專(zhuān)利名稱(chēng)：肝素結(jié)合蛋白在重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用編碼肝素結(jié)合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染可在厭氧條件下培養(yǎng)的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞后在所述細(xì)胞中生產(chǎn)肝素結(jié)合蛋白(HBP)的方法。本發(fā)明還涉及所述重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
背景技術(shù)：
由人源和豬源的外周血中性粒細(xì)胞分離的兩種密切相關(guān)蛋白的共價(jià)結(jié)構(gòu)最近已確定(參見(jiàn)H.Flodgaard等，1991，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)197535-547；J.Pohl等，1990，F(xiàn)EBS Lett.272200等)。這兩種蛋白與嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶有高度相似性，但通過(guò)選擇性將第195位的活性絲氨酸和第57位的活性組氨酸(胰凝乳蛋白酶編號(hào)(B.S.Hartley，1970，Phil.Trans.Roy.Soc.Series 25777 ff))突變后，其蛋白酶活性喪失。這兩種蛋白由于對(duì)肝素具有高親和性，分別命名為人肝素結(jié)合蛋白(hHBP)和豬肝素結(jié)合蛋白(pHBP)。Schafer等因發(fā)現(xiàn)所述蛋白具有抗微生物活性(W.M.Schafer等，1986，感染與免疫(Infect.Immun.)53651等)，故稱(chēng)之為陽(yáng)離子抗微生物蛋白(CAP37)。發(fā)現(xiàn)所述蛋白能調(diào)節(jié)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞功能，如趨化、存活力增強(qiáng)、和分化(參見(jiàn)Pereira，1995年的綜述(J.Leuk.Biol.57805-812)和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,458,874和5,484,885)，但關(guān)于能否抑制微生物對(duì)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的感染未見(jiàn)報(bào)道。
此外，HBP加入內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)還可介導(dǎo)所述細(xì)胞脫壁和收縮作用。HBP還可刺激單核細(xì)胞存活和血小板反應(yīng)蛋白的分泌(E.Ostergaard和H.Flodgaad，1992，J.Leukocyte Biol.51316等)。
已從嗜天青顆粒中分離現(xiàn)一種稱(chēng)為azurocidin的蛋白，其N(xiāo)末端頭20個(gè)氨基酸殘基與hHBP和CAP37的相應(yīng)殘基相同(J.E.Gabay等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 865610 ff；C.G.Wilde等，1990，J.Biol.Chem.2652038ff.)，關(guān)于其抗微生物特性已有報(bào)道(D.Campanelli等，1990，J.Clin.Invest.85904 ff.)。
hHBP在嗜中性粒細(xì)胞中的存在，以及當(dāng)所述粒細(xì)胞吞噬金黃色葡萄球菌(Staph.aureus)時(shí)釋放89％的CAP37(其等同于hHBP)(H.A.Pereira等，見(jiàn)上)的事實(shí)，都提示hHBP的功能很可能涉及炎癥的過(guò)程，因?yàn)樵谑戎行粤＜?xì)胞激活時(shí)hHBP明顯釋放。Pereira等，出處同上指出CAP37的功能是在炎癥部位特異地吸引單核細(xì)胞，并因此導(dǎo)致在炎癥的第二階段使單核細(xì)胞不斷聚集。Ostergaard和H.Flodgaad，出處同上指出除了對(duì)單核細(xì)胞的補(bǔ)充的重要性外，HBP可能在嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的外滲機(jī)制中起關(guān)鍵作用。
HBP的結(jié)構(gòu)見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,814,602和H.Flodgaad等，出處同上。HBP還被稱(chēng)為CAP37(見(jiàn)WO 91/00907，US 5,458,874和US5,484,885)以及azurocidin(C.G.Wilde等，J.Biol.Chem.265，1990，p2038)。
HBP曾由嗜中性粒細(xì)胞中分離(Flodgaard等，1991，Eur.J.Biochem.197535-547)，但產(chǎn)率很低。此外，HBP也已通過(guò)重組DNA方法在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生產(chǎn)(Rasmussen等，1996，F(xiàn)EBS Lett.390109-112)。
重組HBP(該文獻(xiàn)中稱(chēng)為CAP37)也已在人腎293細(xì)胞系中生產(chǎn)(R.Alberdi等，1997，F(xiàn)ASEB J.111915)。使用了RSV-PL4表達(dá)載體，該載體包含用于分泌的運(yùn)鐵蛋白信號(hào)肽，用于免疫親和純化的HPC4表位，用于G418篩選的Xa因子切割位點(diǎn)和新霉素抗性基因，有功能的肝素結(jié)合蛋白只能通過(guò)用牛的Xa因子在所述重組蛋白的Xa因子切割位點(diǎn)進(jìn)行體外切割，從而使該融合肽與重組肝素結(jié)合蛋白分離，而得到。
此外，重組HBP可在網(wǎng)狀白細(xì)胞(RBL)中產(chǎn)生(PCT/DK98/00275)，但獲得了具有不同糖基化程度的HBP不均一群體。
如果能以簡(jiǎn)單、但有效的方式以高產(chǎn)率產(chǎn)生肝素結(jié)合蛋白將較為有利。因此本發(fā)明的目的是獲得以簡(jiǎn)單、有效的方式高產(chǎn)量獲得成熟肝素結(jié)合蛋白。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及將編碼肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入可在厭氧條件下培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中而生產(chǎn)哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白的方法，包括(a)將編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入可在厭氧條件下培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(b)在能誘導(dǎo)所述HBP表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞；以及(c)從該培養(yǎng)液中收集HBP。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，在步驟(b)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)使用緩激肽B-2受體拮抗劑。
“肝素結(jié)合蛋白”(HBP)是(i)蛋白水解后失活；(ii)儲(chǔ)存于多形核白細(xì)胞的嗜苯胺藍(lán)顆粒內(nèi)；(iii)作為單核細(xì)胞的化學(xué)趨化物并任選具有分子量為27-31kD的糖基化形式的蛋白。其可以是人源或豬源。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生上述哺乳動(dòng)物HBP的方法，其包括(a)將編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入可在導(dǎo)入核酸后于厭氧條件下培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(b)選擇步驟a)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸的那些細(xì)胞；(c)在無(wú)血清并任選無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；以及(d)分離上述肝素結(jié)合蛋白。該方法進(jìn)一步包括純化上述HBP。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及重組哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，這種哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞在將編碼哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入后可在厭氧條件下培養(yǎng)，其包含為編碼肝素結(jié)合蛋白的核酸序列。
發(fā)明詳述肝素結(jié)合蛋白可由與下述核酸序列具有如瓊脂糖凝膠電泳所測(cè)定的至少80％，更優(yōu)選至少約90％，甚至更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約97％同一性的核酸序列編碼SEQ ID NO3(其編碼如SEQ ID NO1所示的成熟人HBP)，SEQ ID NO5(其編碼如SEQ ID NO6所示的人HBP，該蛋白包括信號(hào)序列和成熟蛋白的序列)，SEQ ID NO7(其編碼如SEQ IDNO8所示的人HBP，該蛋白包括信號(hào)序列、原序列和成熟蛋白的序列)或SEQ ID NO4(其編碼如SEQ ID NO2所示的豬HBP)，SEQ ID NO9(其編碼如SEQ ID NO10所示的豬HBP，該蛋白包括信號(hào)序列和成熟蛋白的序列)，SEQ ID NO11(其編碼如SEQ ID NO12所示的豬HBP，該蛋白包括信號(hào)序列、原序列和成熟蛋白的序列)。這些核酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或它們的任何組合。lle Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly ArgHis Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln SerGln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln SerArg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn AspLeu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu ProLeu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser GlyGly Arg 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NO12)兩個(gè)核酸序列之間的同一性程度可用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序如GCG程序包中的GAP軟件(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443-453)確定。本發(fā)明用于計(jì)算兩個(gè)核酸序列之間同一性的設(shè)定為GAP創(chuàng)建罰分5.0，GAP延伸罰分0.3。
對(duì)編碼HBP的核酸序列的修飾是合成與HBP基本類(lèi)似的多肽序列所必需。與HBP“基本類(lèi)似”是指HBP的非自然產(chǎn)生形式，這些多肽序列經(jīng)工程改良后可能不同于HBP天然來(lái)源分離的序列。例如，可通過(guò)如定點(diǎn)誘變來(lái)合成下述HBP變異體，其比活性、熱穩(wěn)定性、最佳pH值等方面有差異。可構(gòu)建類(lèi)似序列，如根據(jù)SEQ ID NO1或2中編碼HBP的部分，如其亞序列的核酸序列來(lái)構(gòu)建；和/或通過(guò)導(dǎo)入下述核苷酸取代來(lái)構(gòu)建，這種取代不使該核酸序列編碼的HBP的氨基酸序列發(fā)生改變，但其應(yīng)符合用于產(chǎn)生所述酶的宿主生物的密碼子使用特點(diǎn)；或通過(guò)導(dǎo)入能產(chǎn)生另一種氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建。對(duì)核苷酸取代的一般描述見(jiàn)Ford等，1991，ProteinExpression和Purification 295-107。
對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可在該分子的功能非關(guān)鍵區(qū)進(jìn)行所述取代并仍能產(chǎn)生活性多肽序列。由本發(fā)明分離的核酸序列編碼的多肽活性所必需，并因此優(yōu)選不被取代的氨基酸殘基可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變(參見(jiàn)Cunningham和Wells，1989，科學(xué)2441081-1085)來(lái)鑒定。在后一種技術(shù)中，可在分子中每一殘基處進(jìn)行突變，然后檢驗(yàn)所得突變分子的HBP活性，從而鑒定出對(duì)該分子的活性很關(guān)鍵的氨基酸殘基。
肝素結(jié)合蛋白也可由在低度至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NOS3，4，5，7，9或11所示核酸序列雜交的核酸序列編碼。將低度至高度嚴(yán)謹(jǐn)條件定義為在42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切并變性的鮭精DNA，和分別對(duì)應(yīng)于低、中、高嚴(yán)謹(jǐn)度的25％、35％、50％甲酰胺中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。載體物質(zhì)用2×SSC，0.2％SDS洗3次，每次30分鐘，洗滌溫度優(yōu)選至少50℃(極低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少55℃(低嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少60℃(中嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少65℃(中高嚴(yán)謹(jǐn)度)，甚至更優(yōu)選至少70℃(高嚴(yán)謹(jǐn)度)，更優(yōu)選至少75℃(極高嚴(yán)謹(jǐn)度)。
HBP的制備編碼HBP的核酸序列可用成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法合成，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，四面體通訊(Tetrahedron Letters)22，1981，pp1859-1869所述亞磷酰胺(phosphoamidite)法，或Matthes等，EMBO J.3，1984，pp801-805所述方法。根據(jù)亞磷酰胺法，寡核苷酸可在諸如DNA自動(dòng)合成儀中合成，純化，退火，連接并克隆至適當(dāng)載體。
對(duì)用于本發(fā)明方法中的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列進(jìn)行分離或克隆所用技術(shù)為領(lǐng)域內(nèi)已知，包括從基因組DNA中分離，從cDNA開(kāi)始制備，或兩者結(jié)合。從這種基因組DNA中克隆本發(fā)明的核酸序列可通過(guò)，如利用眾所周知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或?qū)Ρ磉_(dá)文庫(kù)進(jìn)行抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆化DNA片段來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如Innis等，1990，方法和應(yīng)用指南，Academic Press，new York。其它核酸擴(kuò)增技術(shù)如連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)也可采用。
然后可將所述核酸序列插入重組表達(dá)載體，該載體可以是通常能方便地接受重組DNA操作的任何載體。對(duì)載體的選擇通常取決于該載體所要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自我復(fù)制載體，即，以染色體外實(shí)體形式存在，但其復(fù)制與染色體復(fù)制不相關(guān)的一種載體，如質(zhì)粒?；蛘撸撦d體可以是，當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，能整合至該宿主細(xì)胞基因組并與整合的染色體一起復(fù)制的一種載體。
在該載體中，編碼HBP的核酸序列應(yīng)與適當(dāng)啟動(dòng)子序列可操作相連。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，其可來(lái)源于該宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白的編碼基因。用于指導(dǎo)編碼HBP的核酸序列在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子實(shí)例有SV40啟動(dòng)子(Subramani等，Mol.Cell Biol.1，1981，pp854-864)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子(Palmiter等，科學(xué)222，1983，pp809-814)或腺病毒2主要晚期啟動(dòng)子、Rous肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Boshart等，1981，Cell 41521-530)以及牛多瘤病毒啟動(dòng)子(BPV)。適于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用的啟動(dòng)子有多角體蛋白啟動(dòng)子(Vasuvedan等，F(xiàn)EBS Lett.311，1992，pp7-11)。
編碼HBP的核酸序列也可與適當(dāng)終止子序列，如人生長(zhǎng)激素終止子(Palmiter等，見(jiàn)上)可操作相連。
所述載體還可包括如多聚腺苷化信號(hào)(如來(lái)源于SV40或腺病毒5Elb區(qū)的信號(hào))、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列(如SV40增強(qiáng)子)和翻譯增強(qiáng)子序列(如編碼腺病毒VA RNA者)。
重組表達(dá)載體還可包括能使該載體在目標(biāo)宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列(當(dāng)宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí))有SV40或多瘤病毒的復(fù)制起始序列。
表達(dá)載體還可包括選擇性標(biāo)記，如一種基因，其產(chǎn)物可彌補(bǔ)宿主細(xì)胞中的缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或賦予對(duì)藥物，如新霉素、遺傳霉素、氨芐青霉素，或潮霉素抗性的基因。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生HBP的方法，其中將含有編碼成熟HBP的DNA(其以N末端延伸為先導(dǎo))的宿主細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，于允許HBP表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從該培養(yǎng)基中回收所得HBP，其為N末端延伸型HBP。
N末端延伸可以是約5-25個(gè)氨基酸殘基的一段序列，優(yōu)選約8-15個(gè)氨基酸殘基。N末端序列中氨基酸殘基的特征并不是關(guān)鍵的。優(yōu)選N末端延伸為具有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Asp(SEQ ID NO13)的HBP原肽或原肽Met-Thr-Arg-Leu-Thr-Val-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Gly-Leu-Leu-Ala-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp(SEQ ID NO14)。
為有利于成熟HBP的產(chǎn)生，通常優(yōu)選編碼N末端延伸型HBP的DNA序列包括編碼蛋白酶切割位點(diǎn)的DNA序列，所述位點(diǎn)位于編碼該N末端延伸的DNA序列與編碼成熟HBP的DNA序列之間。適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈钗稽c(diǎn)實(shí)例包括具有所述氨基酸序列的腸激酶切割位點(diǎn)或Xa因子切割位點(diǎn)。
或者，可將編碼信號(hào)序列和成熟HBP的核酸序列用上述方法插入載體。其結(jié)果是，HBP可以從培養(yǎng)基中分離。
用于分別連接編碼HBP或N末端延伸型HBP的核酸序列，啟動(dòng)子和終止子的方法，以及用于將它們插入含復(fù)制所必需信息的適當(dāng)載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見(jiàn)例如Sambrook等，見(jiàn)上)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞是可在用編碼哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白的核酸轉(zhuǎn)染后在厭氧條件下培養(yǎng)的細(xì)胞。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為被腺病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或衍生自胚細(xì)胞的細(xì)胞。如本文所限定，衍生自胚細(xì)胞的細(xì)胞是從胚細(xì)胞的原代培養(yǎng)物獲得的細(xì)胞或從胚細(xì)胞的原代培養(yǎng)物最初傳代的細(xì)胞系。所述被腺病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或衍生自胚細(xì)胞的細(xì)胞實(shí)例如人胚腎(HEK)細(xì)胞，由其HEK 293細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物以及使導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA序列表達(dá)的方法可參見(jiàn)如Kaufman和Sharp，1982，分子生物學(xué)雜志159601-621；Southern和Berg，1982，J.Mol.Appl.Genet，1327-341；Loyter等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79422-426；Wigler等，1978，Cell 14725；Corsaro和Pearson，1981，體細(xì)胞遺傳7603；Graham和van der Eb，1973，病毒學(xué)52456，F(xiàn)raley等，1980，JBC 22510431；Capecchi，1980，細(xì)胞22479；Wiberg等，1983，NAR 117287；Neumann等，1982，EMBO J.1841-845。昆蟲(chóng)細(xì)胞可優(yōu)選用如美國(guó)專(zhuān)利4,745,051所述的桿狀病毒轉(zhuǎn)染。
用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如含血清或不含血清的含適當(dāng)添加物的培養(yǎng)基，或適于培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。相應(yīng)培養(yǎng)基可從供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)或根據(jù)已公開(kāi)的配方(如在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)來(lái)制備。然后篩選細(xì)胞的抗生素抗性。隨后，對(duì)所選出的克隆進(jìn)一步用本領(lǐng)域已知的試驗(yàn)如趨化試驗(yàn)和單核細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)分析其HBP活性(例如參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,814,602)。
篩選出的克隆可進(jìn)一步在無(wú)血清并任選無(wú)蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此外可在有緩激肽B-2受體拮抗劑存在的情況下培養(yǎng)。實(shí)例包括但不限于緩激肽B-2受體抗體(見(jiàn)例如，Haasemann等，1991，免疫學(xué)雜志1473882-3992)或緩激肽受體基因的反義多核酸序列。
由所述細(xì)胞產(chǎn)生的HBP可用常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收，包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，利用鹽(如硫酸銨)沉淀上清或過(guò)濾物中的蛋白成分，用多種層析方法(如離子交換層析、親和層析)純化等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，N末端延伸型HBP在偶聯(lián)抑蛋白酶肽的瓊脂糖層析柱中純化。
如果HBP為N末端延伸型HBP，則在從培養(yǎng)基回收后，優(yōu)選用適當(dāng)?shù)鞍酌盖懈钤揘末端延伸型HBP，以便產(chǎn)生成熟(和有活性)的HBP。適當(dāng)酶的實(shí)例包括但不限于腸激酶和Xa因子。
實(shí)施例實(shí)施例1原HBP在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)用于構(gòu)建pSX556的方法如Rasmussen等，1996，F(xiàn)EBS Lett.390109-112所述。制備以下PCR引物MHJ 20875′-AAA AAG GAT CCA CCA TGA CCC GGC TGA CAG TCC TGG CCC TGCTGG CTG GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCG GCT CCA GCC CCC TTT TGG ACATCG TTG GCG GCC GGA AGG C-3′((SEQ ID NO15)MHJ 20895′-AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC CCC GGT CCC GGA TTG TTT AAAACG CCA TC-3′(SEQ ID NO16)MHJ 2087編碼了BamHI位點(diǎn)，人cDNA(Morgan，J.G.等，1991，J.Immun.，1473210-3214)的起始密碼子和前原部分，其后為該基因成熟部分的最初20個(gè)核苷酸。
MHJ 2089互補(bǔ)于上文引用的cDNA序列中HBP基因編碼部分的最后8個(gè)密碼子外加兩個(gè)密碼子。其末端為一個(gè)HindIII位點(diǎn)。
用以下方案進(jìn)行PCR3個(gè)循環(huán) 95℃60秒，50℃120秒，72℃120秒12個(gè)循環(huán) 95℃30秒，65℃60秒，72℃90秒將760bp的PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離，用BamHI和HindIII酶切，插入用此兩種酶切割的pSX221中。(pSX221是pUC19的衍生物(Yannisch-Perron，C.等，1985，基因(Gene)33103-119)。測(cè)序證實(shí)克隆的DNA，切下BamHI-HindIII酶切片段，分離，插入到pBlueBacIII(InvitrogenCorporation)以在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)。此片段包括HBP的完整編碼區(qū)，該區(qū)包括19個(gè)殘基的信號(hào)肽，7個(gè)氨基酸的前肽，222個(gè)氨基酸的成熟部分和3個(gè)氨基酸的C-末端延伸。得到的質(zhì)粒命名為pSX556。
為產(chǎn)生表達(dá)HBP的重組桿狀病毒，使用Introgen公司(San Diego，CA)的MAXBAC試劑盒，所有的操作按照其中的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)(版本1.5.5)進(jìn)行。簡(jiǎn)要地說(shuō)，用1μg og線性化AcMNPV DNA和3μg pSX556共轉(zhuǎn)染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9)昆蟲(chóng)細(xì)胞(60mm培養(yǎng)皿中2×106個(gè)細(xì)胞)。7天后收獲培養(yǎng)上清。用不同稀釋度的病毒上清感染100mm平板中SF9細(xì)胞的新鮮單層細(xì)胞，然后用含有150μg/ml X-gal的TNM-FH完全培養(yǎng)基(1.5％瓊脂糖)覆蓋。8天后，將6個(gè)表現(xiàn)出藍(lán)色環(huán)的噬斑假定為重組噬斑，并用于感染6孔板上的SF9細(xì)胞。5天后，純化相應(yīng)的病毒DNA，并采用對(duì)應(yīng)于病毒DNA重組位點(diǎn)兩側(cè)的正向和反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。在瓊脂糖凝膠上鑒定PCR產(chǎn)物后，對(duì)相應(yīng)的最純的重組病毒進(jìn)行又一輪的噬斑純化以確保最終的重組病毒原種不含有野生型病毒。在無(wú)血清SF900-II培養(yǎng)基(Gibco BRL/Life-Technologies)中生長(zhǎng)的昆蟲(chóng)細(xì)胞(SF9和SF21)中進(jìn)行重組HBP的生產(chǎn)。通常，以MOI為1的病毒感染5L旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物或10L發(fā)酵培養(yǎng)物(細(xì)胞密度均為1×106/ml)，感染三天后收獲培養(yǎng)基。按照美國(guó)專(zhuān)利5814602所述純化HBP。
在SDS-PAGE上檢驗(yàn)用重組桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞所得的HBP。此HBP分子量稍大于純化自人血的天然HBP。當(dāng)確定了N-末端序列后發(fā)現(xiàn)，幾乎100％的產(chǎn)物在成熟部分的前部包含7個(gè)氨基酸的前肽，這表明所述昆蟲(chóng)細(xì)胞不能以與人骨髓中髓樣嗜中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞同樣的方式對(duì)型(pro-HBP)進(jìn)行加工。
實(shí)施例2昆蟲(chóng)細(xì)胞中Δpro-HBP的表達(dá)制備一種寡肽接頭(見(jiàn)下面)，使其覆蓋HBP序列的前99bp(從BamHI到EagI)，該片段覆蓋信號(hào)肽和成熟HBP的頭4個(gè)氨基酸，但不包括覆蓋前區(qū)(從73到87)的部分，這一部分被替代為pSX556中的原始BamHI-Eagl以產(chǎn)生pSX559。
接頭由4個(gè)寡肽組成，它們成對(duì)地退火為下列的雙鏈MHJ2568/LWN57465′-GATCCACCATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC-3′(SEQ ID NO17)3′-GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC-5′(SEQ ID NO18)LWN5745/MHJ25665′-P-TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC-3′(SEQ ID NO19)3′-GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG-5′(SEQ ID NO20)用重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，表達(dá)的HBP依實(shí)施例1所述純化。在確定N-末端序列后，證實(shí)從Ile1開(kāi)始有90％已得到正確處理。其余10％從Arg5開(kāi)始作進(jìn)一步處理。
為對(duì)比pro-HBP和HBP的表達(dá)，進(jìn)行時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)。在感染后的開(kāi)始6天(減第5天)取培養(yǎng)基的每日等份樣品，在HBP-特異性ELISA中檢測(cè)。設(shè)最大pro-HBP產(chǎn)量(在第4天)的平均值(n＝3)為100％。發(fā)現(xiàn)HBP的表達(dá)效率比pro-HBP低2-3倍。在四天中得到了pro-HBP的最佳產(chǎn)量，而HBP的產(chǎn)量從第3到第4天幾乎保持不變。
重組HBP的電噴射質(zhì)譜學(xué)分析(ESMS)顯示分子量為27.237±3。225個(gè)氨基酸的HBP形式(成熟部分加上3個(gè)C-末端延伸的氨基酸)的計(jì)算值是24.268.6。由于HBP包含三個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)(Asn100，Asn114，Asn145)。這對(duì)應(yīng)于質(zhì)量為2.968的聚糖部分。它本身與兩個(gè)Man3-[Fuc]GlcNAc2單位和一個(gè)Man3GlcNAc2單位的理論值一致。
實(shí)施例3HEK293細(xì)胞中pro-HBP的表達(dá)采用下列步驟構(gòu)建轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的表達(dá)載體。首先，依實(shí)施例1所述方法構(gòu)建質(zhì)粒pSX556。
在使用pSX556為模板的PCR中采用下列引物PBRa 246 5′-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3′(SEQ ID NO21)PBRa 247(5′-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3′(SEQ ID NO22)依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(Stratagene)使用Pfu聚合酶。用BamHI酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物后，所得片段以正確的方向連接至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)，用BamHI線性化，得到pcDNA3-HBP。
采用下列步驟轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的前一天，將5×105HEK293細(xì)胞接種于10cmm培養(yǎng)皿中，該培養(yǎng)皿中有10ml DMEM+10％FCS+青霉素/鏈霉素。通過(guò)改進(jìn)的磷酸鈣方法(Chen和Okayama，1987，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Molecular and Cellular Biology)7；2745-2752)用20g pcDNA3-HBP轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在600g/ml遺傳霉素(Life Technologies)中篩選轉(zhuǎn)染體。原代(primary)轉(zhuǎn)染的群體長(zhǎng)滿后，用特異性HBP夾心-ELISA測(cè)定為HBP表達(dá)陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)近似于未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋方法再克隆所述轉(zhuǎn)染群，最佳克隆(1/E-11)在T-25燒瓶規(guī)?？梢援a(chǎn)生11.5gHBP/ml/天。特定地，在5×96孔板上接種300個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)源自一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆(亞克隆)的表達(dá)。
為檢定產(chǎn)生的HBP物質(zhì)，使克隆1/E-11在無(wú)血清單層培養(yǎng)物上生長(zhǎng)6天，每天更換培養(yǎng)基。通過(guò)對(duì)HPLC的面積積分測(cè)定HBP上清濃度為8mg/l(以桿狀病毒HBP為標(biāo)準(zhǔn))。用連接了抑酶肽的瓊脂糖進(jìn)行純化，用1M NaCl洗脫。所述一步純化得到由HPLC分析判斷的99％純度的樣品。當(dāng)N-末端序列確定后，顯示幾乎100％的產(chǎn)物在成熟部分的前部包含7個(gè)氨基酸的前肽，這指示HEK293細(xì)胞不能以人骨髓中髓樣嗜中性粒細(xì)胞前體細(xì)胞同樣的方式處理pro-型(pro-HBP)。如實(shí)施例1所述，當(dāng)HBP在桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，可得到同樣的觀察結(jié)果。經(jīng)MALDI測(cè)定Mr為31693，這樣所述聚糖部分分子量為6755。假設(shè)占有此質(zhì)量的所有3個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)能對(duì)應(yīng)于三個(gè)二-唾液酸化、半乳糖基化雙觸角結(jié)構(gòu)，則還存在其它多種天然可能性，但是，在所有的情況下，HEK293細(xì)胞中的HBP似乎具有復(fù)合型天然N-連接的寡糖。
實(shí)施例4HBP在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)下列步驟用于構(gòu)建轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞的表達(dá)載體。首先，按照實(shí)施例2所述方法構(gòu)建質(zhì)粒pSX559。
以pSX559為模板，用Pfu聚合酶(Stratagene)按照生產(chǎn)商指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中使用引物PBRa 246 5′-CCGGGGATCCAACTAGGCTGGCCCCGGTCCCGG-3′(SEQ ID NO21)PBRa 247(5′-CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGG-3′(SEQ ID NO22)在BamHI酶切PCR反應(yīng)產(chǎn)物之后，所得片段以正確的方向連接至哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3(Invitrogen)，BamHI線性化，得到pcDNA3-HBPΔpro。
將pcDNA3-HBPΔpro轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，用HBP-ELISA測(cè)定長(zhǎng)滿的轉(zhuǎn)染群體為HBP表達(dá)陽(yáng)性。用以下方法轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的前一天，將5×105HEK293細(xì)胞接種于10cm培養(yǎng)皿中，該皿中有10mlDMEM+10％ FCS+青霉素/鏈霉素。通過(guò)改進(jìn)的磷酸鈣方法(Chen和Okayama，1987，分子和細(xì)胞生物學(xué)7；2745-2752)將20g pcDNA3-HBPΔpro轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。在600g/ml遺傳霉素(Life Technologies)中篩選轉(zhuǎn)染體。用特異性HBP夾心-ELISA測(cè)定原代轉(zhuǎn)染群體為HBP表達(dá)陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)近似于未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。通過(guò)有限稀釋方法亞克隆該轉(zhuǎn)染群。特定地，在5個(gè)96孔板上接種300個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)源自一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆(亞克隆)的表達(dá)。通過(guò)有限稀釋方法分離得到一個(gè)最佳克隆3/E-4(3.25gHBP/ml/天)。
為檢定產(chǎn)生的HBP，使克隆3/E-4在無(wú)血清單層培養(yǎng)物上生長(zhǎng)，每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用Sartorius濾器過(guò)濾，如前所述在CM-Sepharose快速流動(dòng)柱上純化。分離得到0.2mg純HBP。借助小規(guī)模制備型HPLC進(jìn)一步純化10μg用于N-末端測(cè)序和質(zhì)量測(cè)定。95％的純化HBP具有正確的N-末端序列(IVGGRKARPRQFPFL，SEQ ID NO23)，但是其余的5％顯示為始于第5個(gè)氨基酸的截短形式(RKARPRQFPFLASIQN，SEQ ID NO24)，此N-末端截短形式與實(shí)施例1所述桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞HBP中發(fā)現(xiàn)的一致。MALDI(矩陣輔助的激光解吸電離(matrix assisted laser desorptionionization))和ESMS(電噴射質(zhì)譜)質(zhì)量檢測(cè)都得到寬峰，其平均質(zhì)量(Mw)為30550。這使聚糖部分質(zhì)量約為6300。
實(shí)施例5HEK293產(chǎn)生的成熟HBP的生物學(xué)活性為對(duì)比HEK293產(chǎn)生的成熟HBP和由昆蟲(chóng)細(xì)胞得到的成熟HBP的生物學(xué)活性，用單核細(xì)胞/IL6試驗(yàn)測(cè)定這兩種重組型式人單核細(xì)胞分離自正常血液的血沉棕黃層。在24孔板上，每孔2×105細(xì)胞接種在1ml的DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有2mM Glutamax，1％非必需氨基酸，1mg/ml BSA。如表1所示加入LPS(來(lái)自大腸桿菌，Sigma)和重組HBP。37℃(5％CO2)孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞上清，離心澄清，-20℃儲(chǔ)存以備分析它們的IL-6含量。借助Biotrek ELISA系統(tǒng)(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行II-6鑒定。
如表1所示，由于昆蟲(chóng)-HBP量的增加使LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放增加。但是，在只有2g HEK293-HBP存在下，LPS誘導(dǎo)的IL-6釋放幾乎與10g昆蟲(chóng)-HBP存在下的相同。這表明HEK293成熟HBP的比活性比得自昆蟲(chóng)的成熟HBP的比活性高約5倍。這種比活性的增長(zhǎng)最有可能是因?yàn)椴溉閯?dòng)物HEK293細(xì)胞進(jìn)行的更復(fù)雜型N-連接糖基化方式。
表1
實(shí)施例6在產(chǎn)生HBP的HEK293細(xì)胞系中葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生為檢測(cè)產(chǎn)生HBP的HEK293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體的代謝如何受HBP產(chǎn)物自身的影響，使用KODAK EKTACHEM DT 60II設(shè)備測(cè)定在3種不同HEK293細(xì)胞系中葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生1)HEK293細(xì)胞系(對(duì)照)；2)1/C-6(克隆，以實(shí)施例3中1/E-11完全同樣的方式產(chǎn)生，它可產(chǎn)生pro-HBP；3)3/E-4(克隆，實(shí)施例4所述，它可產(chǎn)生成熟HBP)。用到兩種培養(yǎng)基含4500mg/l葡萄糖(Life Technologies)和10％FCS的Dulbecco改良型Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，無(wú)蛋白的合成培養(yǎng)基。
結(jié)果如表II所示表II葡萄糖(mg/l) 乳酸(mg/l)新鮮DMEM培養(yǎng)基 3690 153培養(yǎng)20小時(shí)后HEK 293 2358 12151/C-61836 16203/E-41296 1935新鮮的無(wú)蛋白培養(yǎng)基 415863培養(yǎng)4小時(shí)后HEK 293 38884501/C-636545403/E-43258855培養(yǎng)18小時(shí)后HEK 293 244814401/C-63/E-419261305如表II所示，生產(chǎn)HBP的HEK293細(xì)胞系在兩種培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生都提高了。同樣可觀察到產(chǎn)生成熟HBP的3/E-4細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)基無(wú)蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)4小時(shí)后有最高的葡萄糖消耗和乳酸生產(chǎn)。在18小時(shí)后，3/E-4無(wú)蛋白培養(yǎng)基中乳酸濃度由于乳酸降解而為最低。
表2中結(jié)果顯示，當(dāng)HBP定位于生產(chǎn)HBP的HEK293細(xì)胞中的線粒體附近時(shí)，HBP以某種方式關(guān)閉氧依賴(lài)性線粒體ATP的產(chǎn)生。如此一來(lái)，ATP只通過(guò)厭氧糖酵解途徑產(chǎn)生，HEK293細(xì)胞由于是胚胎來(lái)源而可以發(fā)生這種作用。
實(shí)施例7pDC312-HBPΔpro的構(gòu)建下列步驟用于構(gòu)建pDC312-HBPΔpro。首先，通過(guò)實(shí)施例2所述步驟構(gòu)建質(zhì)粒pSX559。以pSX559作模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，所用引物為ViLi118 5′-CCGGGATCCTAGTCCCACCATGACCCGGCTGACA-3′(SEQ ID NO25)ViLi119 5′-GCGCGCGGCCGCCTAGGCTGGCCCCGG-3′(SEQ ID NO26)依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(Life Technologies)使用PfX聚合酶。產(chǎn)生的PCR片段用限制酶BamHI和NotI消化，經(jīng)凝膠純化，按正確的方向連接進(jìn)入也用BamHI和NotI消化的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pDC312(Immunex)，得到pDC312-HBPΔpro。
將pDC312-HBPΔpro轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞，長(zhǎng)滿的轉(zhuǎn)染群體經(jīng)HBP-ELISA檢驗(yàn)為HBP表達(dá)陽(yáng)性。用下述方法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染的前一天，將5×105HEK 293細(xì)胞接種于含有10ml DMEM+10％FCS+青霉素/鏈霉素的10cm培養(yǎng)皿中。通過(guò)改進(jìn)的磷酸鈣方法(Chen和Okayama，1987，分子和細(xì)胞生物學(xué)7；2745-2752)將20g pcDNA3-HBPΔpro轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞。在0.25M氨甲蝶呤(MTX)(Life Technologies)中篩選轉(zhuǎn)染體。鋪滿后，原代轉(zhuǎn)染群經(jīng)特異性HBP夾心-ELISA測(cè)定為HBP表達(dá)陽(yáng)性。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)與未轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞相似。該轉(zhuǎn)染群經(jīng)有限稀釋法而再克隆。具體為，將300個(gè)細(xì)胞接種在5個(gè)96孔板上，檢測(cè)源自一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞克隆(亞克隆)的表達(dá)。通過(guò)有限稀釋法分離得到一個(gè)最佳克隆3/E-4(9.4g HBP/ml/天)。
為鑒定產(chǎn)生的HBP，使克隆子3/E-4在無(wú)血清單層培養(yǎng)物上生長(zhǎng)，每天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基用Sartorius濾器過(guò)濾，如前所述在CM-Sepharose快速流動(dòng)柱上純化。分離得到0.2mg純HBP。取10μg用小規(guī)模制備型HPLC進(jìn)一步純化以備N(xiāo)-末端測(cè)序和質(zhì)量測(cè)定。95％的純化HBP具有正確的N-末端序列(IVGGRKARPRQFPFL，SEQ ID NO27)，但其余5％顯示為始于第5號(hào)氨基酸的截短形式(RKARPRQFPFLASIQN，SEQ ID NO28)，這種N-末端截短形式與實(shí)施例1所述桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞HBP中發(fā)現(xiàn)的一致。MALDI(矩陣輔助的激光解吸電離)和ESMS(電噴射質(zhì)譜)質(zhì)量檢測(cè)都得到平均質(zhì)量(MW)為30550的寬峰。這使聚糖部分的質(zhì)量約為6300。
實(shí)施例8中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)將293細(xì)胞(4.037×102)，HBP293 3/B-5#/0在Spinner瓶(Techne，Cambridge，UK)中培養(yǎng)，然后接種至自動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(AcuSyst Maximaizer，CELLEX Biosciences，Inc.，Minneapolis，USA)中的中空纖維管(兩個(gè)生物反應(yīng)器，10Kd截留分子量，1.5m2)的毛細(xì)管外部(EC)空間。該細(xì)胞系經(jīng)檢驗(yàn)不含支原體(GEN-PROBE，GEN-Probe Incorporated，San Diego，USA)。起始控制參數(shù)是溫度＝36.5℃；pH＝7.10；pO2＝120Hg/mm。添加了3.5mM谷氨酰胺(Life Technologies，Paisley，UK)的293 SFM II培養(yǎng)基(Life Technologies，Paisley，UK)連同其中所含溶解氣體一起，以250ml/min泵送(循環(huán)泵(Circulation pump))經(jīng)過(guò)纖維內(nèi)部，跨膜進(jìn)入EC空間。培養(yǎng)基流量(mediaflow)(培養(yǎng)基泵(media pump))為50ml/hr，培養(yǎng)一天后提高到100ml/hr，2-2008天(兩天，20小時(shí)，8分鐘)后到200ml/hr，3-1940天(3天，19小時(shí)，40分鐘)后到250ml/hr，4-2039天(4天，20小時(shí)，39分鐘)后到300ml/hr，8-2315天(8天，23小時(shí)，15分鐘)后到400ml/hr，19-1841天后到450ml/hr，22-0116天后到500ml/hr，24-1846天后到550ml/hr，24-1906天后到600ml/hr，30-2043天后到650ml/hr，33-0103天后到700ml/hr。從8-2259天后開(kāi)始，以2ml/hr在EC室中連續(xù)收獲和流加。34-2301天后過(guò)程完成，總共收獲1529ml。
用下述步驟從HEK293懸浮液中純化HBP。該懸浮液用1M NaOH調(diào)pH為8.5，隨后用GF/A濾器過(guò)濾。層析柱(SP 16/10)在30mM Tris pH8.5中以4ml/min的流速平衡。上柱，用平衡緩沖液洗柱。HBP用NaCl梯度洗脫。在約0.9M NaCl時(shí)洗出HBP。匯集并用C4分析柱定量。結(jié)果如表III。
表III
總共收集得到約400mg。HBP濃度為0.3-0.4g/l。所有這些批次在制備型純化和分析型HPLC上看起來(lái)都相似。還對(duì)第一批進(jìn)行了MS和序列分析。鑒定質(zhì)量為30.5kD，也發(fā)現(xiàn)有某些弱信號(hào)(dimmer)。序列與預(yù)期的HBP(15輪)相關(guān)。在SDS上，36kD處有一條深帶，在10-20kD還可見(jiàn)兩條淺帶。
在此所述并要求權(quán)利的發(fā)明不應(yīng)受在此公開(kāi)的具體實(shí)施方案的限制，因?yàn)檫@些實(shí)施方案旨在舉例說(shuō)明本發(fā)明的幾個(gè)方面。任何等效實(shí)施方案應(yīng)視為在本發(fā)明范圍之內(nèi)。事實(shí)上，除在此所示和所述之外，對(duì)本發(fā)明的各種改變都是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此前描述顯而易見(jiàn)。這些改變也應(yīng)視為在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
在此引用了多種參考文獻(xiàn)，它們的公開(kāi)內(nèi)容全文引入作為參考。
序列表<110>諾沃挪第克公司(NOVO NORDISK A/S)<120>肝素結(jié)合蛋白在重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)<130>5779-WO.JWKi<150>60/131，574<151>1999-04-29<150>PA 1999 00612<151>1999-05-06<160>26<170>適用于Windows 3.0的FastSEQ<210>1<211>225<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His20 25 30Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro35 40 45Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu50 55 60Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly65 70 75 80Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp85 90 95Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu100 105 110Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp115 120 125Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val130 135 140Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys145 150 155 160Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly165 170 175Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser180 185 190Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu195 200 205Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro210 215 220Ala225<210>2<211>221<212>PRT<213>Sus scrofa<400>2Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His20 25 30Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser35 40 45Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu50 55 60Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr65 70 75 80Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg85 90 95Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln100105 110Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Glu Ala Gly Trp115 120 125Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu130 135 140Asn Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile145 150 155 160Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr165 170 175Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg180 185 190Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe195 200 205Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro Ala210 215 220<210>3<211>678<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>3atcgttggcg gccggaaggc gaggccccgc cagttcccgt tcctggcctc cattcagaat 60caaggcaggc acttctgcgg gggtgccctg atccatgccc gcttcgtgat gaccgcggcc 120agctgcttcc aaagccagaa ccccggggtt agcaccgtgg tgctgggtgc ctatgacctg 180aggcggcggg agaggcagtc ccgccagacg ttttccatca gcagcatgag cgagaatggc 240tacgaccccc agcagaacct gaacgacctg atgctgcttc agctggaccg tgaggccaac 300ctcaccagca gcgtgacgat actgccactg cctctgcaga acgccacggt ggaagccggc 360accagatgcc aggtggccgg ctgggggagc cagcgcagtg gggggcgtct ctcccgtttt 420cccaggttcg tcaacgtgac tgtgaccccc gaggaccagt gtcgccccaa caacgtgtgc 480accggtgtgc tcacccgccg cggtggcatc tgcaatgggg acgggggcac ccccctcgtc 540tgcgagggcc tggcccacgg cgtggcctcc ttttccctgg ggccctgtgg ccgaggccct 600gacttcttca cccgagtggc gctcttccga gactggatcg atggcgtttt aaacaatccg 660ggaccggggc cagcctag 678<210>4<211>662<212>DNA<213>Sus scrofa<400>4attgtgggcg gcaggagggc ccagccgcag gagttcccgt ttctggcctc cattcagaaa 60caagggaggc ccttttgcgc cggagccctg gtccatcccc gcttcgtcct gacagcggcc 120agctgcttcc gtggcaagaa cagcggaagt gcctctgtgg tgctgggggc ctatgacctg 180aggcagcagg agcagtcccg gcagacattc tccatcagga gcatcagcca gaacggctat 240gaccccggca gaatctgaac gatgtgctgc tgctgcagct ggaccgtgag gccagactca 300cccccagtgt ggccctggta ccgctgcccc cgcagaatgc cacagtggaa gctggcacca 360actgccaagt tgcgggctgg gggacccagc ggcttaggag gcttttctcc cgcttcccaa 420gggtgctcaa tgtcaccgtg acctcaaacc cgtgtctccc cagagacatg tgcattggtg 480tcttcagccg ccggggccgc atcagccagg gagacagagg cacccccctc gtctgcaacg 540gcctggcgca gggcgtggcc tccttcctcc ggaggcgttt ccgcaggagc tccggcttct 600tcacccgcgt ggcgctcttc agaaattgga ttgattcagt tctcaacaac ccgccggcct 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Leu Leu Ala Ser1 5 10 15Ser Arg Ala Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro20 25 30Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala35 40 45Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser50 55 60Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg65 70 75 80Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser85 90 95Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu100 105 110Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro115 120 125Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val130 135 140Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro145 150 155 160Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn165 170 175Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly180 185 190Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala195 200 205Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg210 215 220Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly225 230 235 240Pro Gly Pro Ala<210>7<211>756<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>7atgacccggc tgacagtcct ggccctgctg gctggtctgc tggcgtcctc gagggccggc 60tccagccccc ttttggacat cgttggcggc cggaaggcga ggccccgcca gttcccgttc 120ctggcctcca ttcagaatca aggcaggcac ttctgcgggg gtgccctgat ccatgcccgc180ttcgtgatga ccgcggccag ctgcttccaa agccagaacc ccggggttag caccgtggtg240ctgggtgcct atgacctgag gcggcgggag aggcagtccc gccagacgtt ttccatcagc300agcatgagcg agaatggcta cgacccccag cagaacctga acgacctgat gctgcttcag360ctggaccgtg aggccaacct caccagcagc gtgacgatac tgccactgcc tctgcagaac420gccacggtgg aagccggcac cagatgccag gtggccggct gggggagcca gcgcagtggg480gggcgtctct cccgttttcc caggttcgtc aacgtgactg tgacccccga ggaccagtgt540cgccccaaca acgtgtgcac cggtgtgctc acccgccgcg gtggcatctg caatggggac600gggggcaccc ccctcgtctg cgagggcctg gcccacggcg tggcctcctt ttccctgggg660ccctgtggcc gaggccctga cttcttcacc cgagtggcgc tcttccgaga ctggatcgat720ggcgttttaa acaatccggg accggggcca gcctag 756<210>8<211>251<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser1 5 10 15Ser Arg Ala Gly Ser Ser Pro Leu Leu Asp Ile Val Gly Gly Arg Lys20 25 30Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn Gln Gly35 40 45Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His Ala Arg Phe Val Met Thr50 55 60Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro Gly Val Ser Thr Val Val65 70 75 80Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Gln Thr85 90 95Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Gln Gln Asn100 105 110Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Asn Leu Thr115 120 125Ser Ser Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu Gln Asn Ala Thr Val Glu130 135 140Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Ser Gln Arg Ser Gly145 150 155 160Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val Asn Val Thr Val Thr Pro165 170 175Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys Thr Gly Val Leu Thr Arg180 185 190Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly Thr Pro Leu Val Cys Glu195 200 205Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser Leu Gly Pro Cys Gly Arg210 215 220Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asp Trp Ile Asp225 230 235 240Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly Pro Gly Pro Ala
245 250<210>9<211>719<212>DNA<213>Sus scrofa<400>9atgccagcac tcagattcct ggccctgctg gccagcctgc tggcaacctc cagggttatt 60gtgggcggca ggagggccca gccgcaggag ttcccgtttc tggcctccat tcagaaacaa 120gggaggccct tttgcgccgg agccctggtc catccccgct tcgtcctgac agcggccagc 180tgcttccgtg gcaagaacag cggaagtgcc tctgtggtgc tgggggccta tgacctgagg 240cagcaggagc agtcccggca gacattctcc atcaggagca tcagccagaa cggctatgac 300cccggcagaa tctgaacgat gtgctgctgc tgcagctgga ccgtgaggcc agactcaccc 360ccagtgtggc cctggtaccg ctgcccccgc agaatgccac agtggaagct ggcaccaact 420gccaagttgc gggctggggg acccagcggc ttaggaggct tttctcccgc ttcccaaggg 480tgctcaatgt caccgtgacc tcaaacccgt gtctccccag agacatgtgc attggtgtct 540tcagccgccg gggccgcatc agccagggag acagaggcac ccccctcgtc tgcaacggcc 600tggcgcaggg cgtggcctcc ttcctccgga ggcgtttccg caggagctcc ggcttcttca 660cccgcgtggc gctcttcaga aattggattg attcagttct caacaacccg ccggcctga 7l9<210>10<211>239<212>PRT<213>Sus scrofa<400>10Met Pro Ala Leu Arg Phe Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Thr1 5 10 15Ser Arg Val Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro20 25 30Phe Leu Ala Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala35 40 45Leu Val His Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly50 55 60Lys Asn Ser Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg65 70 75 80Gln Gln Glu Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln85 90 95Asn Gly Tyr Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln100 105 110Leu Asp Arg Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu115 120 125Pro Pro Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala130 135 140Gly Trp Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg145 150 155 160Val Leu Asn Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met165 170 175Cys Ile Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg180 185 190Gly Thr Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe195 200 205Leu Arg Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala210 215 220Leu Phe Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro Ala225 230 235<210>11<211>741<212>DNA<213>Sus scrofa<400>11atgccagcac tcagattcct ggccctgctg gccagcctgc tggcaacctc cagggttggc 60ttggccaccc tggcagacat tgtgggcggc aggagggccc agccgcagga gttcccgttt120ctggcctcca ttcagaaaca agggaggccc ttttgcgccg gagccctggt ccatccccgc180ttcgtcctga cagcggccag ctgcttccgt ggcaagaaca gcggaagtgc ctctgtggtg240ctgggggcct atgacctgag gcagcaggag cagtcccggc agacattctc catcaggagc300atcagccaga acggctatga cccccggcag aatctgaacg atgtgctgct gctgcagctg360gaccgtgagg ccagactcac ccccagtgtg gccctggtac cgctgccccc gcagaatgcc420acagtggaag ctggcaccaa ctgccaagtt gcgggctggg ggacccagcg gcttaggagg480cttttctccc gcttcccaag ggtgctcaat gtcaccgtga cctcaaaccc gtgtctcccc540agagacatgt gcattggtgt cttcagccgc cggggccgca tcagccaggg agacagaggc600acccccctcg tctgcaacgg cctggcgcag ggcgtggcct ccttcctccg gaggcgtttc660cgcaggagct ccggcttctt cacccgcgtg gcgctcttca gaaattggat tgattcagtt720ctcaacaacc cgccggcctg a 741<210>12<211>246<212>PRT<213>Sus scrofa<400>12Met Pro Ala Leu Arg Phe Leu Ala Leu Leu Ala Ser Leu Leu Ala Thr1 5 10 15Ser Arg Val Gly Leu Ala Thr Leu Ala Asp Ile Val Gly Gly Arg Arg20 25 30Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Lys Gln Gly35 40 45Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His Pro Arg Phe Val Leu Thr50 55 60Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser Gly Ser Ala Ser Val Val65 70 75 80Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu Gln Ser Arg Gln Thr Phe85 90 95Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr Asp Pro Arg Gln Asn Leu100 105 110Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg Glu Ala Arg Leu Thr Pro115 120 125Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala130 135 140Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly Thr Gln Arg Leu Arg Arg145 150 155 160Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asn Val Thr Val Thr Ser Asn165 170 175Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly Val Phe Ser Arg Arg Gly180 185 190Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr Pro Leu Val Cys Asn Gly Leu195 200 205Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ser210 215 220Gly Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg Asn Trp Ile Asp Ser Val225 230 235 240Leu Asn Asn Pro Pro Ala245<210>13<211>6<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Gly Ser Ser Pro Leu Asp1 5<210>14<211>26<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser1 5 10 15Set Arg Ala Gly Ser Ser Pro Leu Leu Asp20 25<210>15<211>111<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>15aaaaaggatc caccatgacc cggctgacag tcctggccct gctggctggt ctgctggcgt 60cctcgagggc eggctccagc ccccttttgg acatcgttgg cggccggaag g 111<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>16aaaaaagctt cctaggctgg ccccggtccc ggattgttta aaacgccatc 50<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>17gatccaccat gacccggctg acagtcctgg ccc 33<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>18gtggtactgg gccgactgtc aggaccggga cgacc 35<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>19tgctggctgg tctgctggcg tcctcgaggg ccatcgttgg c 41<210>20<211>39<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>20gaccagacga ccgcaggagc tcccggtagc aaccgccgg 39<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>21ccggggatcc aactaggctg gccccggtcc cgg 33<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>22ccggggatcc gatgacccgg ctgacagtcc tgg 33<210>23<211>15<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu1 5 10 15<210>24<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala Ser Ile Gln Asn1 5 10 15<210>25
<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>25ccgggatcct agtcccacca tgacccggct gaca 34<210>26<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>pcr引物<400>26gcgcgcggcc gcctaggctg gccccgg 2權(quán)利要求
1.一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生肝素結(jié)合蛋白的方法，所述細(xì)胞在導(dǎo)入了編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸后可在厭養(yǎng)條件下培養(yǎng)，其中所述方法包括(a)將編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入上述細(xì)胞；(b)在能誘導(dǎo)所述HBP表達(dá)的條件下培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞；以及(c)從該培養(yǎng)液回收所述HBP。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白是人源或豬源HBP。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中回收自培養(yǎng)基的HBP具有與SEQ IDNO1或2，或其等位基因變體或天然變體的氨基酸序列至少約80％同一性的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將與SEQ ID NO3、4、5、7、9或11所示核酸序列；(ii)其互補(bǔ)鏈，或(iii)(a)或(b)的亞序列雜交的核酸序列導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中從培養(yǎng)基回收的HBP具有SEQ IDNO1或2所示氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將SEQ ID NO3、4、5、7、9或11所示核酸序列導(dǎo)入所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸序列編碼以信號(hào)序列為先導(dǎo)的成熟HBP。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)的細(xì)胞包括編碼肝素結(jié)合蛋白前序列和成熟的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列，其中編碼N末端延伸的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列包括編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的核酸序列，該位點(diǎn)位于編碼N末端延伸的核酸序列與編碼成熟的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列之間。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其還包括裂解N末端延伸的HBP以獲得成熟的HBP。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)的細(xì)胞含有編碼肝素結(jié)合蛋白信號(hào)序列，肝素結(jié)合前序列，成熟的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列以及編碼蛋白酶酶切位點(diǎn)的核酸序列，該位點(diǎn)位于編碼肝素結(jié)合蛋白前序列的核酸序列與編碼成熟的肝素結(jié)合蛋白的核酸序列之間。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其還包括裂解N末端延伸的HBP以獲得成熟的HBP。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中宿主細(xì)胞為腺病毒轉(zhuǎn)化型細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中宿主細(xì)胞為胚衍生的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中宿主細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中宿主細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括純化所述肝素結(jié)合蛋白。
17.產(chǎn)生所述哺乳動(dòng)物HBP的方法，其包括(a)將編碼HBP的核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，這些細(xì)胞可在導(dǎo)入了所述核酸后在厭氧條件下培養(yǎng)；(b)選擇包含編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸的步驟(a)的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞；(c)在無(wú)血清并任選無(wú)蛋白的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；(d)分離所述HBP。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其進(jìn)一步包括純化所述肝素結(jié)合蛋白。
19.一種重組哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其在導(dǎo)入了編碼哺乳動(dòng)物肝素結(jié)合蛋白的核酸后可在厭氧條件下培養(yǎng)，所述細(xì)胞包含編碼所述肝素結(jié)合蛋白的核酸序列。
20.如權(quán)利要求18所述的重組哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述核酸序列編碼人HBP。
21.如權(quán)利要求18所述的重組哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中所述核酸序列編碼以信號(hào)序列為先導(dǎo)的成熟HBP。
22.如權(quán)利要求18所述的重組哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，其中該重組宿主細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及將編碼肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入可在厭氧條件下培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中從而在該細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)肝素結(jié)合蛋白(HBP)的方法,該方法包括(a)將編碼肝素結(jié)合蛋白的核酸導(dǎo)入上述細(xì)胞;(b)在能誘導(dǎo)所述HBP表達(dá)的情況下培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞;以及(c)從該培養(yǎng)液回收所述HBP。本發(fā)明還涉及用于所述方法的重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1357007SQ00809227
公開(kāi)日2002年7月3日 申請(qǐng)日期2000年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月29日
發(fā)明者漢斯·J·弗洛德加爾德, 波爾·B·拉斯馬森, 索倫·比約恩, 伊凡·斯文德森 申請(qǐng)人:勒科泰克股份公司