倒掉收集管中的液體，將吸附柱重新置于收集管中；步驟f中，所述的離心的條件為：在9000～11000rpm條件下離心0.5～3min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：在10000rpm條件下離心1min。g.加入DNA洗滌緩沖液，離心，倒掉收集管中的液體并丟棄收集管，打開吸附柱的蓋子，將其放置在新的收集管中；步驟g中，所述的離心的條件為：在9000～11000rpm條件下離心05～3min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：在10000rpm條件下離心1min。h.離心，使吸附柱中的液體蒸發(fā)；步驟h中，所述的離心的條件為：11000～15000rpm離心2-7min，進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：13000rpm離心4-5min注意：這一步要求吸附柱中的無水乙醇全部蒸發(fā)，以防其干擾DNA的含量和純度。i.將吸附柱放置在滅菌環(huán)境中，然后加入洗脫緩沖液，然后溫育；步驟i中，所述的洗脫緩沖液為60℃～80℃預(yù)熱的洗脫緩沖液。所述的溫育的條件為：60℃～80℃溫育1～5min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的洗脫緩沖液為70℃預(yù)熱的洗脫緩沖液。所述的溫育的條件為：70℃溫育3min。j.離心洗脫DNA，即為所得，得到線粒體DNA。步驟j中，所述的離心的條件為：9000～11000rpm離心0.5～3min。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的離心的條件為：10000rpm離心1min。步驟f和j中，所述的DNA洗滌緩沖液采用無水乙醇稀釋Biomega試劑盒中的DNA洗滌液得到。Biomega試劑盒能夠快速簡便的提取羊絨纖維的線粒體DNA。在提取過程中并沒有使用苯酚/氯仿的等有機(jī)溶劑，提取后的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行PCR。在提取過程中，樣品首先被裂解，DNA吸附在管內(nèi)的吸附柱上。然后用洗滌液可以有效的除去細(xì)胞碎片、色素和其他蛋白質(zhì)，然后用洗脫液洗脫，可以得到純的羊絨樣品的mtDNA。步驟(2)中，所述的cytB基因包括：羊絨的cytB基因的特異性引物，所述的羊絨的cytB基因的特異性引物為goat-cytb-3和goat-cytb-5，所述的goat-cytb-3為TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT，所述的goat-cytb-5為CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明設(shè)計出羊絨的cytB基因的特異性引物，goat-cytb-3為TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT，goat-cytb-5為CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC。本發(fā)明采用采用Biomega試劑盒法能夠很好地從樣品中提取線粒體DNA(mtDNA)，然后進(jìn)行cytB基因的PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳，能夠準(zhǔn)確地鑒定是否含有羊絨成分，準(zhǔn)確度高，并且，羊絨的最低檢出限的百分含量為7.3％，檢測效果好。附圖說明圖1為采用PCR儀法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖，其中，8—新疆羊絨(羊絨引物)，9—本色羊絨(羊絨引物)，10—本色羊絨(羊絨引物)，8’—新疆羊絨(羊毛引物)，9’—本色羊絨(羊毛引物)，10’—本色羊絨(羊毛引物)；圖2為1、2、4、5和7號樣品采用PCR儀法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖3為采用Promega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖4中(a)和(b)分別是采用Promega試劑盒法提取線粒體DNA后2號樣品濃縮6倍(a圖)和濃縮10倍(b圖)后PCR的條帶。圖5是采用Promega試劑盒法提取線粒體DNA后1號樣品濃縮10倍后PCR的條帶。圖6為9號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖7為1號和8號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖8為1號樣品和2號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后濃縮20倍以及9號樣品濃縮10倍后PCR的條帶；圖9為5、7、10號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后分別加入1μL模板以及2μL模板的PCR的條帶。具體實(shí)施方式1、實(shí)驗(yàn)器材1.1羊絨樣品表1羊絨樣品及含量樣品編號樣品類型具體成分重量百分含量(％)1織物羊絨26.6羊毛73.42織物羊絨92.3羊毛7.74織物羊絨8.5羊毛90.7其他纖維0.8(凈干)5織物羊絨7.5羊毛61.8兔毛30.7(含微量其他纖維)7織物羊絨7.3羊毛92.7(連結(jié)線除外)8散纖維新疆羊絨9散纖維羊絨(本色)10散纖維羊絨(本色)1.2實(shí)驗(yàn)材料表2主要試劑及生產(chǎn)廠家表3主要儀器及設(shè)備儀器名稱產(chǎn)家VS-1300潔凈工作臺蘇州市蘇信凈化設(shè)備廠立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠西門子電冰箱博西華家用電器有限公司AL204電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司VS-15000N臺式高速自動平衡離心機(jī)韓國制造CHB-100恒溫金屬浴杭州博日科技有限公司W(wǎng)H-861渦旋振蕩儀南京諾泰施格科學(xué)儀器有限公司DK-S24型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司YP5102電子天平上海光正醫(yī)療儀器有限公司MG-964基因擴(kuò)增儀杭州朗基科學(xué)儀器有限公司Bio-RadGelDocXR+凝膠呈像系統(tǒng)美國制造HE-120垂直電泳槽上海天能科技有限公司EPS-300電泳儀上海天能科技有限公司多用制膠器上海天能科技有限公司2、鑒定方法(1)從羊絨織物和羊絨纖維中提取線粒體DNA(mtDNA)；(2)進(jìn)行cytB基因的PCR擴(kuò)增；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。2.1mtDNA的提取方法一：PCR儀法(1)稱取一定量剪碎的羊絨，放入配置好的DNA提取液中。(2)在PCR擴(kuò)增儀上設(shè)置單個循環(huán)程序，然后將含羊絨和DNA提取液的PCR管在PCR擴(kuò)增儀上運(yùn)行該程序。(3)程序運(yùn)行結(jié)束后將PCR管瞬時離心,即為樣品。樣品置于-20℃保存。方法二：Promege試劑盒法Promega的DNAIQTM系統(tǒng)使用一種新的順磁性樹脂來純化DNA，該試劑盒中包含有DNA純化所需的高效裂解液。同時，有蛋白酶K的預(yù)處理協(xié)助樣品的裂解。除去樣品中的蛋白質(zhì)和其他成分，隨后用DNAIQTM系統(tǒng)對樣品中的DNA進(jìn)行純化。方法三：Biomega試劑盒法Biomega試劑盒能夠快速簡便的提取羊絨纖維的線粒體DNA。在提取過程中并沒有使用苯酚/氯仿的等有機(jī)溶劑，提取后的產(chǎn)物可以直接進(jìn)行PCR。在提取過程中，樣品首先被裂解，DNA吸附在管內(nèi)的吸附柱上。然后用洗滌液可以有效的除去細(xì)胞碎片、色素和其他蛋白質(zhì)，然后用洗脫液洗脫，可以得到純的羊絨樣品的mtDNA。2.2PCR擴(kuò)增PCR的整個技術(shù)過程經(jīng)若干個循環(huán)組成，一個循環(huán)包括連續(xù)的3個步驟：第1步變性：在高溫條件下，使DNA模板變性，即模板DNA在94℃的條件下變性解鏈；第2步退火：人工合成的寡核苷酸引物與模板DNA鏈的3’端經(jīng)在35℃條件下退火；第3步延伸：在4種dNTP底物在TaqDNA聚合酶的作用下，引物鏈將沿著5’—3’的方向延伸，形成與模板互補(bǔ)的新鏈。循環(huán)次數(shù)為30次。由于所加的引物是cytB基因的特異性引物，所以在PCR時加入羊絨的上下游引物就可以對羊絨織物和纖維進(jìn)行鑒定。2.3瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳可以得到羊絨的cytB基因的條帶，將其與Marker條帶進(jìn)行對比，并觀察其亮度，就可以得知其是否是羊絨的cytB基因。如果得到了羊絨的cytB基因，則可以確定該制品中含有羊絨。反之，不含羊絨成分。3實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3.1mtDNA的提取方法一：PCR儀法：(1)每份羊絨準(zhǔn)確稱取0.0001g，放入高壓滅菌后的PCR管中；(2)配置DNA提取液。每100μLDNA提取液包括10xPCR緩沖液10μL(PH8.4的Tris-HCl100mM；KCl500mM)、25mMMgCl28μL、10mg/mL的蛋白酶K2μL、用ddH2O(雙蒸水)補(bǔ)足體積至80μL；(3)每個裝入羊絨樣品的PCR管中加入50μL的DNA提取液；(4)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)程序?yàn)?5℃30min，95℃15min，4℃10min，單個循環(huán)；(5)程序運(yùn)行結(jié)束后，將PCR管進(jìn)行離心，所得即為樣品(置于-20℃保存)。方法二：Promega試劑盒法：(1)試劑配制表4Promega試劑盒法試劑配制方法(2)實(shí)驗(yàn)步驟a.將羊絨樣品充分剪碎，稱量5mg-10mg放入1.5mL離心管中。加入100μL1MDTT和75μL蛋白酶K儲存液。混勻，蓋緊管蓋，56℃溫育1h。要確保全部的樣品被溶液浸沒。注意：此步處理后的樣品可能并沒有完全溶解，但在下一步加入裂解緩沖液后將全部融化。b.在室溫25℃下向樣品中加入2倍體積的裂解緩沖液和7μL完全懸浮的DNAIQTM系統(tǒng)中的DNAIQTM樹脂。高速渦旋振蕩3s后室溫25℃溫育5min。注意：若裂解緩沖液溫育后仍有可見的發(fā)根殘留，可將殘留物去除，液體轉(zhuǎn)移至另一管中?；?qū)埩粑锉Ａ粼诠苤校鼈儾粫蓴_DNA的純化。c.高速渦旋振蕩2s，將管子放在大磁鐵上。磁分離立刻進(jìn)行。小心去除所有溶液，不要觸碰管壁上的樹脂。d.加入100μL裂解緩沖液，從磁鐵上取下管子，并高速渦旋振蕩2s。然后將管子放回磁鐵上，并去除所有的裂解液。e.加入100μL配制的1x洗滌液，從磁鐵上取下管子，并高速渦旋振蕩2s。然后將管子放回磁鐵上，并去除所有的洗滌液。f.重復(fù)e步驟，共洗滌三次，并確保在最后一次洗滌時，除去所有的液體。g.打開蓋子，將管子放在磁鐵上，空氣中干燥5min。然后加入20μL的洗脫液。注意：小的洗脫體積有助于獲得終濃度較高的DNA。干燥時間不要超過20min以免DNA難以洗脫。h.蓋上管蓋并高速渦旋振蕩2s，65℃溫育5min。然后取出溫育的管子，高速渦旋振蕩2s。立即放在磁鐵上。i.將DNA溶液小心的轉(zhuǎn)移到新的管子中，即為所得。方法三：Biomega試劑盒法(1)試劑配制表5Biomega試劑盒法試劑配制方法(2)實(shí)驗(yàn)步驟Biomiga試劑盒(提取羊絨DNA)，廠家：www.biomiga.com，型號：GD2512-01，Biomiga試劑盒包括以下成分及體積：a.將羊絨樣品剪碎，稱量0.005-0.01g樣品于1.5mL的離心管中；b.加入250μLTL緩沖液，25μL蛋白酶K緩沖液，20μL1MDTT。渦旋振蕩混勻。然后50℃溫育30min。注意：溫育過程中，每10min渦旋振蕩一次，幫助樣品溶解。c.向樣品中加入250μLBL緩沖液，渦旋振蕩混勻。再向樣品中加入250μL無水乙醇，渦旋振蕩混勻。d.將樣品移至DNA吸附柱中，包括沉淀，然后在10000rpm條件下離心1min。倒掉收集管中的液體并丟棄收集管。e.將吸附柱放置在一個新的收集管中，加入500μLKB緩沖液，10000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，并將吸附柱重新放在收集管中。f.加入650μLDNA洗滌緩沖液，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱重新置于收集管中。g.加入650μLDNA洗滌緩沖液，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的液體并丟棄收集管，打開吸附柱的蓋子，將其放置在新的收集管中。h.13000rpm離心4-5min，使吸附柱中的液體蒸發(fā)。注意：這一步要求吸附柱中的無水乙醇全部蒸發(fā)，以防其干擾DNA的含量和純度。i.將吸附柱放置在滅菌的1.5mL離心管中，然后加入100μL70℃預(yù)熱的洗脫緩沖液。然后70℃溫育3min。j.10000rpm離心1min，用DNA洗滌緩沖液洗脫DNA，即為所得。3.2PCR擴(kuò)增用vectorNIT設(shè)計出羊絨的cytB基因的特異性引物如下：goat-cytb-3TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT；goat-cytb-5CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC；羊毛：5’---cattgatctcccagctccatcaaatatt；3’--attgtcgcaaataggaggattactccg；羊駝：Alpaca-cytB-5cttctcttcagtcgcacacatctgc；Alpaca-cytB-3ggttttcaatgattcctgctactggcat；PCR反應(yīng)體系為：表6PCR反應(yīng)體系試劑體積10xPCRBuffer(withoutMgCl2)2.5μL25mMMgCl22μL16S(F)0.5μL(25μM)16S(R)0.5μL(25μM)dNTP0.5μL模板1.0μLTaq酶0.5μL加入ddH2O使體系調(diào)至25μL，簡單離心混勻。設(shè)置的循環(huán)條件為：94℃10min；94℃1min、35℃45s、72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。3.3瓊脂糖凝膠電泳稱取一定量的瓊脂糖，加入相應(yīng)的1xTAE緩沖溶液，微波加熱使其充分溶解。待溫度恢復(fù)至常溫時，加入微量EB溶液，然后倒入制膠器中，待其凝固。注意：倒膠時盡量不要有氣泡。將3μL的樣品與1μL的上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣，然后電泳。恒壓100V，時間35-40min。注意：點(diǎn)樣時動作要快，不要戳破膠孔，也不要讓樣品彌散在緩沖液中。3.4mtDNA的濃縮由于有些織物樣品中羊絨的百分含量較低，造成提取液中的DNA濃度低，使得電泳結(jié)果并不理想。所以在提取mtDNA后可以對其濃縮，從而提高DNA的濃度。a.將樣品離心，6000rpm，1min。b.放置在冰上，加入2倍無水乙醇或2/3倍異丙醇，然后在冰上放置20min左右，使DNA沉降。c.離心，12000rpm，3min，然后吸去上清液。d.將DNA沉淀干燥至完全，然后加入洗脫液，即為所得。4結(jié)果與分析4.1羊絨樣品8種樣品中都含有羊絨成分，8、9、10號樣品為純羊絨，其中8號樣品是未處理過的，9、10號樣品基本確定是未經(jīng)過化學(xué)處理過的。1、2、4、5、7號樣品是織物，都含有羊絨成分，具體含量見表1。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1PCR儀法經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表7。只有未經(jīng)過任何處理的8號樣品新疆羊絨有中等亮度的條帶出現(xiàn)，其他均無亮條帶出現(xiàn)。表7PCR儀法結(jié)果編號樣品類型條帶亮度1織物)_220151595(織物)_420151545(織物)_520151867(織物)_720152133(織物)_8新疆羊絨+++9本色羊絨_10本色羊絨_注：—無亮條帶+暗條帶++較暗條帶+++中等亮度條帶++++較亮條帶+++++明亮條帶圖1為采用PCR儀法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；注：8—新疆羊絨(羊絨引物)，9—本色羊絨(羊絨引物)，10—本色羊絨(羊絨引物)；8’—新疆羊絨(羊毛引物)，9’—本色羊絨(羊毛引物)，10’—本色羊絨(羊毛引物)。圖1中，8、9、10號樣品加入的引物是羊絨上下游引物，8’、9’、10’加入的引物是羊毛的上下游引物，由于8、9、10號樣品是純羊絨，所以8號樣品有中等亮度條帶出現(xiàn)，8’樣品無條帶出現(xiàn)，證明其有特異性。圖2為采用PCR儀法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖2中，所有樣品加入的均是羊絨引物，但并無條帶出現(xiàn)。PCR儀法主要適合于帶毛囊的樣品，而本實(shí)驗(yàn)樣品都不帶毛囊，故效果不佳。4.2.2Promega試劑盒法經(jīng)過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，使用該試劑盒提取的結(jié)果如下所示：表8Promega法結(jié)果注：—無亮條帶+暗條帶++較暗條帶+++中等亮度條帶++++較亮條帶+++++明亮條帶圖3為采用Promega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖3中，1—10號樣品PCR時模板加入1μL，1’—10’號樣品PCR時模板加入2μL。由圖可知，8號樣品新疆羊絨加入1μL模板出現(xiàn)明亮條帶，而加入2μL樣品無條帶出現(xiàn)。10號樣品本色羊絨加入1μL模板無條帶，而加入2μL樣品后出現(xiàn)暗條帶。因?yàn)樵跇悠分杏衅渌s質(zhì)，可能會影響酶的活性，模板加入的越多，則雜質(zhì)可能越多，因此會影響酶的活性，造成無條帶出現(xiàn)，由此可見，PCR時模板的加入量并不是越多越好。而濃縮過程中可能會造成DNA損傷，所以有時濃縮后無結(jié)果。圖4中(a)和(b)分別是2號樣品濃縮6倍(a圖)和濃縮10倍(b圖)后PCR的條帶，由圖可知，條帶清晰較明亮。圖5是1號樣品濃縮10倍后PCR的條帶，鑒于1號樣品中羊絨含量為26.6％，故將樣品1濃縮了10倍，可以看出條帶清晰較明亮：總體來講，Promega試劑盒法比PCR儀法更適合羊絨DNA的提取，提取結(jié)果較好，但如果織物中羊絨的百分含量較低，可以提取之后進(jìn)行濃縮，然后再PCR、電泳。電泳后引物二聚體現(xiàn)象較嚴(yán)重，可能是因?yàn)橥嘶饻囟忍蛯?dǎo)致。但是PCR過程的退火溫度為35℃，屬于較低的溫度，當(dāng)退火溫度升高之后進(jìn)行PCR，最后發(fā)現(xiàn)并無條帶出現(xiàn)。4.2.3Biomega試劑盒法經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，使用該試劑盒提取的結(jié)果如下所示：表9Biomega試劑盒法實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：—無亮條帶+暗條帶++較暗條帶+++中等亮度條帶++++較亮條帶+++++明亮條帶圖6為9號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖6中，9號樣品加入了1μL模板，出現(xiàn)亮條帶。圖7為1號和8號樣品采用Biomega試劑盒法提取線粒體DNA后經(jīng)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳得到的電泳結(jié)果圖；圖7中，1號和8號樣品都加入了1μL的模板，如圖可以看出，8號樣品出現(xiàn)明亮條帶，1號樣品條帶很暗，其他均無條帶。之后各樣品重新PCR，加入了2μL模板，但無條帶出現(xiàn)。由于織物樣品中羊絨百分含量大小不一，故將樣品進(jìn)行了濃縮,結(jié)果如下：圖8為1號樣品和2號樣品濃縮20倍以及9號樣品濃縮10倍后PCR的條帶。圖8中，1號樣品和2號樣品濃縮了20倍，出現(xiàn)了明亮的條帶。9號樣品濃縮了10倍，出現(xiàn)了明亮條帶。但均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，可能上樣時樣品漂了，可以增加上樣緩沖液的用量，小心加樣。圖9為5、7、10號樣品分別加入1μL模板以及2μL模板的PCR的條帶。圖9中，5、7、10號樣品加入了1μL模板，5’、7’、10’號樣品中加入了2μL模板，10號樣品出現(xiàn)明亮的條帶。7號樣品1μL模板有暗條帶，2μL模板無條帶，可能是模板中的其他雜質(zhì)影響了酶的活性。5號樣品1μL和2μL模板都有暗條帶，但同時出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增，可能是退火溫度低。之后對4、5、7號樣品進(jìn)行了40倍濃縮，并無條帶出現(xiàn)?？偟膩碚f，Biomega試劑盒法是三種方法中提取效果最好的方法，但是仍然會出現(xiàn)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，原因可能是因?yàn)槟０嬷泻须s蛋白，退火溫度過低，引物濃度過高，可以降低引物量，增加模板量，減少dNTP的濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度等。經(jīng)過多次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，8、9、10號純羊絨樣品利用Biomega試劑盒法都可以成功提取，之后進(jìn)行cytB基因的PCR擴(kuò)增，可以鑒定是羊絨成分。2號、1號織物樣品羊絨百分含量分別為92.3％、26.6％，用Biomega和Promega試劑盒法提取之后，進(jìn)行濃縮，也可以鑒定含有羊絨成分。5、7號織物樣品中羊絨的百分含量分別為7.5％、7.3％，用Biomega試劑盒法提取出了DNA，之后進(jìn)行濃縮，出現(xiàn)了暗條帶，基本可以鑒定含有羊絨成分。4號織物樣品羊絨的百分含量為8.5％，三種方法都沒有提取出DNA。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得知，通過Biomega試劑盒法，可以鑒定出樣品中含有羊絨的最低的百分含量為7.3％。當(dāng)前第1頁1 2 3