本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是Ehrlich(1947)分離出來(lái)的一種廣譜抗生素。由于其低廉的價(jià)格和穩(wěn)定的抗菌性，曾在一段時(shí)間內(nèi)作為飼料添加劑和獸醫(yī)臨床常用藥品。但氯霉素有嚴(yán)重的毒副作用，能引起再生障礙性貧血癥和嬰兒灰色綜合癥。美國(guó)和歐共體已禁止在動(dòng)物中使用氯霉素，并規(guī)定在動(dòng)物源食品中不得檢出，且這種不得檢出的低限已達(dá)到0.01μg/kg。目前，我國(guó)動(dòng)物源食品中氯霉素殘留仍很嚴(yán)重，出口的水產(chǎn)品、蜂蜜屢屢被檢出氯霉素殘留。為保障人民的身體健康，迫切需要建立靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡(jiǎn)便易行的檢驗(yàn)方法。

氯霉素檢測(cè)方法包括微生物法、色譜法、免疫測(cè)定法。微生物法易操作、費(fèi)用低，但靈敏度低、特異性差。色譜法精確可靠、靈敏度高，檢測(cè)極限可達(dá)到0.1μg/kg，但前處理步驟多，回收率偏低。免疫測(cè)定具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、對(duì)儀器設(shè)備和人員素質(zhì)要求低以及樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大規(guī)模樣品篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種氯霉素半抗原及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種氯霉素半抗原，其分子結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的氯霉素半抗原的制備方法，包括以下步驟：步驟1，取氯霉素，加入叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)、咪唑和無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，室溫反應(yīng)完全，純化，得到TBS-氯霉素，其分子結(jié)構(gòu)式如式(2)所示，其中氯霉素、TBSCl、咪唑和無(wú)水DMF的用量比為：1g︰700-800mg︰300-500mg︰3-7mL；步驟2，取TBS-氯霉素，加入二氯甲烷溶解，加入丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺，室溫反應(yīng)完全，純化，得到含琥珀?；?TBS-氯霉素，其分子結(jié)構(gòu)式如式(3)所示，其中TBS-氯霉素、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的用量比為：0.9746g︰0.81-0.83g︰0.24-0.26g︰100-300μL；；步驟3，取含琥珀酰基-TBS-氯霉素，加入吡啶、乙腈和40％HF，冰浴冷卻后，室溫反應(yīng)完全，純化，得到權(quán)利要求1所述的氯霉素半抗原，其中含琥珀?；?TBS-氯霉素、吡啶、乙腈和40％HF的用量比為：954.94mg︰2-4mL︰5-7mL︰1.5-2mL；；

優(yōu)選地，上述步驟(1)中，氯霉素、TBSCl、咪唑和無(wú)水DMF的用量比為：1g︰750mg︰400mg︰5mL。

優(yōu)選地，上述步驟(2)中TBS-氯霉素、丁二酸酐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的用量比為：0.9746g︰0.8236g︰0.2514g︰200μL。

優(yōu)選地，上述步驟(3)中含琥珀?；?TBS-氯霉素、吡啶、乙腈和40％HF的用量比為：954.94mg︰3mL︰6mL︰1.780mL。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種氯霉素抗原，由本發(fā)明第一個(gè)方面所述的氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，其分子結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種制備如本發(fā)明第三個(gè)方面所述的氯霉素抗原的方法，包括以下步驟：步驟a，取權(quán)利要求1所述的氯霉素半抗原，加入無(wú)水二甲基甲酰胺混勻后，加入二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫反應(yīng)過(guò)夜，其中，氯霉素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.09-0.15mmol︰0.09-0.15mmol；步驟b，離心，取溶液，將溶液緩慢加入載體蛋白溶液中，所用載體蛋白的量按照半抗原與載體蛋白的摩爾比15-40︰1計(jì)；步驟c，反應(yīng)完全后，透析，得到氯霉素抗原。

優(yōu)選地，上述步驟a中，氯霉素半抗原、二環(huán)己基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的用量比為：0.09mmol︰0.1mmol︰0.1mmol。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種氯霉素抗體，由本發(fā)明第三個(gè)方面所述的氯霉素抗原免疫動(dòng)物制備得到。

本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供由本發(fā)明第五個(gè)方面所述的氯霉素抗體制備的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒。

本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供本發(fā)明第一個(gè)方面所述的氯霉素半抗原或本發(fā)明第三個(gè)方面所述的氯霉素抗原在制備氯霉素抗體中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個(gè)方面是提供本發(fā)明第五個(gè)方面所述的氯霉素抗體或本發(fā)明第六個(gè)方面所述的氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測(cè)動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的氯霉素半抗原既最大程度地保留了氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又通過(guò)化學(xué)合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-COOH，合成方法簡(jiǎn)單，純度、產(chǎn)率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動(dòng)物免疫的抗原體系免疫動(dòng)物，所得抗體的效價(jià)、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒，使用方便、檢測(cè)成本低、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、快速、可同時(shí)檢測(cè)大批量的樣本，適于動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的氯霉素半抗原在氯霉素的檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

附圖說(shuō)明

圖1為氯霉素半抗原合成路線圖。

圖2為氯霉素半抗原核磁共振氫譜圖。

圖3為氯霉素ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：氯霉素半抗原的合成

步驟1：

1、稱取1g氯霉素于100mL的圓底玻璃瓶中，往其中分別加入750mg叔丁基二甲基氯硅烷(TBS-Cl)、400mg咪唑和5mL無(wú)水二甲基甲酰胺(DMF)。選擇合適大小的小磁石置于圓底玻璃瓶中，用錫箔紙封好瓶口。將圓底玻璃瓶放在磁力攪拌器上，調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)數(shù)，室溫?cái)嚢?。同時(shí)用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全，此反應(yīng)可在1h內(nèi)反應(yīng)完全，且此過(guò)程的最適展開劑為乙酸乙酯：正己烷：乙酸＝7:3:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后，用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液，將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL 0.1M HCl，手動(dòng)搖晃5min，將其固定在鐵架臺(tái)上靜置10min，釋放下層溶液于小燒杯中，上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣，用10mL飽和NaCO₃和10mL飽和NaCl對(duì)分液漏斗中的有機(jī)相進(jìn)行依次洗滌。經(jīng)三次洗滌后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用20mL乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行反提，棄去下層，合并上層有機(jī)相于錐形瓶。往錐形瓶中加入適量無(wú)水NaSO₄進(jìn)行干燥，無(wú)水NaSO₄結(jié)塊即可。

3、取干凈的200mL的圓底玻璃瓶，稱量可得瓶?jī)糁?63.7041g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶，用少量的乙酸乙酯多次潤(rùn)洗錐形瓶，并將潤(rùn)洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃，轉(zhuǎn)數(shù)60)，未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶和反應(yīng)產(chǎn)物重165.3077g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含TBS-氯霉素)的質(zhì)量為1.6036g。

4、純化反應(yīng)產(chǎn)物。往圓底玻璃瓶中加入8mL甲醇溶液溶解樣品，待完全溶解后吸450μL于2mL離心管中，再往離心管中加入約1500μL的甲醇溶液，混勻后進(jìn)行跑大板純化。此過(guò)程使用的展開劑為乙酸乙酯：正己烷：乙酸＝70:30:1。跑完大板后，刮下含藥品的硅膠粉部分，碾碎，置于燒杯中。往燒杯中加入適宜的乙酸乙酯攪拌，放在超聲儀上超聲10min，同樣的步驟，直至洗下所有的藥品(通過(guò)點(diǎn)小板來(lái)檢測(cè)是否還有藥品)。用濾膜過(guò)濾所有的洗脫液于圓底玻璃瓶，空瓶重：163.6041g，將圓底玻璃瓶置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋干。旋干后得到的圓底玻璃瓶重(含藥品)：164.5787g。此時(shí)，純化后的反應(yīng)產(chǎn)物的量為0.9746g。

步驟2：

1、用4mL二氯甲烷溶解上述步驟所得的產(chǎn)物，吸取303.7μL于2mL離心管中，用氮?dú)獯蹈桑饪?，置?℃保存。圓底玻璃瓶所剩的900mg轉(zhuǎn)移至新的100mL的圓底玻璃瓶中，瓶?jī)糁貫椋?11.4161g，再用6mL二氯甲烷分批次潤(rùn)洗干凈轉(zhuǎn)移。往圓底玻璃瓶中分別加入0.8236g丁二酸酐、0.2514g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、200μL三乙胺。選擇合適大小的小磁石置于圓底玻璃瓶中，用錫箔紙封好瓶口。將圓底玻璃瓶放在磁力攪拌器上，調(diào)節(jié)適宜的轉(zhuǎn)數(shù)，室溫?cái)嚢?。同時(shí)用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全，此反應(yīng)約在6h內(nèi)反應(yīng)完全，且此過(guò)程的最適展開劑為乙酸乙酯：二氯甲烷：乙酸＝6:4:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后，用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液，將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL飽和NH₄Cl，手動(dòng)搖晃5min，將其固定在鐵架臺(tái)上靜置10min，釋放下層溶液于小燒杯中，上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣，再用10mL飽和NH₄Cl對(duì)分液漏斗中的有機(jī)相再一次洗滌。經(jīng)兩次洗滌后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用20mL乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行反提，棄去下層，合并上層有機(jī)相于錐形瓶中。往錐形瓶中加入適量無(wú)水NaSO₄進(jìn)行干燥，無(wú)水NaSO₄結(jié)塊即可。

3、取干凈的200mL圓底玻璃瓶，稱量可得瓶?jī)糁?63.6046g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶中，用少量的乙酸乙酯多次潤(rùn)洗錐形瓶，并將潤(rùn)洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃，轉(zhuǎn)數(shù)60)，未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶(含反應(yīng)產(chǎn)物琥珀?；?TBS-氯霉素)重164.6587g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含琥珀?；?TBS-氯霉素)的量為1.0541g。

步驟3：

1、用2mL甲醇溶液溶解樣品，吸取100μL于2mL離心管中，用氮?dú)獯蹈?，封口，置?℃保存。剩余部分樣品置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，稱量得藥品重量為954.94mg。往樣品中分別加入3mL吡啶、6mL乙腈、1.780mL 40％HF，整個(gè)加樣過(guò)程，圓底玻璃瓶應(yīng)置于冰盒中，冰浴冷卻,。待冷卻后將圓底玻璃瓶置于磁力攪拌器上，放入適宜大小的磁力攪拌子，調(diào)節(jié)適宜轉(zhuǎn)數(shù)，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。轉(zhuǎn)天早晨用薄層色譜法(TLC)跟蹤原料反應(yīng)完全，此反應(yīng)約在9.5h內(nèi)反應(yīng)完全，且此過(guò)程的最適展開劑為乙酸乙酯：二氯甲烷：乙酸＝7:3:0.1。

2、薄層色譜法監(jiān)控反應(yīng)完全后，用量筒量取50mL乙酸乙酯稀釋反應(yīng)液，將稀釋后的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。往分液漏斗中加入10mL 0.1M HCl，手動(dòng)搖晃5min，將其固定在鐵架臺(tái)上靜置10min，釋放下層溶液于小燒杯中，上層有機(jī)相留在分液漏斗。同樣，再用10mL 0.1M HCl、10mL飽和NaCl、10mL飽和NaCl對(duì)分液漏斗中的有機(jī)相進(jìn)行依次洗滌。經(jīng)四次洗滌后，將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，燒杯中的水相轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用20mL乙酸乙酯對(duì)其進(jìn)行反提，棄去下層，合并上層有機(jī)相于錐形瓶中。往錐形瓶中加入適量無(wú)水NaSO4進(jìn)行干燥，無(wú)水NaSO4結(jié)塊即可。

3、取干凈的圓底玻璃瓶，稱量可得瓶?jī)糁?63.5687g。將錐形瓶中的有機(jī)相轉(zhuǎn)移至該圓底玻璃瓶中，用少量的乙酸乙酯多次潤(rùn)洗錐形瓶，并將潤(rùn)洗液合并到圓底玻璃瓶中置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干(水浴溫度為40℃，轉(zhuǎn)數(shù)60)，未完全旋干則用氮吹儀氮吹至完全干燥。稱量可得圓底玻璃瓶(含反應(yīng)產(chǎn)物琥珀?；?氯霉素)重164.1727g。其中反應(yīng)產(chǎn)物(含琥珀?；?氯霉素)的量為0.604g。

4、因?yàn)楫a(chǎn)物不純，含兩種物質(zhì)，所以通過(guò)使用柱層析技術(shù)將不同組分分離開。濕法裝柱，硅膠高度約為30cm，硅膠上層裝入約0.5cm的無(wú)水硫酸鈉，防止添加溶劑時(shí)使得樣品層不再整齊。裝柱完備后，在柱子上端使用加壓泵進(jìn)行加壓，使得柱子更結(jié)實(shí)。再用展開劑(乙酸乙酯：二氯甲烷：乙酸＝7:3:0.1)“走柱子”。將樣品用少量的展開劑溶解后上樣。上樣完畢接著用同樣的展開劑洗脫，用錐形瓶接洗脫液，將不同組分分離開，分離的過(guò)程通過(guò)點(diǎn)小板來(lái)確定樣品是否洗脫及分別收集。將收集好的樣品過(guò)濾，除去一同洗下的硅膠后，轉(zhuǎn)移至干凈的圓底玻璃瓶，旋干并稱重。最先洗脫出的物質(zhì)，旋干并氮吹后所得質(zhì)量為351.9mg。后洗脫出的產(chǎn)物，旋干并氮吹后所得質(zhì)量為280.6mg。

實(shí)施例2：氯霉素半抗原的鑒定

取上述實(shí)施例1的產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，如圖2所示，核磁共振數(shù)據(jù)如下，說(shuō)明半抗原合成成功：

1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.29(s,1H),8.57(dd,J＝25.4,8.9Hz,1H),8.35-7.91(m,1H),7.61(dd,J＝14.3,8.8Hz,1H),6.45(d,J＝3.6Hz,1H),5.02(s,1H),4.24(dd,J＝7.5,4.9Hz,2H),3.59(s,1H),3.49-3.13(m,3H),2.76(s,1H),2.09(s,3H)。

實(shí)施例3：氯霉素抗原

向0.09mmol所述琥珀?；让顾匕肟乖屑尤?.6ml的無(wú)水DMF，混勻后，加入0.1mmol的DCC和0.1mmol的NHS活化半抗原上的羧基基團(tuán)，攪拌反應(yīng)過(guò)夜后，離心去沉淀，將溶液平均分為三份，分別逐滴加入到不同的載體蛋白溶液中，所述載體蛋白為BSA，OVA，KLH等，所述溶解蛋白的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或硼酸鹽緩沖液，所用蛋白的量按照半抗原與蛋白的摩爾比15-40︰1計(jì)算。待羧基活化的半抗原與蛋白分子上的氨基偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)夜后，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到半透膜中，使用10mM的pH7.2的PBS緩沖液于4℃透析3-5天，得到包被原，經(jīng)紫外鑒定，氯霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。將透析完畢的溶液按照所用載體蛋白的量用PBS稀釋成1mg/ml。

實(shí)施例4：抗血清制備

將1mg/ml的氯霉素-KLH或氯霉素-BSA作為免疫原與等體積的弗氏佐劑混合攪拌乳化，首次免疫用弗氏完全佐劑，以后免疫使用弗氏不完全佐劑，每間隔10至15天對(duì)小鼠免疫一次，第三次免疫后小鼠眼眶采血檢測(cè)血清效價(jià)和抗體特異性。

實(shí)施例5：血清效價(jià)及抗體特異性檢測(cè)

將1mg/ml的氯霉素-OVA包被原使用碳酸鹽緩沖液稀釋合適的倍數(shù)后，加入到96孔酶標(biāo)板中于37℃包被3小時(shí)，將氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品使用樣品稀釋液(PBS中含有0.1％的吐溫20和明膠)稀釋后，每孔加入50ul，以樣品稀釋液作為非抑制孔對(duì)照，隨后加入經(jīng)過(guò)樣品稀釋液稀釋合適倍數(shù)的血清，于37℃溫浴30min后，洗脫，再加入羊抗鼠酶標(biāo)二抗反應(yīng)30min，洗脫酶標(biāo)二抗后，加入含有OPD或TMB的底物緩沖液顯色5-10min，于酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

本發(fā)明以氯霉素-OVA作為包被原，氯霉素-KLH作為免疫原所獲得的抗血清，所建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，抑制中濃度為9ng/ml。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。