專利名稱：適于檢測德克氏酵母屬和酒香酵母屬的培養(yǎng)基的制作方法
發(fā)明目的本發(fā)明涉及到一種培養(yǎng)基，在其制劑中含有乙醇和p-香豆酸，它適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的鑒別檢測和計數(shù)。采用所述的適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母鑒別檢測的方法也是本發(fā)明的目的。所述培養(yǎng)基在酵母鑒定法(gallery)中的用途還是本發(fā)明的一項目的。
本發(fā)明的目的在于提供食品和飲料工業(yè)一種培養(yǎng)基和使用所述培養(yǎng)基的方法，通過這種培養(yǎng)基和其中生長的菌落的顏色變化，以及特征的酚樣香味的產(chǎn)生，能夠分離、鑒別地檢測和計數(shù)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母。
背景技術(shù)：
目前在許多不同的聚集處(例如，飲料、食品、自然底物)的酵母微生物區(qū)系的研究和鑒定一般包括首先菌株分離階段和在普通酵母培養(yǎng)基的純化階段，接著是其次的鑒定階段，它采用經(jīng)典的分類學(xué)方法或分子生物學(xué)基礎(chǔ)的技術(shù)。德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的緩慢生長令其在常規(guī)使用的培養(yǎng)基中的分離極其困難，由于這些酵母已經(jīng)被與它們共存的更快生長的酵母掩蓋(overtake)。這樣的事實令它們的檢測和計數(shù)，以及它們以后在食品和飲料中的鑒定更困難，這種鑒定一般通過采用極慢的、工作深入的和專業(yè)技能要求高的經(jīng)典技術(shù)或者通過采用包括昂貴的反應(yīng)物、在市場上并不經(jīng)常迅速獲得的分子探針或引物和熟練操作者的分子生物學(xué)技術(shù)完成。
毫無疑問地確信這些酵母包含于酒-″horse sweat″-尤其是在櫟樹桶陳化的那些之中的嚴重感覺缺陷的產(chǎn)品內(nèi)是可能的。(Chatonnet等人，1992，J.Sc.Food Agric.，60.165-178)。其后，它們在酒中的檢測和計數(shù)是必需的，隨之出現(xiàn)發(fā)展適于那樣的檢測和計數(shù)的快速方法的需要。本領(lǐng)域參考書目公開了適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母檢測和計數(shù)的方法，它基于這些種的放線菌酮耐藥性和它們的酸化能力(Chatonnet等人，1992，J.Sc.Food Agric.，60，165-178；Fugelsang，K.等人，1993.Ed.Barry H.Gump.ACS Symposium series 536.American ChemicalSociety，華盛頓.Cap.7，110-119；Alguacil，M.等人，1998.Aliment.Equipos Tecnol，10，81-85).然而，這些已公開的培養(yǎng)基并不完全令人滿意，由于它們沒有充分的防止快速生長菌種生長的選擇性，而且不是完全鑒別的。
因此，對于適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的簡易和快速鑒定的培養(yǎng)基和方法存在真正的和實際的需要，即提供食品和飲料工業(yè)一種適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的快速分離、鑒別的檢測和計數(shù)方法。
發(fā)明介紹令人驚奇地發(fā)現(xiàn)采用含有乙醇和p-香豆酸的培養(yǎng)基適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母生長，與其它酵母相比，在培養(yǎng)5至12天之后，這些酵母以特征的和唯一形式產(chǎn)生4-乙苯酚和乙酸。此外，通常與德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母共存、更快生長從而防礙它們的檢測的其它種的酵母，被選擇性地抑制。
按照本發(fā)明，研發(fā)一種培養(yǎng)基，它對于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母是部分選擇性地和完全鑒別的，它基于通過其特征性香味的4-乙苯酚檢測，和借助于適當(dāng)?shù)乃?堿顏色變化的醋酸檢測，乙苯酚和醋酸由在含乙醇和p-香豆酸的培養(yǎng)基中生長的那些酵母產(chǎn)生。
因此，本發(fā)明涉及到適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的鑒別檢測和計數(shù)的培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基包括營養(yǎng)基，作為非發(fā)酵能源和抑制其它酵母種的乙醇，作為由所述酵母種產(chǎn)生的芳香化合物促進底物的p-香豆酸，變色點位于酸性范圍的酸-堿指示劑(特別是溴甲酚綠)，抑制幾個種酵母生長的抗生素(特別是放線菌酮)，以及瓊脂，當(dāng)這種培養(yǎng)基以固體形式使用時。
在一項實施方案中，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基中營養(yǎng)基是″YeastNitrogen Base″(酵母氮基)并且酸-堿指示劑是溴甲酚綠。
在另一項實施方案中，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基進一步含有細菌生長抑制劑，特別是氯霉素和/或土霉素，它對于包括種群的混合細菌之內(nèi)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測是特別地有效的。
本發(fā)明目的培養(yǎng)基，當(dāng)其為液體形式時，通過滅菌過濾制備，接著分散至足夠的試管中。預(yù)計培養(yǎng)基是固體形式時，瓊脂溶于軟化水中，接著在高壓滅菌器中滅菌；滅菌之后冷卻至大約50℃，無菌條件下加入以前已經(jīng)濾過滅菌過的其它的成分。在滅菌之前對兩種培養(yǎng)基進行pH調(diào)節(jié)，pH值取決于使用的酸-堿指示劑。勻化混合物，并傾入陪替氏培養(yǎng)皿，固化之后培養(yǎng)基備用。
本發(fā)明也涉及到德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和計數(shù)方法，采用部分選擇性和完全鑒別的培養(yǎng)基，特征如上。
按照本發(fā)明的方法允許以一種使用按照本發(fā)明的培養(yǎng)基的簡便方法，檢測和計數(shù)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母。
按照本發(fā)明，通過與分析樣品直接接觸使用培養(yǎng)基，如果有意于污染物酵母的計算，采用充分的稀釋物。如此接種的培養(yǎng)基接著在充分適于酵母生長的溫度下，在充分適于生長清楚可見菌落(固體培養(yǎng)基情形下)或者溶液混濁(液體培養(yǎng)基情形下)的時間期間內(nèi)培養(yǎng)，通常為5至10天。陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測通過直接觀測乳狀染色的菌落，通過按照使用類型的酸-堿指示劑的培養(yǎng)基顏色的變化，以及通過存在特征性的酚樣香味完成。如果延長培養(yǎng)時間，菌落獲得更深的染色。液體培養(yǎng)基內(nèi)的檢測通過培養(yǎng)基顏色的變化和酚樣香味的存在完成。
此外，任何微生物學(xué)實驗室制備培養(yǎng)基，它是方便、迅速和易重現(xiàn)的方法，無需采用新技術(shù)。一旦制成培養(yǎng)基，其由任何食品和飲料工業(yè)或質(zhì)量控制實驗室的使用是迅速的，由于它除了負責(zé)常規(guī)微生物學(xué)分析者之外并不需要專門的操作者。
因此，本發(fā)明目的之一在于提供食品工業(yè)一種方法，它通過特征的菌落產(chǎn)生、培養(yǎng)基顏色變化和酚樣香味的產(chǎn)生，可分離、鑒別檢測和計數(shù)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母，從而避免在它們分離之后所述的酵母鑒定的不便，如上所述，采用按照本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法實現(xiàn)目的。
因此，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基的用途允許a)食品和飲料工業(yè)中歸因于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的污染物的檢測和鑒定，在生產(chǎn)工藝的每一步，從原料至完成和貯藏的產(chǎn)品。
b)定義臨界檢測點，以便建立適合于食品和飲料工業(yè)內(nèi)每一種臨界檢測點的檢測標(biāo)準。
進一步地，按照本發(fā)明的培養(yǎng)基適用于包含于酵母鑒定法(galeries)。
本發(fā)明優(yōu)選的實施方案在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及到適用于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母鑒別檢測和計數(shù)的培養(yǎng)基，它包括作為營養(yǎng)基的″Yeast NitrogenBase″，作為非發(fā)酵能源的乙醇，作為芳香化合物(4-乙苯酚)促進底物的p-香豆酸，作為變色點位于酸性范圍的酸-堿指示劑的溴甲酚綠，抑制幾個種酵母生長的抗生素(放線菌酮)，以及細菌生長抑制劑抗生素。
在本發(fā)明的這種實施方案中，在培養(yǎng)基接種含有德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的樣品之后，它可以是先前分離的這些酵母的樣品，或者酵母和/或酵母和細菌的混合樣品，并且在有益于這些酵母屬生長的條件下接種，在大約5至12天之后，通過培養(yǎng)基顏色由藍至黃的變化，乳狀染色的菌落和特征的酚樣香味的產(chǎn)生，鑒定是可行的。
通過下列實施例進一步舉例說明本發(fā)明，它們僅僅意于例證本發(fā)明，決不限制本發(fā)明范圍。
實施例實施例1按照本發(fā)明的培養(yǎng)基的制備本發(fā)明目的培養(yǎng)基，可采用下列配方制備(g/L)Yeast NitrogenBase(6.7)，作為營養(yǎng)基；乙醇(48)，作為非發(fā)酵能源和作為一些酵母的抑制劑；p-香豆酸(0.1)，作為產(chǎn)生酚樣香味底物；溴甲酚綠(0.222)，預(yù)先溶于NaOH，作為酸-堿指示劑；放線菌酮(0.01)，作為一些酵母種的抑制劑抗生素；氯霉素(0.1)和/或土霉素(0.1)，作為細菌抑制劑抗生素；以及瓊脂(20)，作為膠凝劑。這種培養(yǎng)基如下滅菌瓊脂溶于70％的總共所需的水中，pH以強酸調(diào)節(jié)至5.4，所得的溶液在高壓滅菌器中于120℃滅菌20分鐘。其它的成分溶于剩余的軟化水中，以強酸調(diào)節(jié)pH至5.4，所得的溶液通過經(jīng)0.22μm孔徑的薄膜過濾滅菌。接著以上兩種溶液一起混合，當(dāng)瓊脂溶液達到50℃時。然后勻化培養(yǎng)基并分散入陪替氏培養(yǎng)皿，它在接種前固化。
實施例2
本發(fā)明目的培養(yǎng)基在酒中德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測中的用途在本實施例中，采用實施例1的培養(yǎng)基分析懷疑已經(jīng)變質(zhì)了的兩種酒。每種酒的20ml樣品在無菌條件下經(jīng)0.22μm孔徑的醋酸纖維素薄膜過濾。每個薄膜置于含有本發(fā)明培養(yǎng)基的陪替氏培養(yǎng)皿表面上并在25℃接種。3天之后，在一個皿內(nèi)觀察到菌落，伴隨著培養(yǎng)基顏色由藍至黃的變化；當(dāng)打開該皿時，未察覺酚樣香味的存在。3天之后，在另一皿中未發(fā)現(xiàn)菌落。9天之后，已觀察到菌落的皿保持同樣的特征。在另一皿中可以觀察到小的乳狀染色的菌落，由藍至黃的培養(yǎng)基顏色變化和特征的酚樣香味。采用經(jīng)典的鑒定方法，確認未顯示酚樣香味的皿中生長的菌落不屬于德克氏酵母屬和酒香酵母屬，而顯示酚樣香味的皿中的那些屬于這些屬。
實施例3本發(fā)明目的培養(yǎng)基在懷疑存在絲狀真菌的酒中酵母計數(shù)的用途這種情形下，當(dāng)可屏弊陪替氏培養(yǎng)皿表面的霉菌生長或抑制酵母菌落的產(chǎn)量時，采用最可信的數(shù)量計數(shù)技術(shù)，采用含液體培養(yǎng)基的試管。因此，在此培養(yǎng)基配方中不采用瓊脂，該培養(yǎng)基經(jīng)過濾徹底滅菌。在這種情況下，當(dāng)存在培養(yǎng)基混濁、由藍至黃的顏色改變，和存在酚樣香味時，發(fā)現(xiàn)存在德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母；因此，認為所有顯示這些特征的試管是陽性，所有其它的是陰性。
盡管基于其優(yōu)選的實施方案介紹本發(fā)明，在附加的權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)可能的變動和修正對于本領(lǐng)域的任何熟練技術(shù)人員是明顯的。
權(quán)利要求
1.一種適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母計數(shù)的鑒別培養(yǎng)基，其特征在于它包括一種營養(yǎng)基，乙醇，p-香豆酸，一種變色點位于酸性范圍的酸-堿指示劑，一種適于一些酵母種的抑制劑抗生素，以及選擇性地細菌生長抑制劑和瓊脂。
2.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于乙醇含量為32至96g/L，優(yōu)選48g/L。
3.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于p-香豆酸含量為0.05至1.0g/L，優(yōu)選0.1g/L。
4.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于營養(yǎng)基是″Yeast NitrogenBase″，含量為5至10g/L，優(yōu)選6.7g/L。
5.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于適于一些酵母種的抑制劑抗生素是放線菌酮，含量為0.004至0.1g/L，優(yōu)選0.01g/L。
6.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于pH指示劑是溴甲酚綠，含量大約為0.022g/L。
7.按照權(quán)利要求6的培養(yǎng)基，其特征在于以強酸調(diào)節(jié)這種培養(yǎng)基的pH至4.8和6.0之間，優(yōu)選5.4。
8.按照權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其特征在于它另外含有細菌生長抑制劑，優(yōu)選氯霉素和/或土霉素，含量大約為0.1g/L，以檢測含有混合種群的酵母和細菌的食品和飲料內(nèi)的德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母。
9.按照任何一項前述權(quán)利要求的培養(yǎng)基，其特征在于它含有除了瓊脂之外的所有成分，以檢測和鑒別含有混合種群的酵母、細菌尤其絲狀真菌的食品和飲料中的德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母。
10.一種適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母計數(shù)的鑒別培養(yǎng)基，其特征在于它具有以下成分5至10g/L，優(yōu)選6.7g/L的″Yeast Nitrogen Base″；0.004至0.1g/L，優(yōu)選0.01g/L的放線菌酮；0.05至1.0g/L，優(yōu)選0.1g/L的p-香豆酸；0.022g/L的溴甲酚綠，或另一種具有相同變色點的酸-堿指示劑；32至96g/L，優(yōu)選48g/L的乙醇；0.1g/L的氯霉素和/或0.1g/L的土霉素，和20g/L的瓊脂，以強酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至4.8和6.0之間，優(yōu)選5.4。
11.按照前述權(quán)利要求的一種適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母計數(shù)的鑒別培養(yǎng)基，其特征在于除了瓊脂在高壓滅菌器中滅菌之外，所有成分經(jīng)濾過滅菌；先前經(jīng)濾過滅菌的培養(yǎng)基所有的其它成分在無菌條件下向這種溶液的加入在瓊脂冷卻之后，其固化之前；并且分配這種培養(yǎng)基至陪替氏培養(yǎng)皿以便其固化。
12.一種適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和/或鑒定的方法，其特征在于通過采用適于食品和飲料污染物德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母計數(shù)的鑒別培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括營養(yǎng)基，非發(fā)酵能源，p-香豆酸，一種變色點位于酸性范圍的酸-堿指示劑，一種適于一些酵母種的抑制劑抗生素，以及選擇性地細菌生長抑制劑和瓊脂。
13.按照權(quán)利要求12的一種適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和/或鑒定的方法，其特征在于酸-堿指示劑是溴甲酚綠，并且在以含有德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的樣品接種所述的培養(yǎng)基之后，在充分適于所述酵母生長的條件下培養(yǎng)5至12天，根據(jù)德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的特征，培養(yǎng)基顏色由藍色至黃色的變化，和乳狀染色菌落的生長和酚樣香氣，檢測它們的存在，以及需要時計數(shù)所述的酵母屬是可行的。
14.按照權(quán)利要求12和13的一種適于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和/或鑒定的方法，其特征在于它應(yīng)用于食品和飲料產(chǎn)品樣品中的德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和計數(shù)。
15.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基加其它酵母鑒定試驗包含于酵母鑒定法的用途。
16.按照權(quán)利要求1至11的培養(yǎng)基在工業(yè)，尤其在食品和飲料工業(yè)質(zhì)量和工藝控制中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種適于屬于德克氏酵母屬和酒香酵母屬的酵母的檢測和計數(shù)的普通的培養(yǎng)基,以及采用所述培養(yǎng)基的適于所述酵母的檢測和計數(shù)方法。按照本發(fā)明,該方法包括加入堿性酵母培養(yǎng)基,非發(fā)酵的能源,尤其是乙醇,p－香豆酸,作為芳香化合物促進底物,專門由所述的酵母屬產(chǎn)生,酸－堿指示劑,尤其是溴甲酚綠,酵母生長抑制劑抗生素,尤其是放線菌酮,以及細菌生長抑制抗生素,尤其是氯霉素和/或土霉素。當(dāng)?shù)驴耸辖湍笇俸途葡憬湍笇俳湍冈谒雠囵B(yǎng)基中培養(yǎng)時,生長的菌落顯示特征的顏色,歸因于pH的下降,培養(yǎng)基的顏色按照可再現(xiàn)的模式改變,并且產(chǎn)生特征的酚樣香味,在培養(yǎng)一些天之后通過嗅覺易檢測,這些使它們的檢測和計數(shù)成為可能。本發(fā)明可用于食品和飲料工業(yè)中屬于德克氏酵母屬和酒香酵母屬酵母的檢測和計數(shù),允許其包含于酵母鑒定法。
文檔編號C12N1/16GK1367843SQ00810102
公開日2002年9月4日 申請日期2000年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月31日
發(fā)明者V·B·洛雷羅, M·貢薩爾維斯, N·羅德里格斯 申請人:農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)院, Stabvida生物科學(xué)調(diào)查與服務(wù)股份有限公司