專利名稱：羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及果實(shí)采后生防酵母的發(fā)酵培養(yǎng)的技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基及其用途。
背景技術(shù)：
利用拈抗酵母控制采后果實(shí)病害的生物防治技術(shù)是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外非常關(guān)注的新型采后病害控制方法之一。羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)是國(guó)內(nèi)外較廣泛研究的采后生物防治酵母菌株，其拈抗機(jī)理涉及營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)、與病原菌粘合、分泌β_1，3-葡聚糖酶、抗氧化脅迫、誘導(dǎo)果實(shí)抗性或抗性相關(guān)反應(yīng)、降解病原菌分泌的真菌毒素和降解果實(shí)與激發(fā)病原菌孢子萌發(fā)相關(guān)的揮發(fā)物等。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)ZL200510090063. 1， 一種酵母拈抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基)公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母的培養(yǎng)基配方， 該培養(yǎng)基的碳源選自檸檬酸、蘋(píng)果酸或/和葡萄糖；氮源選自大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨；無(wú)機(jī)養(yǎng)分選自MgS04、CaCl2或/和MgCl2中的一種或幾種沖國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00310115336. 4( —種生物拈抗菌及其應(yīng)用)公開(kāi)了一種利用羅倫隱球酵母和殺菌劑及氯化鈣等防治甜櫻桃、冬棗及蘋(píng)果果實(shí)病害的方法；中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?00810128441. 4( —種生物活性果蔬保鮮膜)公開(kāi)了一種利用羅倫隱球酵母和海藻酸鈉等保鮮蘋(píng)果和圣女果等果實(shí)的方法；中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)?zhí)?00910078858. 9 (葡萄果實(shí)采后病害或果粒脫落的防治方法及其專用防治劑)公開(kāi)一種利用羅倫隱球酵母和硼酸鹽等防治葡萄果實(shí)病害或脫粒的方法。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)ZL200510090065.0，酵母拈抗菌 C. laurentii的真空冷凍干燥制品及其制備方法)公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母冷凍干燥制品的制備方法；中國(guó)發(fā)明申請(qǐng)專利(申請(qǐng)?zhí)?00910079774. 7，一種隱球酵母屬菌膠囊劑及其制備方法)公開(kāi)了一種制備羅倫隱球酵母常溫保存的膠囊劑制備方法。但羅倫隱球酵母的液體培養(yǎng)基多為NYDB (nutrientyeast dextrose broth，營(yíng)養(yǎng)酵母葡萄糖液體培養(yǎng)基)等天然培養(yǎng)基，其化學(xué)組成不明確，不但批次之間的平行性較差， 而且不利于進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。目前NYDB是目前最主要、也是最常用的NYDB培養(yǎng)基；其主要由牛肉浸膏，酵母粉， 葡萄糖和水組成。其中牛肉浸膏，酵母粉作為氮源為天然物質(zhì)，實(shí)際為大量不同成分的混合體，其組分及含量在不同批次間會(huì)有一定差異，表現(xiàn)在不同氮源批次間PH會(huì)有一定差異 (PH值會(huì)在5 6之間波動(dòng))。中國(guó)發(fā)明專利(專利號(hào)ZL200510090063. 1，一種酵母拈抗菌的培養(yǎng)方法及其專用培養(yǎng)基)公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母的培養(yǎng)基配方中氮源仍為大豆蛋白胨、牛肉浸膏、肉蛋白胨或/和胰酶解蛋白胨等天然物質(zhì)。利用天然物質(zhì)的好處是由于成分多樣，對(duì)酵母培養(yǎng)比較有利(指收獲菌體數(shù)量而言)。但也由于是天然混合物質(zhì)，成分及濃度(含量)在不同廠家、不同批次間會(huì)有一定差異，給基于該培養(yǎng)基的理論研究會(huì)帶來(lái)一定負(fù)面的影響。例如，當(dāng)需要研究一種具體物質(zhì)對(duì)酵母培養(yǎng)及活性的影響時(shí)，會(huì)由于原有培養(yǎng)基中成分及含量的不確定給最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及判斷造成不利的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種適合羅倫隱球酵母發(fā)酵培養(yǎng)的組分明確、可重復(fù)驗(yàn)證的合成培養(yǎng)基配方，該培養(yǎng)基對(duì)酵母自身生長(zhǎng)和生防活力沒(méi)有顯著負(fù)面影響。其包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和微量元素、生長(zhǎng)因子種類和數(shù)量的優(yōu)化。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種羅倫隱球酵母的專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基由葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈣、氯化鈉、生物素、 L-天門(mén)冬氨酸、維生素B1和水組成，每IL培養(yǎng)基中含有葡萄糖10 20g，硫酸銨3 6g， 磷酸氫二鉀1. 5 3g，硫酸鎂1 6g，硫酸亞鐵0 0. 02g，硫酸錳0 0. Olg、硫酸鋅0 0. 02g、氯化鈣0 0. 5g/L、氯化鈉0 lg，生物素0. 4 0. 5mg，L-天門(mén)冬氨酸0. 2 0. 5mg， 維生素B1 0.2 lmg，其余為水，PH值3 8。作為本發(fā)明的羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基的改進(jìn)每IL所述專用培養(yǎng)基中含葡萄糖10g，硫酸銨5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂3g，硫酸鋅0. 005g，生物素0. 5mg，L_天門(mén)冬氨酸 0. 5mg和維生素B1 lmg,其余為水，PH值3 8 (較優(yōu)的PH值為6 8)。其制備方法為 將葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鋅和水事先采用常規(guī)的高壓滅菌(121°C，滅菌 20min)后備用，然后將生物素0. 5mg, L-天門(mén)冬氨酸0. 5mg和維生素B1 Img以及上述滅菌后的葡萄糖10g，硫酸銨5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂3g，硫酸鋅0. 005g相混合，并用上述滅菌后的水定容至1L。作為本發(fā)明的羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基的進(jìn)一步改進(jìn)羅倫隱球酵母為保藏號(hào)為 CGMCC NO. 3590 的羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基的用途將羅倫隱球酵母按照體積比為0. 2 4%接種量接入所述專用培養(yǎng)基后，在200rpm、25 條件下培養(yǎng)M 120小時(shí)。羅倫隱球酵母的保藏名稱為羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)ZJU 10， 保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2010年1月20日， 保藏號(hào)CGMCC NO. 3590。保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。該羅倫隱球酵母在申請(qǐng)?zhí)枮?01010152108. 4的專利中有明確告知。本發(fā)明提供的羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基由合成原料組成，具有組分明確、可重復(fù)驗(yàn)證等突出優(yōu)點(diǎn)，有利于研究羅倫隱球酵母代謝調(diào)節(jié)規(guī)律，從而對(duì)進(jìn)一步利用、開(kāi)發(fā)羅倫隱球酵母的拈抗活性、研制安全高效、環(huán)境友好的綠色生物保鮮劑等具有重要意義。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是不同培養(yǎng)基起始PH值對(duì)酵母生物量的影響。圖2是酵母在本發(fā)明提供的合成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式以下所用的NYDA培養(yǎng)基為牛肉浸膏8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，瓊脂20克，水定容至1000ml，常規(guī)高壓(121 ，30分鐘)滅菌。所用的NYDB種子培養(yǎng)基為牛肉浸膏Sg、 酵母粉5g、葡萄糖10g，水定容至1000ml，常規(guī)高壓(121 ，30分鐘)滅菌。
實(shí)施例11、羅倫隱球酵母菌種活化及種子液培養(yǎng)取出在4°C冰箱內(nèi)保存的羅倫隱球酵母CGMCC NO. 3590，用劃線接種的方法接種于 NYDA培養(yǎng)基中，在生化培養(yǎng)箱中活化4 后再在同樣條件下活化培養(yǎng)1次。從活化好的羅倫隱球酵母斜面上挑取少許菌體接種于含有50mL NYDB培養(yǎng)基的 250mL錐形瓶中，在的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，轉(zhuǎn)速200rpm。2、發(fā)酵培養(yǎng)基制備在250mL錐形瓶中按正交試驗(yàn)法L16 O15)加入各個(gè)培養(yǎng)基成分(見(jiàn)表1和表2，為每L中的重量g)，常規(guī)高壓滅菌(121°C，滅菌20min)后備用(生物素、L-天門(mén)冬氨酸和維生素Bl采取過(guò)濾滅菌后加入)，用水定容至50mL。3、羅倫隱球酵母的發(fā)酵培養(yǎng)和生物量測(cè)定在無(wú)菌條件下，吸取ImL種子液接種于250ml滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在的搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，轉(zhuǎn)速為200rpm。測(cè)定生物量時(shí)先以5000轉(zhuǎn)/分離心5min，棄去發(fā)酵上清液，然后用水清洗2次，最后在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定酵母懸浮液的吸光值。各個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為菌體培養(yǎng)液離心、稀釋相同倍數(shù)后在600nm波長(zhǎng)下所測(cè)的吸光值。4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果從表2可知，處理7的配方所獲得的酵母數(shù)量最大，此配方所含各個(gè)物質(zhì)成分為葡萄糖10g/L、硫酸銨6g/L、磷酸氫二鉀3g/L、硫酸鎂3g/L、硫酸亞鐵0. 01g/L、生物素0. 4mg/ L、L-天門(mén)冬氨酸0. ang/L、維生素B1 0. 2mg/ ；而硫酸錳、硫酸鋅、氯化鈉、氯化鈣均為0。從表2的極差可以看出葡萄糖、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸錳、 硫酸鋅、氯化鈉、維生素B1的極差大于0. 1，表明該試驗(yàn)條件下這些成份對(duì)羅倫隱球酵母生物量有較強(qiáng)的影響。而從表2的均值1、均值2可以看出，葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鋅、維生素B1的均值1大于均值2，表明該試驗(yàn)條件下低劑量的上述物質(zhì)對(duì)羅倫隱球酵母培養(yǎng)更有利；而硫酸銨、硫酸鎂、硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鈣、生物素、L-天門(mén)冬氨酸的均值2大于均值1，表明該試驗(yàn)條件下高劑量的上述物質(zhì)對(duì)羅倫隱球酵母培養(yǎng)更有利。綜合極差和均值結(jié)果，理論上以下成分的各個(gè)較佳使用濃度為葡萄糖10g/L，硫酸銨6g/L，硫酸鎂3g/L， 硫酸亞鐵0. 01g/L,氯化鈉0. 5g/L，氯化鈣0. 5g/L，生物素0. 4mg/L, L-天門(mén)冬氨酸0. 4mg/ L ；而磷酸氫二鉀、硫酸錳、硫酸鋅、維生素B1均為0。表1 L16 (215)正交試驗(yàn)表頭
權(quán)利要求
1.羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基，其特征是每IL所述專用培養(yǎng)基中含有葡萄糖10 20g、硫酸銨3 6g、磷酸氫二鉀1. 5 3g、硫酸鎂1 6g、硫酸亞鐵0 0. 02g、硫酸錳0 0. Olg、硫酸鋅0 0. 02g、氯化鈣0 0. 5g/L、氯化鈉0 lg、生物素0. 4 0. 5mg、L-天門(mén)冬氨酸0. 2 0. 5mg和維生素& 0.2 lmg，其余為水，pH值3 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基，其特征是每IL所述專用培養(yǎng)基中含葡萄糖10g，硫酸銨5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂3g，硫酸鋅0. 005g,生物素0. 5mg, L-天門(mén)冬氨酸0.5mg和維生素& lmg，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的羅倫隱球酵母的專用培養(yǎng)基，其特征是所述羅倫隱球酵母為保藏號(hào)為CGMCC NO. 3590的羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii) ZJU 10。
4.如權(quán)利要求1 3中任意一種羅倫隱球酵母的專用培養(yǎng)基的用途，其特征是將羅倫隱球酵母按照體積比為0. 2 4%接種量接入所述專用培養(yǎng)基后，在200rpm、25 28 V 條件下培養(yǎng)24 120小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種羅倫隱球酵母專用培養(yǎng)基，每1L專用培養(yǎng)基中含有葡萄糖10~20g、硫酸銨3~6g、磷酸氫二鉀1.5~3g、硫酸鎂1~6g、硫酸亞鐵0~0.02g、硫酸錳0~0.01g、硫酸鋅0~0.02g、氯化鈣0~0.5g/L、氯化鈉0~1g、生物素0.4~0.5mg、L-天門(mén)冬氨酸0.2~0.5mg和維生素B10.2~1mg，其余為水，pH值3~8。本發(fā)明還同時(shí)公開(kāi)了上述羅倫隱球酵母的專用培養(yǎng)基的用途將羅倫隱球酵母按照體積比為0.2~4%接種量接入專用培養(yǎng)基后，在200rpm、25~28℃條件下培養(yǎng)24~120小時(shí)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102199552SQ20111011249
公開(kāi)日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2011年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月2日
發(fā)明者余挺, 盧黃娉, 楊林, 藍(lán)天演, 鄭曉冬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)