本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及ANKRD1基因在舌鱗癌的診斷、治療中的用途。

背景技術(shù)：

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，以鱗癌最為常見，居口腔癌之首。舌癌多發(fā)生于舌的中三分之一側(cè)緣，惡性程度較高，局部浸潤性強(qiáng)，常累及舌肌，使舌運(yùn)動(dòng)受限，影響講話、進(jìn)食以及吞咽功能。盡管在治療方面取得了較大的進(jìn)展，但是舌癌病人的存活率在過去近幾十年內(nèi)并沒有明顯的提高。

目前研究表明，吸煙、飲酒等化學(xué)因素、人乳頭(狀)瘤病毒(human papilloma virus，HPV)以及遺傳因素改變與舌癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。雖然研究者們已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)近幾十個(gè)瘤基因或抑瘤基因參與了舌癌的發(fā)生和發(fā)展，但到目前為止，舌癌發(fā)病的分子機(jī)制還未能明確，可能還存在其它腫瘤相關(guān)基因參與了舌癌的發(fā)病過程。因此，如果能尋找到舌癌特異性相關(guān)基因，這將有助于闡明舌癌發(fā)病的分子機(jī)制，也將為舌癌的診斷、治療和預(yù)后提供分子靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測ANKRD1基因或蛋白表達(dá)差異來診斷舌鱗癌的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測ANKRD1基因或蛋白表達(dá)差異來預(yù)測舌鱗癌預(yù)后的方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過抑制ANKRD1基因或ANKRD1蛋白來治療舌鱗癌的方法。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療舌鱗癌的藥物的方法。

本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療舌鱗癌的藥物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的產(chǎn)品在制備舌鱗癌診斷工具中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測舌鱗癌預(yù)后工具中的用途。

進(jìn)一步，所述檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的產(chǎn)品包括檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合ANKRD1基因的核酸或者能夠結(jié)合ANKRD1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ANKRD1基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測ANKRD1蛋白的表達(dá)水平。

本發(fā)明的檢測ANKRD1基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、熒光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、高通量測序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來獲得。

進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS(Amplification Refractory Mutation System，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增的核酸可以通過使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。

上面所述的核酸包括擴(kuò)增ANKRD1基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò)增它來制備。

本發(fā)明的檢測ANKRD1蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、Western印跡等。

本發(fā)明的檢測ANKRD1蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合ANKRD1蛋白的抗體或其片段?？梢允褂萌魏谓Y(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)(雙抗體)、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測ANKRD1蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。

抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免疫動(dòng)物后，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的ANKRD1蛋白或其部分對獲得的抗體實(shí)施抗原特異性純化來獲得針對ANKRD1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實(shí)施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實(shí)施。例如，可以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMSO、緩沖劑、等準(zhǔn)備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH(DojindoLaboratories)；堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories)；過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2，B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH(DojindoLaboratories)；熒光標(biāo)記試劑盒諸如熒光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒(Invitrogen Corporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標(biāo)記的抗體或其片段。

作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來自受試者的組織。

在本發(fā)明中，“預(yù)后”是指腫瘤患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過程或結(jié)果。在本說明書中，預(yù)后可以是通過手術(shù)處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久時(shí)的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可以通過檢查生物標(biāo)志物即ANKRD1蛋白或編碼ANKRD1蛋白的基因來預(yù)測。預(yù)后預(yù)測可以這樣進(jìn)行：根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無，或者升高或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。

在本發(fā)明中，“預(yù)后良好”是指在通過手術(shù)處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之后，患者長時(shí)期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘?，預(yù)后好可以意指在這樣長時(shí)間內(nèi)存活、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)、或無再發(fā)。例如，預(yù)后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如本文中所使用的，“預(yù)后良好”還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉(zhuǎn)移，但是惡性低且不嚴(yán)重地影響生存能力。

在本發(fā)明中，“預(yù)后不良”是指患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短時(shí)期(例如1、2、3、4、5年或更短)內(nèi)發(fā)生致命狀況。或者，預(yù)后差是指在這樣的短時(shí)期里死亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、或再發(fā)。例如，預(yù)后差可以意指至少3年或尤其至少5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或死亡。

預(yù)測預(yù)后是指預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能以100％的準(zhǔn)確度預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果。預(yù)測預(yù)后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的水平升高的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。

進(jìn)一步，所述檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的產(chǎn)品可以是檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺(tái)。

本發(fā)明還提供了一種診斷舌鱗癌的工具，所述工具能夠檢測ANKRD1基因或ANKRD1蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合ANKRD1基因的核酸或者能夠結(jié)合ANKRD1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ANKRD1基因的表達(dá)水平；所述物質(zhì)能夠檢測ANKRD1蛋白的表達(dá)水平。

進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進(jìn)一步，所述診斷舌鱗癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺(tái)；高通量測序平臺(tái)是一種特殊的診斷舌鱗癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知ANKRD1基因的異常與舌鱗癌相關(guān)也屬于ANKRD1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種預(yù)測舌鱗癌預(yù)后的工具，所述預(yù)測舌鱗癌預(yù)后工具包括能夠結(jié)合ANKRD1基因的核酸或者能夠結(jié)合ANKRD1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測ANKRD1基因的mRNA水平；所述物質(zhì)能夠檢測ANKRD1蛋白的表達(dá)水平。

進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進(jìn)一步，所述預(yù)測舌鱗癌預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺(tái)；高通量測序平臺(tái)是一種特殊的診斷舌鱗癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知ANKRD1基因的異常與舌鱗癌相關(guān)也屬于ANKRD1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗ANKRD1抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合ANKRD1即可。

本發(fā)明還提供了一種診斷舌鱗癌或預(yù)測舌鱗癌預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取受試者的樣品；

(2)檢測受試者樣品中ANKRD1基因或蛋白的表達(dá)水平；

(3)將測得的ANKRD1基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。

(4)與對照相比，ANKRD1基因或蛋白的表達(dá)水平升高，則該受試者被診斷為舌鱗癌，或該受試者被確定為預(yù)后不良。

本發(fā)明還提供了ANKRD1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療舌鱗癌的藥物中的應(yīng)用。所述抑制劑包括抑制ANKRD1基因表達(dá)的試劑、和/或抑制ANKRD1基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。

進(jìn)一步，所述抑制ANKRD1基因表達(dá)的試劑包括抑制基因轉(zhuǎn)錄的試劑、抑制基因翻譯的試劑；所述抑制ANKRD1基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括抑制ANKRD1基因mRNA的試劑、抑制ANKRD1蛋白的試劑。所述抑制ANKRD1基因mRNA的試劑包括抑制mRNA穩(wěn)定性的試劑、抑制mRNA翻譯活性的試劑。所述抑制ANKRD1蛋白的試劑包括抑制ANKRD1蛋白穩(wěn)定性的試劑、抑制ANKRD1蛋白活性的試劑、抑制ANKRD1蛋白功能的試劑。

進(jìn)一步，抑制ANKRD1基因mRNA的試劑包括針對ANKRD1基因mRNA的雙鏈核糖核酸；抑制ANKRD1蛋白功能的試劑包括ANKRD1抗原蛋白的腫瘤疫苗、抑制ANKRD1蛋白功能的抗體。所述抗體可以是多克隆抗體，或是單克隆抗體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述針對ANKRD1基因mRNA的雙鏈核糖核酸是siRNA。為了確保ANKRD1基因能夠被高效剔除或沉默，根據(jù)ANKRD1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了siRNA特異性片段。siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)已發(fā)表的通用設(shè)計(jì)原則(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通過在線工具完成設(shè)計(jì)，該在線工具為：siRNASelectionProgram of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004 Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。為了進(jìn)一步提高siRNA片斷的有效性，綜合兩個(gè)在線設(shè)計(jì)工具的優(yōu)點(diǎn)來設(shè)計(jì)用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源性比對(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi干擾的脫靶效應(yīng)。

優(yōu)選地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本發(fā)明還提供了一種用于治療舌鱗癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所述的ANKRD1基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑。

本發(fā)明的藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體，其中該載體可為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結(jié)合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、表面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩(wěn)定劑、著色劑或香料其中之一或兩者以上的混合。

本發(fā)明的藥物組合物可用于制造治療舌鱗癌的藥劑。

本發(fā)明的藥物組合物首選應(yīng)用于哺乳動(dòng)物，其中該哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人類病患。

本發(fā)明的藥物組合物可例如以口服、注射等方式給予至該人類病患體內(nèi)。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療舌鱗癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提到治療的成功率。

本發(fā)明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細(xì)胞添加測試藥物后或在對腫瘤模型動(dòng)物施用測試藥物后的某個(gè)時(shí)期測量ANKRD1基因或者ANKRD1蛋白的表達(dá)水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預(yù)后的效果。更具體地說，當(dāng)ANKRD1基因或者ANKRD1蛋白的表達(dá)水平在添加或施用測試藥物后降低或者恢復(fù)正常水平時(shí)，可選擇該藥物作為改善腫瘤預(yù)后的治療藥物。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了ANKRD1基因表達(dá)與舌鱗癌相關(guān)，通過檢測受試者組織中ANKRD1的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有舌鱗癌、或者判斷受試者是否存在患有舌鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。

在基因水平上進(jìn)行口腔癌的早期診斷已經(jīng)成為了口腔癌領(lǐng)域的發(fā)展趨勢，申請?zhí)枮椋?01611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2專利文獻(xiàn)均披露了可以用于口腔癌或者舌鱗癌診斷的基因標(biāo)志物，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-ANKRD1基因，能夠?qū)崿F(xiàn)舌鱗癌的早期診斷，從而降低舌鱗癌的死亡率。

附圖說明

圖1顯示利用RT-PCR檢測ANKRD1基因在舌鱗癌組織與正常組織中的表達(dá)差異圖；

圖2顯示利用Western blot檢測ANKRD1蛋白在舌鱗癌組織與正常組織中的表達(dá)差異圖；

圖3顯示利用Western blot檢測siRNA對ANKRD1基因表達(dá)的抑制效果圖；

圖4顯示ANKRD1基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞增殖的影響圖；

圖5顯示ANKRD1基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞遷移的影響圖；

圖6顯示ANKRD1基因表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞成瘤的影響圖。

具體的實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1 ANKRD1基因的差異表達(dá)

1、實(shí)驗(yàn)材料

5例舌鱗癌組織標(biāo)本取自口腔頜面外科手術(shù)病人，其中，高分化鱗癌2例，中分化鱗癌2例，低分化鱗癌1例；包括男性2例，女性3例。同時(shí)，選取每一例癌組織癌腫周圍>5cm處正常組織為自身對照。所有患者就診前均未經(jīng)過化療、放療、生物治療及其它針對腫瘤的治療。取材后一部分組織立即放入液氮中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2、RNA提取、cDNA合成

Trizol RNA試劑(Invitrogen公司)抽提總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)(ND-1000,NanoDrop公司)和瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA；按照Qiagen公司說明書,經(jīng)RNeasy MinElute Cleanup Kit純化得到mRNA；mRNA經(jīng)Poly-A RNA Controlkit(Affymetrix公司)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，并純化；

3、生物素標(biāo)記cRNA雜交

以cDNA為模板,應(yīng)用MessageAmpTM II-Biotin Arna Amplification Kit(Ambion公司)體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記cRNA，純化后按Affymetrix公司的真核生物表達(dá)譜單輪芯片擴(kuò)增程序加入5×片段化緩沖液得到大小分布在35～200nt的片段化cRNA；靶標(biāo)制備完成后,應(yīng)用真核生物Hybridization Control Kit(Affymetrix公司)配制雜交液,注入雜交液的芯片平衡放置于雜交爐中,45℃,60r/min旋轉(zhuǎn)雜交16h(Hybridization Oven 640,Affymetrix公司)，然后在Affymetrix公司提供的洗滌工作站中(Fluidics Station 450，Affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；

4、掃描和分析

應(yīng)用 Scanner 3000(Affymetrix公司)掃描儀掃描圖像。掃描圖像首先用 Operating Software Version1.4(GCOS 1.4,Affymetrix公司)軟件進(jìn)行圖像到信號(hào)值的轉(zhuǎn)換,轉(zhuǎn)換成原始數(shù)據(jù)文件。然后使用軟件dChip 2006中的invariant set Normalization方法和Model-base ExpressionIndex模型對GCOS輸出結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。根據(jù)在各芯片中檢測到的P值，當(dāng)數(shù)據(jù)集的檢測值Call值(Absolute Call,Abs Call)為不存在A(Absent)或者臨界值M(Marginal)時(shí),被視為不表達(dá),只有Abs Call值為存在P(present)的數(shù)據(jù)集才被用于進(jìn)一步的分析。

5、組織差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因的篩選利用Significant Analysis of Microarray Software(SAM)算法進(jìn)行。

6、結(jié)果

芯片共篩選出859個(gè)差異表達(dá)基因。與正常組織相比，舌鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?17個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因?yàn)?42個(gè)。

實(shí)施例2 差異表達(dá)基因在大樣本中的驗(yàn)證

1、研究對象

按照實(shí)施例1的方法收集舌鱗癌組織標(biāo)本45例，正常組織標(biāo)本50例。

2、RNA提取和cDNA合成

按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行RNA提取和cDNA合成。

3、RT-PCR

引物是由引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)，大連寶生物公司與上海英駿公司合成。ANKRD1基因及內(nèi)參基因所用引物序列如下：

ANKRD1基因引物序列

5’-AGACAGAGAAGGAGATAC-3’(SEQ ID NO.1)，

5’-GCCATACATAATCAGGAG-3’(SEQ ID NO.2)；

GAPDH基因引物序列

5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’(SEQ ID NO.3)，

5’-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3’(SEQ ID NO.4)。

取1μl cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃變性，5min；95℃30s,58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后于1％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察，VDS凝膠成像儀上照相。利用凝膠圖像分析軟件Bandleader分析得出ANKRD1基因和GAPDH PCR產(chǎn)物條帶吸收光度值，然后計(jì)算ANKRD1基因和GAPDH吸收光度值的相對比值，用以表示目的基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。

4、細(xì)胞總蛋白的提取

按照EpiQuik全細(xì)胞提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。

5、Western blot檢測

總蛋白用Brandford法定量，取適量與樣品緩沖液混合煮沸5min，冷卻5min；取30pg蛋白上樣到制備好的15％聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳，開始設(shè)為80V恒壓，看見Marker后增加至120V；將電泳后的膠取出，使用Bio.Rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于100V轉(zhuǎn)移50min；轉(zhuǎn)膜完畢后，用1xPBS洗一次，浸入封閉液，40℃過夜；倒掉封閉液，加入Western洗滌液洗滌5-10min，加入一抗搖床室溫雜交2h；按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋于封閉緩沖液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL試劑顯影、定影檢測蛋白表達(dá)。

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將ANKRD1蛋白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖1和圖2所示，與正常組織相比，舌鱗癌組織中ANKRD1的表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

實(shí)施例3 ANKRD1基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞增殖能力的測定

1、干擾ANKRD1基因表達(dá)

1.1 siRNA合成

根據(jù)ANKRD1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成siRNA序列siRNA-ANKRD1：

正義鏈為5’-ACAAACAUCUGGAUUGUUCUU-3’(SEQ ID NO.5)；

反義鏈為5’-GAACAAUCCAGAUGUUUGUGA-3’(SEQ ID NO.6)，

以上siRNA序列與陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)(陰性對照組siRNA與ANKRD1基因的序列無同源性)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2 舌鱗癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人舌鱗癌細(xì)胞株HN4培養(yǎng)于含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞放在含5％CO₂的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞以2×10⁵/孔接種于6孔板，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，貼壁過夜，待細(xì)胞匯合達(dá)80-90％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前更換為不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。用250μl DMEM/F12稀釋siRNA(終濃度為33nM)，輕輕吹吸3-5次混勻。輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用250μl DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋5μl脂質(zhì)體2000，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔細(xì)胞板中，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。細(xì)胞板置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6h換含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。

1.3 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測siRNA-ANKRD1的干擾效率

步驟同實(shí)施例2。

結(jié)果如圖3所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ANKRD1的細(xì)胞中ANKRD1蛋白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2、MTT實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞增殖活性

將已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞24h后接種于96孔板，1×10³個(gè)/孔，分別在24、48、72、96h時(shí)間點(diǎn)加入20μL MTT(5mg/mL)溶液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；孵育箱培養(yǎng)4h后，小心吸去培養(yǎng)液，每孔再加入150μL DMSO；酶標(biāo)儀檢測590nm處吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ANKRD1組細(xì)胞增殖緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANKRD1基因表達(dá)促進(jìn)了舌鱗癌細(xì)胞的增殖。

實(shí)施例4 ANKRD1基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的測定

1、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞24h后用胰酶消化吹打并充分重懸為單細(xì)胞懸液后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)稀釋至5×10⁶個(gè)/mL，接種于6孔板中，置于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后棄去培養(yǎng)液，用滅菌槍頭在6孔培養(yǎng)板底部單層細(xì)胞的中央劃出一劃痕，洗去死細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別于0、24、48h拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

采用DMEM/F12將Matrigel稀釋(1∶6)，加入至Transwell小室上室，100μL/孔，細(xì)胞孵育箱放置2h，在下室加入1mL含10％PBS的DMEM培養(yǎng)基，在上室加入1×10⁶個(gè)/ml的轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞懸液200μL，常規(guī)培養(yǎng)24h后，取出Transwell小室，用棉簽輕柔擦去上室的Matrigel，PBS小心沖洗，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，再用PBS洗去多余的結(jié)晶紫染液，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

遷移實(shí)驗(yàn)：如圖5所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ANKRD1組細(xì)胞遷移數(shù)少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

侵襲實(shí)驗(yàn)：在結(jié)晶紫染色后正置顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)為(65±5)個(gè)，轉(zhuǎn)染siRNA-ANKRD1組穿膜細(xì)胞數(shù)(21±2)。

實(shí)施例5 ANKRD1基因的表達(dá)對舌鱗癌細(xì)胞成瘤能力的測定

平板克隆實(shí)驗(yàn)

取已經(jīng)轉(zhuǎn)染siRNA的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用胰酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，使細(xì)胞在含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中稀釋至1000個(gè)/mL并接種于培養(yǎng)皿中，輕輕搖動(dòng)使細(xì)胞均勻，放入孵箱2～3周。經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)鏡下可見的30～50個(gè)細(xì)胞的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4％的多聚甲醛固定15min。去除固定液，加適量的結(jié)晶紫染色10～30min，再用流水洗凈，空氣干燥。顯微鏡下計(jì)數(shù)＞30個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率(％)＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100％。

結(jié)果如圖6所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNA-ANKRD1組細(xì)胞克隆形成率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120> ANKRD1作為舌鱗癌的診治靶標(biāo)

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agacagagaa ggagatac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccatacata atcaggag 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaggtcggag tcaacggatt tg 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccatgggtgg aatcatattg gaa 23

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

acaaacaucu ggauuguucu u 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaacaaucca gauguuugug a 21