本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說是涉及一種重組酵母菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在世界范圍內(nèi)，隨著經(jīng)濟(jì)水平和對健康需求的提高，食品的安全性、營養(yǎng)性和功能性受到越來越多的關(guān)注，因此功能性營養(yǎng)化學(xué)品已成為發(fā)展趨勢，代表當(dāng)代食品發(fā)展的新潮流，具有廣闊的市場前景。番茄紅素是一種脂溶性天然食用色素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于類胡蘿卜素，具備極強(qiáng)的抗氧化能力，是近年來國際上功能食品成分研究的熱點(diǎn)。

番茄紅素的制備主要依賴植物提取、化學(xué)合成和微生物合成，前兩種方法各有其自身的不足，微生物合成則以低成本、高產(chǎn)量和產(chǎn)品安全性，被認(rèn)為是最有前途的方法。目前，在微生物合成番茄紅素的研究中，所采用的宿主菌主要集中于大腸桿菌與釀酒酵母。釀酒酵母作為公認(rèn)的安全模式微生物，相比大腸桿菌，它的菌體維生素、蛋白質(zhì)含量高，可作食用、藥用和飼料酵母；相比三孢布拉氏霉菌，它的生長周期更短且更易培養(yǎng)。因此，實(shí)現(xiàn)番茄紅素在釀酒酵母中的高產(chǎn)將會在類胡蘿卜素產(chǎn)業(yè)化上展現(xiàn)極大的競爭力。

釀酒酵母和番茄紅素合成路徑間的適配是目前研究的主要方向。一方面異源生物合成路徑本身的代謝通量決定目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量，因此需要優(yōu)化異源路徑，包括優(yōu)化異源基因的表達(dá)、基因來源的篩選、胞內(nèi)前體物質(zhì)供給等；另一方面來自宿主細(xì)胞固有的代謝和調(diào)控系統(tǒng)也會影響目標(biāo)生物合成路徑的生產(chǎn)能力，這就需要對底盤細(xì)胞進(jìn)行深入系統(tǒng)的優(yōu)化。

在釀酒酵母中，基因ALD6(由ALD6啟動子控制)編碼乙醛脫氫酶，催化細(xì)胞質(zhì)中的乙醛生成乙酸?；駻LD6的表達(dá)水平會直接影響細(xì)胞中乙酸的積累，但尚未有任何該基因可影響番茄紅素產(chǎn)量的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組酵母菌株，使得該重組菌株在用于發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素時(shí)能夠提高產(chǎn)量，可以應(yīng)用到相關(guān)番茄紅素制備領(lǐng)域中。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種重組酵母菌株，該菌株為發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的酵母菌株，并且其ALD6啟動子表達(dá)強(qiáng)度被下調(diào)。

目前酵母菌株ALD6啟動子功能的研究僅局限在乙酸積累方面，而其他方面的功能并未有相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明針對目前現(xiàn)狀，從多方面對ALD6啟動子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ALD6啟動子表達(dá)強(qiáng)度下調(diào)能夠增加生產(chǎn)番茄紅素的酵母菌株的產(chǎn)量。

本發(fā)明所述所述ALD6啟動子表達(dá)強(qiáng)度被下調(diào)為直接敲除ALD6啟動子或采用表達(dá)強(qiáng)度低于ALD6啟動子的其他啟動子替換。在本發(fā)明中，表達(dá)強(qiáng)度低于ALD6啟動子的其他啟動子選擇為URA3啟動子，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所述酵母菌株為釀酒酵母，可選自CEN.PK系列釀酒酵母，如釀酒酵母CEN.PK2-1C或釀酒酵母CEN.PK2-1D或釀酒酵母CEN.PK2，也可選自BY系列釀酒酵母，如BY4741釀酒酵母或BY4742釀酒酵母或BY4743釀酒酵母。

酵母菌株本身不具備生產(chǎn)番茄紅素的能力，缺少部分酶，需要構(gòu)建外源基因元件導(dǎo)入其中成為生產(chǎn)菌株。在本發(fā)明中導(dǎo)入了經(jīng)酵母自身同源重組整合到其基因組上的如下基因片段：

酵母trp1位點(diǎn)上游同源序列、CYC1終止子、三孢布拉氏霉菌(Blakeslea trispora)來源的crtI、GAL10啟動子、GAL1啟動子、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的crtB、PGK1終止子、酵母trp1位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段1；

酵母leu2位點(diǎn)上游同源序列、LEU2標(biāo)記、TDH2終止子、ACT1終止子、截短的HMG-CoA還原酶基因tHMGR1、GAL10啟動子、GAL1啟動子、成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的crtE、GPM1終止子、酵母leu2位點(diǎn)下游同源序列順次拼接而成的基因片段2。

上述兩個基因片段的構(gòu)建方式記錄在專利CN105087406A中，其中本發(fā)明基因片段1即為CN105087406A中的基因片段1，而本發(fā)明基因片段2是在CN105087406A中的基因片段2基礎(chǔ)上，采用成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的crtE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

此外，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，本發(fā)明所述重組酵母菌株采用釀酒酵母CEN.PK2-1C，其為四重營養(yǎng)缺陷型(亮氨酸、色氨酸、組氨酸、尿嘧啶)釀酒酵母，利于篩選正確菌株，同時(shí)為了保證釀酒酵母不消耗誘導(dǎo)劑半乳糖，本發(fā)明敲除了釀酒酵母中的gal1、gal7和gal10三個基因，上述的這些對酵母的改動只是為了方便驗(yàn)證試驗(yàn)的進(jìn)行，對最終效果的實(shí)現(xiàn)無影響。

采用本發(fā)明所述重組釀酒酵母進(jìn)行番茄紅素的搖瓶試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在相同的番茄紅素生產(chǎn)菌株前提下，直接敲除ALD6啟動子或采用較低表達(dá)強(qiáng)度的啟動子替換的生產(chǎn)菌株，其番茄紅素的產(chǎn)量得到顯著提高。因此，本發(fā)明提出了所述重組酵母菌株在制備番茄紅素中的應(yīng)用或在生產(chǎn)以番茄紅素為中間產(chǎn)物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

同時(shí)，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的方法，將本發(fā)明所述重組酵母菌株接種到種子培養(yǎng)基中活化至對數(shù)生長中期，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。

在具體實(shí)施方式中，所述方法為將本發(fā)明所述重組酵母菌株接種于5mL種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)14-16h，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.2轉(zhuǎn)接于新鮮的25mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.5分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。

其中，所述種子培養(yǎng)基優(yōu)選為包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨以及10g/L酵母浸粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選包括20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉以及10g/L D-半乳糖。

由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明通過對酵母菌株ALD6啟動子的深入研究，發(fā)現(xiàn)通過全部敲除或以低表達(dá)強(qiáng)度啟動子替換等下調(diào)ALD6啟動子表達(dá)強(qiáng)度的方式構(gòu)建生產(chǎn)番茄紅素的重組菌株，能夠顯著該生產(chǎn)菌株的番茄紅素產(chǎn)量，可作為今后酵母工程菌合成路徑的優(yōu)化手段，構(gòu)建出產(chǎn)能更加優(yōu)異的重組工程菌。

附圖說明

圖1所示為對照番茄紅素生產(chǎn)菌株、敲除ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株、以URA3啟動子替換ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株在20g/L葡萄糖培養(yǎng)基中的番茄紅素產(chǎn)量；其中，縱坐標(biāo)為番茄紅素產(chǎn)量，橫坐標(biāo)為三種菌株在本發(fā)明中的編號，從左至右依次對應(yīng)于對照番茄紅素生產(chǎn)菌株、敲除ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株、以URA3啟動子替換ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株；

圖2所示為對照番茄紅素生產(chǎn)菌株、敲除ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株、以URA3啟動子替換ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株在40g/L葡萄糖培養(yǎng)基中的番茄紅素產(chǎn)量；其中，縱坐標(biāo)為番茄紅素產(chǎn)量，橫坐標(biāo)為三種菌株在本發(fā)明中的編號，從左至右依次對應(yīng)于對照番茄紅素生產(chǎn)菌株、敲除ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株、以URA3啟動子替換ALD6啟動子的番茄紅素生產(chǎn)菌株。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開了一種重組酵母菌株及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述菌株和應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述菌株和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明基因片段1和2中的各基因元件、同源序列等均以釀酒酵母菌株BY4741的基因組為模板，設(shè)計(jì)并合成合適的引物，通過PCR擴(kuò)增得到，具體可參照專利CN105087406A中的記載。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1：本發(fā)明所述重組酵母菌株

1、番茄紅素生產(chǎn)菌株的構(gòu)建

以釀酒酵母CEN.PK2-1C為出發(fā)菌株，按照CN105087406A中實(shí)施例1方法敲除gal1、gal7和gal10三個基因，然后按照CN105087406A中實(shí)施例3和實(shí)施例4的方法構(gòu)建基因片段1和2，在構(gòu)建基因片段2時(shí)采用采用成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)來源的crtE，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

然后按照CN105087406A中實(shí)施例7的方法將基因片段1和2經(jīng)過同源重組整合到釀酒酵母中，獲得生產(chǎn)番茄紅素的酵母菌株，命名為SyBE_Sc14C07。

2、本發(fā)明所述重組酵母菌株的構(gòu)建

在SyBE_Sc14C07基礎(chǔ)上，參照CN105087406A中實(shí)施例1敲除ypl062w的敲除方法對ALD6啟動子進(jìn)行敲除，區(qū)別在于所用上下游同源序列ALD6啟動子的同源序列，所用模塊為ALD6LHA(上游同源序列)-KanMX-ALD6RHA(下游同源序列)，獲得本發(fā)明所述重組酵母菌株，命名為SyBE_Sc14C66；

在SyBE_Sc14C07基礎(chǔ)上，構(gòu)建ALD6LHA、URA3啟動子(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)、KanMX和ALD6RHA順次拼接的基因片段，表示為ALD6LHA-P_URA3-KanMX-ALD6RHA，通過同源重組將ALD6啟動子用URA3啟動子替換，獲得本發(fā)明所述重組酵母菌株，命名為SyBE_Sc14C67。

實(shí)施例2：搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)

以實(shí)施例1中的SyBE_Sc14C07、SyBE_Sc14C66、SyBE_Sc14C67三株菌株為試驗(yàn)對象，按照如下方法進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)：

將菌株接種于5mL種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)14-16h，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.2轉(zhuǎn)接于新鮮的25mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，以初始菌體濃度OD₆₀₀＝0.5分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素。

其中，所述種子培養(yǎng)基為20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨以及10g/L酵母浸粉；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為20g/L或40g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉以及10g/L D-半乳糖。

番茄紅素檢測方法：發(fā)酵48小時(shí)后，取兩等份的發(fā)酵液，4000g離心2min收集菌體，并水洗兩次。將其中一份菌體置于80℃烘干至恒重，稱重計(jì)算細(xì)胞干重；另一份菌體用以產(chǎn)物提取，具體方法為：用3N HCl重懸細(xì)胞，置于沸水浴中煮沸2min，然后立即冰浴3min；將破碎的細(xì)胞12000rpm、4℃離心4min棄上清，水洗2次后加入丙酮，并渦旋5min；最后離心收集丙酮相，用2μm濾膜過濾后上紫外液相檢測，番茄紅素檢測波長為471nm。

結(jié)果見圖1和圖2，可以明顯看出，本發(fā)明所述重組酵母菌株在番茄紅素的產(chǎn)量上得到顯著提升，而對照的菌株產(chǎn)量較低，兩者之間的差別在于ALD6啟動子表達(dá)強(qiáng)度被下調(diào)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學(xué)

<120> 一種重組酵母菌株及其應(yīng)用

<130> MP1701703

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggtttctg gttctaaggc tggtgtctca ccacacaggg agattgaggt catgaggcag 60

tctattgacg atcacttggc tggtttgttg cctgagactg actctcagga cattgtctca 120

ttggcaatga gggagggtgt catggctcca ggtaagagga taaggccttt gttgatgttg 180

ttggcagcta gggacttgag gtaccagggt tctatgccta ctttgttgga cttggcttgc 240

gctgtcgaat tgactcacac tgcatcattg atgttggacg acatgccttg catggacaac 300

gcagaattaa ggaggggtca gccaacaaca cacaagaagt tcggtgagtc agtcgcaatt 360

ttggcatcag ttggtttgtt atcaaaggct ttcggattga ttgctgcaac tggtgactta 420

ccaggtgaga ggagggcaca ggctgtcaac gagttgtcta ctgctgtcgg agtccaggga 480

ttggtcttgg gtcagttcag ggacttgaac gacgcagctt tggacaggac tccagacgct 540

atattgtcta caaaccactt aaagacagga attttgttct ctgctatgtt gcagatagtc 600

gctattgcat ctgcttcttc tccatctaca agggagactt tgcacgcttt cgcattggac 660

ttcggtcagg ctttccagtt gttggacgac ttgagggacg atcacccaga gacaggaaag 720

gacaggaaca aggatgcagg taaatcaact ttggtcaaca ggttaggtgc agacgctgct 780

aggcagaagt taagggagca cattgactct gctgacaagc acttgacttt cgcttgccca 840

cagggaggtg ctattaggca gttcatgcac ttgtggttcg gtcaccactt agctgactgg 900

tcacctgtca tgaagatagc ttaa 924

<210> 2

<211> 236

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagtgcacca taccaccttt tcaattcatc attttttttt tattcttttt tttgatttcg 60

gtttccttga aatttttttg attcggtaat ctccgaacag aaggaagaac gaaggaagga 120

gcacagactt agattggtat atatacgcat atgtagtgtt gaagaaacat gaaattgccc 180

agtattctta acccaactgc acagaacaaa aacctgcagg aaacgaagat aaatcc 236