本發(fā)明涉及微生物菌株擴培和乙醇發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種擴培酵母菌的方法及其應(yīng)用和發(fā)酵乙醇的方法。
背景技術(shù)：
由于化石能源的不可再生性，且面臨資源日益枯竭的現(xiàn)狀，利用可再生材料(例如含纖維素的生物質(zhì)原料)進行液體燃料的開發(fā)越來越受到關(guān)注。在將含纖維素的原料進行預處理和酶解獲得可利用的發(fā)酵糖后，如何將這些糖類轉(zhuǎn)化為液體燃料(如乙醇)是整個轉(zhuǎn)化路線上的關(guān)鍵點。
現(xiàn)有的技術(shù)中，主要通過微生物發(fā)酵的方法，將可利用的糖，如木糖、葡萄糖、纖維二糖、甘露糖等轉(zhuǎn)化為乙醇。其中，這樣的微生物包括：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、樹干畢赤酵母(Pichia stipitis)、休哈塔假絲酵母(Candida shehatae)、酒香酵母(Brettanomyces naardenensis)、纖細假絲酵母(Candida tenuis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、賽溝畢赤酵母(Pichia segobiensis)、多動擬桿菌(Bacteroides polypragmatus)、菊歐文氏桿菌(Erwinia chrysanthem)、植物克雷伯桿菌(Klebsiella planticola)、嗜熱厭氧乙醇菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)、球狀螺旋體(Spirochaeta coccoides sp.)、植物發(fā)酵梭菌(Clostridium phytofermentas sp.)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)、燕麥鐮刀菌(Fusarium avenaceum)、運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)以及重組釀酒酵母(S.cerevisiae)、重組運動發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、重組大腸桿菌(Escherichia coli)等。
其中，較常用的是采用釀酒酵母將含纖維素原料的酶解液轉(zhuǎn)化為乙醇。從葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇的生化過程是簡單的，通過釀酒酵母，使反應(yīng)在30℃條件下進行，就可以將葡萄糖發(fā)酵為燃料乙醇。但半纖維素水解產(chǎn)物是以木糖為主的五碳糖，故木糖的發(fā)酵效率是決定過程經(jīng)濟性的重要因素，木糖的存在對纖維素酶水解有抑制作用，將木糖及時轉(zhuǎn)化為乙醇對木質(zhì)纖維素原料的高效率乙醇發(fā)酵是非常重要的。在此過程中，酵母菌株的擴培對木糖轉(zhuǎn)化為乙醇的效率有重要影響。
酵母生長一般有延滯期、對數(shù)生長期和生長停滯期三個時期，發(fā)酵接種時間應(yīng)最好控制在酵母細胞對數(shù)生長期的后期、生長停滯期前期，此時酵母細胞數(shù)量可達最大，且酵母出芽率最高、死亡率最低，接種后能夠迅速增殖并有利于發(fā)酵進程。
在現(xiàn)有方法中，進行酵母菌擴培時均采用糖化醪液為原料，且通常采取的方法包括間歇擴培或連續(xù)擴培。但是，前述的擴培方法存在如下缺陷：第一方面，擴培中容易造成雜菌污染，且設(shè)備投資強度大；第二方面，難以有效控制得到的酵母菌的數(shù)量，往往導致過培養(yǎng)(擴培的培養(yǎng)液中酵母菌數(shù)至少為3億/ml)，造成發(fā)酵時相當量的糖類用于酵母菌體本身代謝，從而導致用于乙醇發(fā)酵的糖類利用率較低；第三方面，由此得到的酵母菌的活力(主要體現(xiàn)為發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率)較低。因此，針對現(xiàn)有的五碳糖發(fā)酵菌株，如何選用擴培方式、培養(yǎng)條件以適應(yīng)大生產(chǎn)條件、并能高效利用五碳糖(主要為木糖)發(fā)酵乙醇是一個重要問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種擴培酵母菌的方法及其應(yīng)用和發(fā)酵乙醇的方法，本發(fā)明的擴培酵母菌的方法，不僅能夠有效控制酵母菌的數(shù)量，而且得到的酵母菌的活力較高，能夠明顯提高發(fā)酵 時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
為了實現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種擴培酵母菌的方法，所述方法包括：在無菌條件下，以液化醪液為原料，對活化的酵母菌依次進行間歇擴培和連續(xù)擴培，其中，連續(xù)擴培的實施方式包括：間歇擴培結(jié)束后，以相同的體積流量同時流入液化醪液和流出培養(yǎng)液，所述體積流量為(0.1-0.6)V/h，所述V為間歇擴培結(jié)束時得到的培養(yǎng)液的體積。
第二方面，本發(fā)明提供了上述方法在乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用。
第三方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乙醇的方法，所述方法包括：利用擴培的酵母菌進行發(fā)酵，其中，在發(fā)酵前，采用本發(fā)明的上述方法進行酵母菌的擴培。
本發(fā)明的擴培酵母菌的方法，一方面，避免了傳統(tǒng)擴大培養(yǎng)中雜菌污染、設(shè)備投資強度大的缺陷；另一方面，能夠獲得足夠量的菌體以轉(zhuǎn)化糖產(chǎn)生乙醇，且從微觀上來看，擴培得到的酵母具有足夠的活性從而保證單個細胞轉(zhuǎn)化糖的效率，從宏觀上來看，酵母種群中絕大部分的酵母具有足夠活力，或者不具有活力的酵母占比較低。其中，經(jīng)本發(fā)明的擴培酵母菌的方法得到的培養(yǎng)液中酵母數(shù)為1.8-2.4億/ml，酵母出芽率為25-40％，死亡率為0-5％，而且得到的酵母菌的活力較高，能夠明顯提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。
具體實施方式
以下對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細說明。應(yīng)當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
第一方面，本發(fā)明提供了一種擴培酵母菌的方法，所述方法包括：在無菌條件下，以液化醪液為原料，對活化的酵母菌依次進行間歇擴培和連續(xù)擴 培，其中，連續(xù)擴培的實施方式包括：間歇擴培結(jié)束后，以相同的體積流量同時流入液化醪液和流出培養(yǎng)液，所述體積流量為(0.1-0.6)V/h，所述V為間歇擴培結(jié)束時得到的培養(yǎng)液的體積。
本發(fā)明中，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，(0.1-0.6)V/h是指每小時流入的液化醪液和流出的培養(yǎng)液的體積為間歇擴培結(jié)束時得到的培養(yǎng)液的體積的10-60％。
本發(fā)明中，對于液化醪液沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種液化醪液，為了能夠更加有效地控制酵母菌的數(shù)量，并進一步提高得到的酵母菌的活力，優(yōu)選情況下，液化醪液的DE值為50-120，進一步優(yōu)選為50-80。更進一步優(yōu)選地，液化醪液中含有0.2-1g/L的磷酸二氫鉀和0.2-1g/L的氮源，氮源再更進一步優(yōu)選為氨水、碳酸氫銨、花生餅粉、黃豆餅粉和尿素中的一種或多種。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，液化醪液為玉米液化醪液和/或木薯液化醪液。
本發(fā)明中，對于制備上述液化醪液的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，優(yōu)選情況下，液化醪液的制備方法包括：將淀粉原料粉碎后依次進行水熱處理和固液分離處理，其中，水熱處理的條件包括：溫度為75-85℃，pH值為4.5-5，時間為3-4h。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，水熱處理能夠使淀粉糊化-液化，并破壞細胞，形成均一的液化醪液。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，淀粉原料為玉米和/或木薯。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，液化醪液的制備方法還包括：向固液分離處理得到的產(chǎn)物中加入液化酶進行液化處理，其中，以制備液化醪液用的淀粉原料的重量為基準，液化酶的加入量為0.1-0.3重量‰；進一步優(yōu)選地，液化醪液的制備方法還包括向液化處理得到的產(chǎn)物中加入磷酸二氫鉀和氮源，其中，以液化處理得到的產(chǎn)物的體積為基準，磷酸二氫鉀的加入量為0.2-1g/L，氮源的加入量為0.2-1g/L。其中，對于液化處理的條件沒有特別的限定，可 以為本領(lǐng)域常用的各種條件，優(yōu)選情況下，液化處理的條件包括：溫度為90-110℃、pH值為5-7，時間為0.2-2h。
本發(fā)明中，對于活化酵母菌的方法沒有特別的限定，可以為本領(lǐng)域常用的各種方法，例如可以為：先將實驗室在YPDA平板上保存的酵母菌接種至裝有YPDA液體培養(yǎng)基的搖瓶中，28-32℃、100-200rpm下培養(yǎng)至酵母數(shù)為1.6-1.8億/ml，然后以5-10體積％的接種量將培養(yǎng)液接種至裝有新鮮的YPDA液體培養(yǎng)基的搖瓶中，28-32℃、200-300rpm下培養(yǎng)至酵母數(shù)為1.8-2.4億/ml，得到活化的酵母菌液。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，間歇擴培的實施方式包括：以在間歇擴培過程中待加入的液化醪液的總體積為基準，先加入40-60體積％的液化醪液，然后以4-10體積％的接種量接種酵母數(shù)為1.8-2.4億/ml的活化的酵母菌液，待將培養(yǎng)液中的酵母數(shù)培養(yǎng)至1.8-2億/ml時，加入剩余體積的液化醪液并將培養(yǎng)液中的酵母數(shù)培養(yǎng)至1.8-2.2億/ml。
優(yōu)選地，剩余體積的液化醪液的加入方式包括：在5min-6h內(nèi)以流加方式加入剩余體積的液化醪液，進一步優(yōu)選地，向剩余體積的液化醪液中加入糖化酶，并在5min-6h內(nèi)加入含有糖化酶的剩余體積的液化醪液，其中，以制備間歇擴培過程中待加入的全部液化醪液用的淀粉原料的重量為基準，糖化酶的加入量為0.1-0.3重量‰。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，在間歇擴培過程中，培養(yǎng)條件包括：溫度為28-32℃，進一步優(yōu)選為28-30℃；通氣量為0.08-0.2VVM，進一步優(yōu)選為0.1-0.15VVM；pH自然，進一步優(yōu)選為5-6。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，通氣量的單位VVM是指以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積(V/V·min)，pH自然為在培養(yǎng)過程中可以不需要調(diào)節(jié)pH。
本發(fā)明中，為了能夠更加有效地控制酵母菌的數(shù)量，并進一步提高得到的酵母菌的活力，優(yōu)選情況下，體積流量為(0.1-0.4)V/h，進一步優(yōu)選為 (0.2-0.4)V/h。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，連續(xù)擴培的培養(yǎng)條件包括：溫度為28-32℃，進一步優(yōu)選為28-30℃；通氣量為0.08-0.2VVM，進一步優(yōu)選為0.1-0.15VVM；pH自然，進一步優(yōu)選為5-6。
本發(fā)明的方法不僅可以為發(fā)酵提供大量的酵母菌株，而且能夠有效地控制酵母的生長時期，保持酵母數(shù)最多，出芽率最高。在加入剩余體積的液化醪液前，培養(yǎng)液中的酵母數(shù)為1.8-2億/ml，酵母出芽率為35-38％，死亡率為5％以下。經(jīng)本發(fā)明的擴培酵母菌的方法得到的培養(yǎng)液中酵母數(shù)為1.8-2.4億/ml，酵母出芽率為25-40％，死亡率為0-5％。
第二方面，本發(fā)明提供了上述方法在乙醇發(fā)酵中的應(yīng)用。
第三方面，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵乙醇的方法，所述方法包括：利用擴培的酵母菌進行發(fā)酵，其中，在發(fā)酵前，采用本發(fā)明的上述方法進行酵母菌的擴培。本發(fā)明的方法適用于以含纖維素的生物質(zhì)原料的酶解液為發(fā)酵培養(yǎng)基進行的乙醇發(fā)酵過程，尤其適用于以木質(zhì)纖維素的酶解液為發(fā)酵培養(yǎng)基進行的乙醇發(fā)酵過程，因此，優(yōu)選情況下，發(fā)酵的培養(yǎng)基為含纖維素的生物質(zhì)原料的酶解液，進一步優(yōu)選為木質(zhì)纖維素的酶解液。為了提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率，優(yōu)選地，酶解液中含有0.1-0.5g/L的尿素和0.2-0.8g/L的磷酸二氫鉀。
本發(fā)明中，優(yōu)選情況下，發(fā)酵的條件包括：溫度為28-32℃，進一步優(yōu)選為28-30℃；pH為4.5-6，進一步優(yōu)選為5-5.5；時間為36-72小時，進一步優(yōu)選為40-60小時。
為了進一步提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率，優(yōu)選地，在發(fā)酵的前24h內(nèi)通入空氣，通氣量為0.01-0.08VVM，更進一步優(yōu)選為0.02-0.05VVM。
實施例
以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，如為特別說明，使用的試劑或材料均可商購獲得，使用的方法均為本領(lǐng)域常用的方法。
酵母為普渡大學的改造后釀酒酵母，具有同時代謝五碳糖和六碳糖的能力，酵母具體改造的方法詳見參考文獻Ho NW,Chen Z,Brainard AP(1998)Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effective cofermentation of glucose and xylose.Appl Environ Microbiol 64:1852–1859。
糖化酶、液化酶均購自諾維信公司。
活化酵母菌的方法為：先將酵母菌接種至裝有100ml YPDA液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，30℃、200rpm下培養(yǎng)至酵母數(shù)為1.6億/ml，然后以5體積％的接種量將培養(yǎng)液接種至裝有100ml新鮮的YPDA液體培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，30℃、200rpm下培養(yǎng)至酵母數(shù)為2.0億/ml，得到活化的酵母菌液。
木質(zhì)纖維素原料的酶解方法為：木質(zhì)纖維素經(jīng)預處理后進行酶解，酶解條件包括：溫度為50℃，pH為5.0，時間為72h，以預處理得到的產(chǎn)物中含有的纖維素的重量為基準，每克纖維素對應(yīng)加入的纖維素酶的量為10酶活力單位，得到酶解液，其中，纖維素酶購自諾維信公司。然后以酶解液的體積為基準，向酶解液中加入0.4g/L的尿素和0.6g/L的磷酸二氫鉀，混合均勻，得到實驗用木質(zhì)纖維素的酶解液。
糖醇轉(zhuǎn)化率的計算公式為：糖醇轉(zhuǎn)化率＝[(C乙-C乙0時刻)/0.511/(C葡+C木)]*100％，其中，C乙為發(fā)酵液中的乙醇含量，C乙0時刻為發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中的乙醇含量，C葡為發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中的葡萄糖含量，C木為發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中的木糖含量。
木糖消耗率的計算公式為：木糖消耗率＝[(C木0時刻-C木)/C木0時刻]*100％，其中，C木0時刻為發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中的木糖含量，C木為發(fā)酵液中的木糖含量。
實施例1
(1)制備玉米液化醪液：以2.5kg玉米為原料，進行粉碎，然后在80℃、pH值為4.8的條件下水熱處理3h，再進行過濾，得到10L玉米液化醪濾液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)為基準，向玉米液化醪濾液中加入0.2重量‰的液化酶進行液化處理，液化處理的條件包括：溫度為105℃、pH值為6.5，時間為0.5h。最后以液化處理得到的產(chǎn)物的體積為基準，向液化處理得到的產(chǎn)物中加入0.5g/L的磷酸二氫鉀和0.5g/L尿素，混合均勻，得到10L玉米液化醪液，經(jīng)測定，玉米液化醪液的DE值為75。
(2)無菌條件下，先在10L種子罐中加入3L玉米液化醪液，然后以5體積％的接種量將活化的酵母菌液接種至種子罐中進行培養(yǎng)，將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為1.9億/ml時(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為36％，死亡率為0)，在6h內(nèi)以流加方式向種子罐中加入添加有糖化酶的3L玉米液化醪液(相對于制備6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量為0.2重量‰)，進行培養(yǎng)，待將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為2億/ml時停止培養(yǎng)(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為38％，死亡率為0)，此時種子罐中種子液的體積為6L。
其中，步驟(2)中，所有的培養(yǎng)條件包括：溫度為30℃，通氣量為0.1VVM，用氨水將pH調(diào)節(jié)為5.5。
(3)在間歇培養(yǎng)結(jié)束進行連續(xù)擴培，包括：在間歇培養(yǎng)結(jié)束后的種子罐中以1.8L/h的體積流量同時流入新鮮的玉米液化醪液和流出種子液至30L發(fā)酵罐中，其中，連續(xù)擴培的培養(yǎng)條件包括：溫度為30℃，pH值為5.5，通氣量為0.1VVM。經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.0億/ml，酵母出芽率約為38％，死亡率為0。
(4)在裝有18L木質(zhì)纖維素的酶解液的30L發(fā)酵罐中，利用流入的擴培的酵母菌進行發(fā)酵，其中，發(fā)酵的條件包括：在發(fā)酵的前24h內(nèi)通入空氣，通氣量為0.04VVM，溫度為30℃，pH為5.0，攪拌槳的轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā) 酵60小時結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液的體積為19.8L。
通過液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。其中，液相色譜儀(型號為Aglient1260，購自安捷倫科技有限公司)，色譜柱為伯樂HPX-87H(300mm×7.8mm×9μm)，流動相為0.005mol/L H2SO4，流速為0.6ml/min，柱溫箱為65℃。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為64g/L，木糖含量為3g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為92.09％，木糖消耗率為90.625％。
實施例2
(1)制備玉米液化醪液：以2.5kg玉米為原料，進行粉碎，然后在85℃、pH值為4.5的條件下水熱處理3.5h，再進行過濾，得到10L玉米液化醪濾液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)為基準，向玉米液化醪濾液中加入0.1重量‰的液化酶進行液化處理，液化處理的條件包括：溫度為95℃、pH值為6.5，時間為1.5h。最后以液化處理得到的產(chǎn)物的體積為基準，向液化處理得到的產(chǎn)物中加入0.8g/L的磷酸二氫鉀和0.3g/L碳酸氫銨，混合均勻，得到10L玉米液化醪液，經(jīng)測定，玉米液化醪液的DE值為70。
(2)無菌條件下，先在10L種子罐中加入2.4L玉米液化醪液，然后以8體積％的接種量將活化的酵母菌液接種至種子罐中進行培養(yǎng)，將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為1.8億/ml時(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為37％，死亡率為0)，在6h內(nèi)以流加方式向種子罐中加入添加有糖化酶的3.6L玉米液化醪液(相對于制備6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量為0.1重量‰)，進行培養(yǎng)，待將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為2.1億/ml時停止培養(yǎng)(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為36％，死亡率為0)，此時種子罐中種子液的體積為6L。
其中，步驟(2)中，所有的培養(yǎng)條件包括：溫度為29℃，通氣量為0.12VVM，用氨水將pH調(diào)節(jié)為5.2。
(3)在間歇培養(yǎng)結(jié)束進行連續(xù)擴培，包括：在間歇培養(yǎng)結(jié)束后的種子罐中以1.2L/h的體積流量同時流入新鮮的玉米液化醪液和流出種子液至30L發(fā)酵罐中，其中，連續(xù)擴培的培養(yǎng)條件包括：溫度為29℃，pH值為5.3，通氣量為0.12VVM。經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.0億/ml，酵母出芽率約為35％，死亡率約為0.02％。
(4)在裝有18L木質(zhì)纖維素的酶解液的30L發(fā)酵罐中，利用流入的擴培的酵母菌進行發(fā)酵，其中，發(fā)酵的條件包括：在發(fā)酵的前24h內(nèi)通入空氣，通氣量為0.05VVM，溫度為29℃，pH為5.3，攪拌槳的轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵48小時結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液的體積為19.1L。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為63.6g/L，木糖含量為3.47g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為91.52％，木糖消耗率為89.16％。
實施例3
(1)制備玉米液化醪液：以2.5kg玉米為原料，進行粉碎，然后在75℃、pH值為4.8的條件下水熱處理3.2h，再進行過濾，得到10L玉米液化醪濾液，然后以粉碎的玉米原料的重量(2.5kg)為基準，向玉米液化醪濾液中加入0.3重量‰的液化酶進行液化處理，液化處理的條件包括：溫度為105℃、pH值為5.5，時間為1h。最后以液化處理得到的產(chǎn)物的體積為基準，向液化處理得到的產(chǎn)物中加入0.3g/L的磷酸二氫鉀和0.8g/L尿素，混合均勻，得到10L玉米液化醪液，經(jīng)測定，玉米液化醪液的DE值為66。
(2)無菌條件下，先在10L種子罐中加入3.6L玉米液化醪液，然后以6體積％的接種量將活化的酵母菌液接種至種子罐中進行培養(yǎng)，將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為1.95億/ml時(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為35.6％，死亡率為0)，在6h內(nèi)以流加方式向種子罐中加入添加有糖化酶的2.4L玉米液化醪液(相對于制備6L玉米液化醪液用的玉米原料的重量，糖化酶的加入量為0.3重量‰)，進行培養(yǎng)，待將種子液中酵母數(shù)培養(yǎng)為2.0億/ml時停止培養(yǎng)(經(jīng)檢測，此時酵母出芽率為34％，死亡率為0)，此時種子罐中種子液的體積為6L。
其中，步驟(2)中，所有的培養(yǎng)條件包括：溫度為28℃，通氣量為0.15VVM，用氨水將pH調(diào)節(jié)為5.7。
(3)在間歇培養(yǎng)結(jié)束進行連續(xù)擴培，包括：在間歇培養(yǎng)結(jié)束后的種子罐中以2.4L/h的體積流量同時流入新鮮的玉米液化醪液和流出種子液至30L發(fā)酵罐中，其中，連續(xù)擴培的培養(yǎng)條件包括：溫度為28℃，pH值為5.7，通氣量為0.15VVM。經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.1億/ml，酵母出芽率約為33％，死亡率約為0.025％。
(4)在裝有18L木質(zhì)纖維素的酶解液的30L發(fā)酵罐中，利用流入的擴培的酵母菌進行發(fā)酵，其中，發(fā)酵的條件包括：在發(fā)酵的前24h內(nèi)通入空氣，通氣量為0.02VVM，溫度為28℃，pH為5.7，攪拌槳的轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵54小時結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液的體積為20.1L。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為62.7g/L，木糖含量為3.6g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為90.22％，木糖消耗率為88.75％。
實施例4
按照實施例1的方法，不同的是，步驟(3)中，在間歇培養(yǎng)結(jié)束后的種子罐中以0.6L/h的體積流量同時流入新鮮的玉米液化醪液和流出種子液至30L發(fā)酵罐中。經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.1億/ml，酵母出芽率約為32％，死亡率約為0.06％。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為61.2g/L，木糖含量為4.7g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為88.06％，木糖消耗率為85.31％。
實施例5
按照實施例1的方法，不同的是，步驟(3)中，在間歇培養(yǎng)結(jié)束后的種子罐中3.6L/h的體積流量同時流入新鮮的玉米液化醪液和流出種子液至30L發(fā)酵罐中。經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為1.8億/ml，酵母出芽率約為30％，死亡率約為0.08％。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為57.31/L，木糖含量為6.15g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為82.46％，木糖消耗率為80.78％。
實施例6
按照實施例1的方法，不同的是，步驟(1)中，得到玉米液化醪濾液后，并不加入液化酶，而是以玉米液化醪濾液的體積為基準，向玉米液化醪 濾液中加入0.5g/L的磷酸二氫鉀和0.5g/L尿素。經(jīng)測定，玉米液化醪液的DE值為48。
步驟(2)中經(jīng)先后兩次檢測，酵母出芽率分別為35.2％和33.4％，死亡率分別為0％和0.01％。步驟(3)中經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.0億/ml，酵母出芽率約為33％，死亡率約為0.03％。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為60.28g/L，木糖含量為5.22g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為86.74％，木糖消耗率為83.69％。
實施例7
按照實施例1的方法，不同的是，步驟(2)中，在6h內(nèi)以流加方式向種子罐中加入的3L玉米液化醪液中不含有糖化酶。
步驟(2)中間歇擴培最終得到的培養(yǎng)液中，酵母出芽率為30.8％，死亡率為0.05％。步驟(3)中經(jīng)檢測，在整個連續(xù)擴培過程中，流加至發(fā)酵罐中的種子液中酵母數(shù)約為2.0億/ml，酵母出芽率約為31％，死亡率約為0.06％。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為59.6g/L，木糖含量為5.6g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為85.76％，木糖消耗率為82.5％。
實施例8
按照實施例1的方法，不同的是，步驟(4)中，在發(fā)酵的前24h內(nèi)不通入空氣，整個發(fā)酵過程為厭氧發(fā)酵。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為61.4g/L，木糖含量為4.7g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為88.35％，木糖消耗率為85.31％。
對比例1
按照實施例1的方法，不同的是，不進行步驟(3)，在步驟(4)中，直接將等量的步驟(2)得到的種子液加入到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。
通過實施例1中所述的液相色譜儀對發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液、發(fā)酵液中的產(chǎn)物和副產(chǎn)物進行分析。檢測結(jié)果為：發(fā)酵原料木質(zhì)纖維素的酶解液中木糖含量為32g/L，葡萄糖含量為104g/L，乙醇含量為0g/L；發(fā)酵液中乙醇含量為41.8g/L，木糖含量為15.3g/L，葡萄糖含量為0g/L。經(jīng)計算可知，糖醇轉(zhuǎn)化率為60.15％，木糖消耗率為52.19％。
將實施例1與對比例1的結(jié)果比較可知，利用本發(fā)明的擴培酵母菌的方法得到的酵母菌進行發(fā)酵，能夠明顯提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
將實施例1與實施例4-5的結(jié)果比較可知，在擴培酵母菌時，間歇擴培結(jié)束后，以(0.2-0.4)V/h(V為間歇擴培結(jié)束時得到的培養(yǎng)液的體積)的體積流量同時流入液化醪液和流出培養(yǎng)液，利用由此得到的擴培酵母菌進行發(fā)酵，能夠進一步提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
將實施例1與實施例6的結(jié)果比較可知，在擴培酵母菌時，在制備液化醪液時，通過加入液化酶進行液化處理，利用由此得到的擴培酵母菌進行發(fā)酵，能夠進一步提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
將實施例1與實施例7的結(jié)果比較可知，在擴培酵母菌時，在加入剩余體積的液化醪液時，若剩余體積的液化醪液中含有糖化酶，利用由此得到的擴培酵母菌進行發(fā)酵，能夠進一步提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
將實施例1與實施例8的結(jié)果比較可知，在發(fā)酵的前24h內(nèi)通入一定通氣量的空氣，能夠進一步提高發(fā)酵時的糖醇轉(zhuǎn)化率和木糖消耗率。
以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。
另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。